細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法

關(guān)于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法三、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（一）概述1.內(nèi)毒素(Endotoxin)：即革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的脂多糖，其毒性成分為類(lèi)脂A，菌體死亡崩解后釋放出來(lái)。2.細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法：本法系利用鱟試劑來(lái)檢測(cè)或量化由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。3.什么是鱟試劑？鱟試劑是由海洋生物鱟的血液變形細(xì)胞溶解物制成的無(wú)菌冷凍干燥品，含有能被微量細(xì)菌內(nèi)毒素和真菌葡聚糖激活的凝固酶原，凝固蛋白原，能夠準(zhǔn)確、快速地定性或定量檢測(cè)樣品中是否含有細(xì)菌內(nèi)毒素和（1,3）-β-葡聚糖激。

第2頁(yè),共19頁(yè)，2024年2月25日，星期天鱟的圖片鱟的長(zhǎng)相既像蝦又像蟹，人稱(chēng)之為“馬蹄蟹”,是一類(lèi)與三葉蟲(chóng)(現(xiàn)在只有化石)一樣古老的動(dòng)物。鱟的血液中含有銅離子，它的血液是藍(lán)色的。這種藍(lán)色血液的提取物——“鱟試劑”，可以準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)人體內(nèi)部組織是否因細(xì)菌感染而致??；在制藥和食品工業(yè)中，可用它對(duì)毒素污染進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

第3頁(yè),共19頁(yè)，2024年2月25日，星期天4.檢查方法：包括兩種方法，即凝膠法和光度測(cè)定法，后者包括濁度法和顯色基質(zhì)法。供試品檢測(cè)時(shí)，可使用其中任何一種方法進(jìn)行試驗(yàn)。當(dāng)測(cè)定結(jié)果有爭(zhēng)議時(shí)，除另有規(guī)定外，以凝膠法結(jié)果為準(zhǔn)。5.檢查的意義：注射劑熱原或細(xì)菌內(nèi)毒素檢查是保證注射劑安全性的重要質(zhì)量指標(biāo)。第4頁(yè),共19頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）凝膠法1.原理：通過(guò)鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理來(lái)檢測(cè)或半定量?jī)?nèi)毒素的方法。(限量、陽(yáng)性對(duì)照、靈敏度、溶劑、稀釋倍數(shù)）內(nèi)毒素的量用內(nèi)毒素單位(EU)表示。該法優(yōu)點(diǎn)：快速、靈敏。

2.細(xì)菌內(nèi)毒素檢查過(guò)程中用到的標(biāo)準(zhǔn)品和試劑①細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品（RSE）：系自大腸桿菌提取精制得到的內(nèi)毒素。用于標(biāo)定細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)、復(fù)核、仲裁鱟試劑靈敏度。第5頁(yè),共19頁(yè)，2024年2月25日，星期天②細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE）：系以細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)定，確定其質(zhì)量的相當(dāng)效價(jià)。1ng工作標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)應(yīng)不小于2EU，不大于50EU。用于鱟試劑靈敏度的復(fù)核、干擾試驗(yàn)及設(shè)置的各種陽(yáng)性對(duì)照。③細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水）：系指內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml的滅菌注射用水。是細(xì)菌內(nèi)毒素檢查專(zhuān)用水。④鱟試劑和鱟試劑靈敏度：a、鱟試劑的生產(chǎn)：利用鱟血制備而成。鱟試劑的種類(lèi)：美洲鱟試劑（LAL）、中國(guó)鱟試劑（TAL）、圓尾鱟試劑（CAL）。第6頁(yè),共19頁(yè)，2024年2月25日，星期天B、鱟試劑的規(guī)格：是指每支鱟試劑的裝量，如：0.1ml、0.5ml。一般來(lái)說(shuō)，規(guī)格是多少就用多少細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水復(fù)溶。如：0.1ml就用0.1ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水復(fù)溶。C、鱟試劑標(biāo)示靈敏度：細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的規(guī)定條件下，使鱟試劑產(chǎn)生凝集的內(nèi)毒素的最低濃度，用EU/ml表示，如：入=0.5EU/ml。⑤細(xì)菌內(nèi)毒素的限值（L）：哺乳動(dòng)物對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的量有一定的耐受力，只有內(nèi)毒素超過(guò)一定的限度，才會(huì)引起熱原反應(yīng)。因此內(nèi)毒素的檢查是一個(gè)限量檢查，只要不超過(guò)限值，產(chǎn)品就合格。確定限值的方法—從質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)正文中查出。第7頁(yè),共19頁(yè)，2024年2月25日，星期天⑥最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）：供試品溶液被允許稀釋的最大倍數(shù)，在不超過(guò)此稀釋倍數(shù)的濃度下進(jìn)行內(nèi)毒素限值的測(cè)定。MVD=CL/入。L：內(nèi)毒素限值；c：供試品溶液濃度，當(dāng)L以EU/ml表示時(shí)，c=1.0ml/ml；當(dāng)L以EU/mg或EU/u表示時(shí)，c的單位為mg/ml或u/ml，如：供試品為注射用無(wú)菌粉末或原料藥，則MVD=1例如：稱(chēng)取mg供試品Vml移取注射液xmlVmlMVD？C最大有效L×m/v=L×c樣≥入,c樣≥入/LEU/mgL·x/v=L×MVD≥入,MVD≥入/LEU/ml第8頁(yè),共19頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.檢查方法（1）檢查程序：①實(shí)驗(yàn)試劑、儀器及用具等的準(zhǔn)備；（除內(nèi)毒素）②確定藥品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值L；③選擇鱟試劑的靈敏度入；④計(jì)算供試品的最大有效稀釋倍數(shù)或最低有效濃度；⑤鱟試劑靈敏度的復(fù)核；⑥藥品與鱟試劑的相容性的初選實(shí)驗(yàn)（無(wú)干擾濃度初選）；⑦供試品的干擾實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證（正式干擾試驗(yàn)）；⑧供試品日常的內(nèi)毒素限量檢查。在實(shí)際操作過(guò)程中，（1）→（4）順序可變，（5）→（8）順序不能變。第9頁(yè),共19頁(yè)，2024年2月25日，星期天(2)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備A、除去干擾：試驗(yàn)所用器皿需經(jīng)處理，以除去可能存在的外源性?xún)?nèi)毒素，常用的方法是250℃干烤至少1小時(shí)，也可用其它確證不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素的適宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和微量加樣器配套的吸頭等，應(yīng)選用標(biāo)明無(wú)內(nèi)毒素并且對(duì)試驗(yàn)無(wú)干擾的器械。試驗(yàn)操作過(guò)程應(yīng)防止微生物的污染。B、材料與器具：細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品、鱟試劑、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水、漩渦混合器、37±1℃試管恒溫儀、稀釋、移液容器、試管架或試管浮板、酒精燈、消毒酒精棉球、剪刀、砂輪、鑷子、封口膠布標(biāo)記紙等。第10頁(yè),共19頁(yè)，2024年2月25日，星期天(3)鱟試劑靈敏度的復(fù)核試驗(yàn)A、復(fù)核的條件：本檢查法規(guī)定的條件下，使鱟試劑產(chǎn)生凝集的內(nèi)毒素的最低濃度即為鱟試劑的標(biāo)示靈敏度，用EU/ml表示。當(dāng)使用新批號(hào)的鱟試劑或試驗(yàn)條件發(fā)生了任何可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí)，應(yīng)進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)。第11頁(yè),共19頁(yè)，2024年2月25日，星期天B、操作：

