空間單細(xì)胞蛋白組項(xiàng)目常見(jiàn)FAQ

2空間單細(xì)胞蛋白組項(xiàng)目常見(jiàn)FAQ1.空間單細(xì)胞蛋白組的局限性？相比bulk水平的蛋白組價(jià)格高，但是相對(duì)于單細(xì)胞檢測(cè)來(lái)說(shuō)不貴?？贵w有限（但是可以定制）。2.空間單細(xì)胞蛋白組石蠟切片抗體是否也可以測(cè)冰凍切片？不建議。有可能會(huì)做不出來(lái)，建議按照官網(wǎng)的推薦應(yīng)用來(lái)做。3.空單蛋有沒(méi)有抗體通量上限？如果抗體可以連barcode預(yù)實(shí)驗(yàn)成功，是否理論上抗體種類可以無(wú)限增加？目前文章中通常做30-40個(gè)左右抗體，美國(guó)做過(guò)100多種的。4.空單蛋做大鼠樣本有方法或者建議嗎？是否定制抗體就行。目前沒(méi)有對(duì)應(yīng)抗體，可以定制，但是成本太高，不建議，考慮用小。5.空單蛋和PBA目前可以接聯(lián)合分析嗎，進(jìn)行外泌體溯源供體細(xì)？目前不建議。6.PCF對(duì)照組的設(shè)計(jì)，一般怎么設(shè)計(jì)，常見(jiàn)的癌和癌旁，如果是單獨(dú)對(duì)照組的樣本，需要考慮切片位置問(wèn)題嗎？怎么考量？宏觀上切取的組織時(shí)根據(jù)是醫(yī)生病例上來(lái)決定的，分析的時(shí)候可以從“微觀”上選擇ROI即感興趣的區(qū)域，例如實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組都選擇中央靜脈區(qū)域選擇100um的區(qū)域進(jìn)行分析，或者某一個(gè)或者某一類特定類型的細(xì)胞周圍的100um的區(qū)域。7.PCF與IMC相比的優(yōu)勢(shì)有哪些？①成像面積。IMC一般選擇ROI為1mm2進(jìn)行檢測(cè)，PCF可以一次實(shí)現(xiàn)630mm2(18mm×35mm)全片成像。以60芯的組織芯片為例，IMC的費(fèi)用超過(guò)60萬(wàn)，而PCF的費(fèi)用低于10萬(wàn)。②檢測(cè)速度&效率。PCF一天可以掃描630mm2，IMC一般一天可測(cè)4-5mm2，檢測(cè)時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)對(duì)抗體穩(wěn)定性等產(chǎn)生影響，因此，當(dāng)關(guān)注面積比較大或者用組織芯片的時(shí)候PCF更具有優(yōu)勢(shì)。③PCF分辨率。雖然兩者都能達(dá)到單細(xì)胞水平，但PCF分辨率更高，IMC分辨率是1μm，PCF是0.25μm，對(duì)于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)及細(xì)胞間隙的識(shí)別，PCF優(yōu)勢(shì)更大。④成像真實(shí)性。IMC成像是每個(gè)點(diǎn)的組織被氣化后通過(guò)CyTOF的質(zhì)量檢測(cè)器分析，再根據(jù)獲得每一個(gè)點(diǎn)的質(zhì)譜信息重建組織圖像。而PCF是直接用顯微鏡對(duì)組織拍照獲得的真實(shí)圖像，即所見(jiàn)即所得。⑤檢測(cè)指標(biāo)數(shù)。IMC信號(hào)強(qiáng)度較高的通道40個(gè)左右，而且具有邊緣效應(yīng)，有些通道信號(hào)弱，對(duì)表達(dá)量低的蛋白檢測(cè)會(huì)受限制。因此當(dāng)指標(biāo)超過(guò)40個(gè)時(shí)，IMC的檢測(cè)質(zhì)量就會(huì)受影響，PCF采用3種高強(qiáng)度熒光替換的方式，針對(duì)人石蠟樣本可同步檢測(cè)100多個(gè)蛋白。⑥PCF體系更優(yōu)化，定制抗體更具優(yōu)勢(shì)。⑦IMC采用激光點(diǎn)陣消融法，每個(gè)點(diǎn)陣間存在細(xì)微的間隔，空單蛋使用高分辨率顯微鏡成像，不遺漏組織上的每一個(gè)區(qū)域。8.空間轉(zhuǎn)錄組與PCF空間單細(xì)胞蛋白組的區(qū)別?①檢測(cè)對(duì)象不同?？臻g轉(zhuǎn)錄組是對(duì)數(shù)千種mRNA在組織原位上的表達(dá)進(jìn)行分析，是從RNA層面定義細(xì)胞亞群，RNA反映的是調(diào)控過(guò)程，不是決定細(xì)胞的功能效應(yīng)因子，其變化不一定會(huì)同步體現(xiàn)在蛋白質(zhì)上。