空間單細胞蛋白組項目常見FAQ

2空間單細胞蛋白組項目常見FAQ1.空間單細胞蛋白組的局限性？相比bulk水平的蛋白組價格高，但是相對于單細胞檢測來說不貴?？贵w有限（但是可以定制）。2.空間單細胞蛋白組石蠟切片抗體是否也可以測冰凍切片？不建議。有可能會做不出來，建議按照官網(wǎng)的推薦應(yīng)用來做。3.空單蛋有沒有抗體通量上限？如果抗體可以連barcode預(yù)實驗成功，是否理論上抗體種類可以無限增加？目前文章中通常做30-40個左右抗體，美國做過100多種的。4.空單蛋做大鼠樣本有方法或者建議嗎？是否定制抗體就行。目前沒有對應(yīng)抗體，可以定制，但是成本太高，不建議，考慮用小。5.空單蛋和PBA目前可以接聯(lián)合分析嗎，進行外泌體溯源供體細？目前不建議。6.PCF對照組的設(shè)計，一般怎么設(shè)計，常見的癌和癌旁，如果是單獨對照組的樣本，需要考慮切片位置問題嗎？怎么考量？宏觀上切取的組織時根據(jù)是醫(yī)生病例上來決定的，分析的時候可以從“微觀”上選擇ROI即感興趣的區(qū)域，例如實驗組和對照組都選擇中央靜脈區(qū)域選擇100um的區(qū)域進行分析，或者某一個或者某一類特定類型的細胞周圍的100um的區(qū)域。7.PCF與IMC相比的優(yōu)勢有哪些？①成像面積。IMC一般選擇ROI為1mm2進行檢測，PCF可以一次實現(xiàn)630mm2(18mm×35mm)全片成像。以60芯的組織芯片為例，IMC的費用超過60萬，而PCF的費用低于10萬。②檢測速度&效率。PCF一天可以掃描630mm2，IMC一般一天可測4-5mm2，檢測時間太長會對抗體穩(wěn)定性等產(chǎn)生影響，因此，當(dāng)關(guān)注面積比較大或者用組織芯片的時候PCF更具有優(yōu)勢。③PCF分辨率。雖然兩者都能達到單細胞水平，但PCF分辨率更高，IMC分辨率是1μm，PCF是0.25μm，對于亞細胞結(jié)構(gòu)及細胞間隙的識別，PCF優(yōu)勢更大。④成像真實性。IMC成像是每個點的組織被氣化后通過CyTOF的質(zhì)量檢測器分析，再根據(jù)獲得每一個點的質(zhì)譜信息重建組織圖像。而PCF是直接用顯微鏡對組織拍照獲得的真實圖像，即所見即所得。⑤檢測指標(biāo)數(shù)。IMC信號強度較高的通道40個左右，而且具有邊緣效應(yīng)，有些通道信號弱，對表達量低的蛋白檢測會受限制。因此當(dāng)指標(biāo)超過40個時，IMC的檢測質(zhì)量就會受影響，PCF采用3種高強度熒光替換的方式，針對人石蠟樣本可同步檢測100多個蛋白。⑥PCF體系更優(yōu)化，定制抗體更具優(yōu)勢。⑦IMC采用激光點陣消融法，每個點陣間存在細微的間隔，空單蛋使用高分辨率顯微鏡成像，不遺漏組織上的每一個區(qū)域。8.空間轉(zhuǎn)錄組與PCF空間單細胞蛋白組的區(qū)別?①檢測對象不同?？臻g轉(zhuǎn)錄組是對數(shù)千種mRNA在組織原位上的表達進行分析，是從RNA層面定義細胞亞群，RNA反映的是調(diào)控過程，不是決定細胞的功能效應(yīng)因子，其變化不一定會同步體現(xiàn)在蛋白質(zhì)上。而蛋白質(zhì)是生物功能的最終體現(xiàn)者。因此定義細胞的種類和功能，蛋白質(zhì)層面的證據(jù)更為直接和準(zhǔn)確?？臻g單細胞蛋白組可對數(shù)百種蛋白質(zhì)在組織原位上的分布和表達進行分析(單細胞水平)，是從蛋白水平定義細胞亞類和細胞功能狀態(tài)的有力工具。②分辨率。很多空間轉(zhuǎn)錄組(例如10x、DSP)達不到單細胞分辨率，PCF空間單細胞蛋白組分辨率為0.25um，能夠?qū)崿F(xiàn)真正意義的單細胞水平。③空單蛋更直接，如果研究目的就是分析重要的免疫細胞和腫瘤細胞或基質(zhì)細胞間的關(guān)系，利用空單蛋的檢測指標(biāo)可以精確的聚焦在這些細胞類型的分析中。④空單蛋可以無縫銜接空間轉(zhuǎn)錄組開展多組學(xué)聯(lián)合分析。首先空單蛋發(fā)現(xiàn)感興趣的細胞互作特征區(qū)域，連續(xù)切片ROI圈選發(fā)現(xiàn)的特征區(qū)域開展GeoMXDSP空間轉(zhuǎn)錄組，揭示特征區(qū)域中不同細胞類型的基因表達譜。其次空單蛋在單細胞分辨率下定義細胞表型，因此空間轉(zhuǎn)錄組可以聯(lián)合空單蛋對細胞進行注釋。9.單細胞測序與CyTOF的區(qū)別?①檢測細胞數(shù)量。單細胞技術(shù)是對3000-30000個細胞進行測序檢測，由于檢測的細胞數(shù)量較少，不一定能夠反應(yīng)出復(fù)雜組織中的細胞占比，對于罕見細胞亞群的分辨率也不夠。如果再考慮人為取樣偏差和組織異質(zhì)性問題，就會嚴(yán)重影響單細胞測序的數(shù)據(jù)可信度。CyTOF技術(shù)每次實驗對多達100萬個細胞的蛋白質(zhì)進行檢測，不僅細胞分型數(shù)據(jù)更為準(zhǔn)確，對于與占比較小的細胞亞群也能夠精確分析。②檢測對象。單細胞測序檢測的是RNA水平的，CyTOF檢測的是蛋白水平。RNA反映的是調(diào)控過程，不是決定細胞的功能效應(yīng)因子，其變化不一定會同步體現(xiàn)在蛋白質(zhì)上。而蛋白質(zhì)是生物功能的最終體現(xiàn)者。因此定義細胞的種類和功能，蛋白質(zhì)層面的證據(jù)更為直接和準(zhǔn)確。③單細胞測序一般需要蛋白層面的驗證，例如免疫組化、流式、CyTOF等，從RNA層面有差異不一定在蛋白層面能驗證出來。另外，單細胞測序篩選到的差異基因不一定能買的對應(yīng)的抗體。10.我們中心主要是再生障礙性貧血會進行骨髓組織活檢，但是組織中脂肪細胞占比可能會非常高，在進行蠟塊處理的過程中脂滴都被溶掉了，這樣作為標(biāo)本是否可用?一般不影響實驗。這種樣本您自己做過免疫組化嗎，是否容易脫片，做免疫組化沒問題的話PCF就能測，抗體濃度可能要高一些。11.我看PCF的技術(shù)好像主要是針對細胞表面抗原進行錨定的，如果一個細胞有多個抗原希望檢測，是否會出現(xiàn)競爭、沖突或者干擾?染色時我們采用循環(huán)染色的形式，每一輪最多檢測3個抗體，三個熒光通道均不同。另外，每一輪檢測的抗體也會有設(shè)計原則，如完全共定位的指標(biāo)不能放在同一個循環(huán)里相鄰的兩個通道，不能放在