而蛋白質(zhì)是生物功能的最終體現(xiàn)者。因此定義細(xì)胞的種類和功能，蛋白質(zhì)層面的證據(jù)更為直接和準(zhǔn)確?？臻g單細(xì)胞蛋白組可對(duì)數(shù)百種蛋白質(zhì)在組織原位上的分布和表達(dá)進(jìn)行分析(單細(xì)胞水平)，是從蛋白水平定義細(xì)胞亞類和細(xì)胞功能狀態(tài)的有力工具。②分辨率。很多空間轉(zhuǎn)錄組(例如10x、DSP)達(dá)不到單細(xì)胞分辨率，PCF空間單細(xì)胞蛋白組分辨率為0.25um，能夠?qū)崿F(xiàn)真正意義的單細(xì)胞水平。③空單蛋更直接，如果研究目的就是分析重要的免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞或基質(zhì)細(xì)胞間的關(guān)系，利用空單蛋的檢測(cè)指標(biāo)可以精確的聚焦在這些細(xì)胞類型的分析中。④空單蛋可以無(wú)縫銜接空間轉(zhuǎn)錄組開(kāi)展多組學(xué)聯(lián)合分析。首先空單蛋發(fā)現(xiàn)感興趣的細(xì)胞互作特征區(qū)域，連續(xù)切片ROI圈選發(fā)現(xiàn)的特征區(qū)域開(kāi)展GeoMXDSP空間轉(zhuǎn)錄組，揭示特征區(qū)域中不同細(xì)胞類型的基因表達(dá)譜。其次空單蛋在單細(xì)胞分辨率下定義細(xì)胞表型，因此空間轉(zhuǎn)錄組可以聯(lián)合空單蛋對(duì)細(xì)胞進(jìn)行注釋。9.單細(xì)胞測(cè)序與CyTOF的區(qū)別?①檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量。單細(xì)胞技術(shù)是對(duì)3000-30000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)，由于檢測(cè)的細(xì)胞數(shù)量較少，不一定能夠反應(yīng)出復(fù)雜組織中的細(xì)胞占比，對(duì)于罕見(jiàn)細(xì)胞亞群的分辨率也不夠。如果再考慮人為取樣偏差和組織異質(zhì)性問(wèn)題，就會(huì)嚴(yán)重影響單細(xì)胞測(cè)序的數(shù)據(jù)可信度。CyTOF技術(shù)每次實(shí)驗(yàn)對(duì)多達(dá)100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，不僅細(xì)胞分型數(shù)據(jù)更為準(zhǔn)確，對(duì)于與占比較小的細(xì)胞亞群也能夠精確分析。②檢測(cè)對(duì)象。單細(xì)胞測(cè)序檢測(cè)的是RNA水平的，CyTOF檢測(cè)的是蛋白水平。RNA反映的是調(diào)控過(guò)程，不是決定細(xì)胞的功能效應(yīng)因子，其變化不一定會(huì)同步體現(xiàn)在蛋白質(zhì)上。而蛋白質(zhì)是生物功能的最終體現(xiàn)者。因此定義細(xì)胞的種類和功能，蛋白質(zhì)層面的證據(jù)更為直接和準(zhǔn)確。③單細(xì)胞測(cè)序一般需要蛋白層面的驗(yàn)證，例如免疫組化、流式、CyTOF等，從RNA層面有差異不一定在蛋白層面能驗(yàn)證出來(lái)。另外，單細(xì)胞測(cè)序篩選到的差異基因不一定能買的對(duì)應(yīng)的抗體。10.我們中心主要是再生障礙性貧血會(huì)進(jìn)行骨髓組織活檢，但是組織中脂肪細(xì)胞占比可能會(huì)非常高，在進(jìn)行蠟塊處理的過(guò)程中脂滴都被溶掉了，這樣作為標(biāo)本是否可用?一般不影響實(shí)驗(yàn)。這種樣本您自己做過(guò)免疫組化嗎，是否容易脫片，做免疫組化沒(méi)問(wèn)題的話PCF就能測(cè)，抗體濃度可能要高一些。11.我看PCF的技術(shù)好像主要是針對(duì)細(xì)胞表面抗原進(jìn)行錨定的，如果一個(gè)細(xì)胞有多個(gè)抗原希望檢測(cè)，是否會(huì)出現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)、沖突或者干擾?染色時(shí)我們采用循環(huán)染色的形式，每一輪最多檢測(cè)3個(gè)抗體，三個(gè)熒光通道均不同。另外，每一輪檢測(cè)的抗體也會(huì)有設(shè)計(jì)原則，如完全共定位的指標(biāo)不能放在同一個(gè)循環(huán)里相鄰的兩個(gè)通道，不能放在