0.1ml/支規(guī)格鱟試劑原安瓿18支

復(fù)溶0.1ml內(nèi)毒素檢查用水4支4支4支4支2支2.0λ內(nèi)毒素溶液1.0λ內(nèi)毒素溶液0.5λ內(nèi)毒素溶液0.25λ內(nèi)毒素溶液內(nèi)毒素檢查用水0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品或國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品內(nèi)毒素檢查用水溶解15min稀釋37±1℃保溫1h呈陽(yáng)性呈陰性結(jié)果有效計(jì)算鱟試劑靈敏度

式中：X為反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值(lg)。反應(yīng)終點(diǎn)濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個(gè)呈陽(yáng)性結(jié)果的濃度。當(dāng)λc在0.5λ～2.0λ時(shí)，方可用于內(nèi)毒素檢查，并以λC為該批鱟試劑靈敏度第12頁(yè),共19頁(yè)，2024年2月25日，星期天(4)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查-凝膠法-干擾試驗(yàn)按表制備溶液A、B、C和D，使用的供試品溶液應(yīng)為未檢驗(yàn)出內(nèi)毒素且不超過(guò)最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的溶液，按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下操作。

編號(hào)內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無(wú)/供試品溶液——————2B2λ/供試品溶液供試品溶液12482λ1λ0.5λ0.25λ4444C2λ/檢查用水檢查用水12482λ1λ0.5λ0.25λ4444D無(wú)/檢查用水——————2第13頁(yè),共19頁(yè)，2024年2月25日，星期天干擾試驗(yàn)結(jié)果判定前提：A和D的所有平行管都為陰性，并且系列溶液C的結(jié)果在鱟試劑靈敏度復(fù)核范圍內(nèi)時(shí)，試驗(yàn)方為有效。按下列計(jì)算系列溶液C和B的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（Es和Et）。

Es=lg-1（ΣXs/4)

Et=lg-1（ΣXt/4)式中

Es、Et分別為系列溶液C和溶液B反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值(lg)。當(dāng)Es在0.5λ~2λ(包括0.5λ和2λ）及0.5Es~2Es（包括0.5Es和2Es）時(shí)，認(rèn)為供試品在該濃度下無(wú)干擾作用。若供試品溶液在小于MVD的稀釋倍數(shù)下對(duì)試驗(yàn)有干擾，應(yīng)將供試品溶液進(jìn)行不超過(guò)MVD的進(jìn)一步稀釋?zhuān)僦貜?fù)干擾試驗(yàn)。注：A為供試品溶液；B為干擾試驗(yàn)系列；C為鱟試劑標(biāo)示靈敏度的對(duì)照系列；D為陰性對(duì)照。第14頁(yè),共19頁(yè)，2024年2月25日，星期天（5）檢查方法①取內(nèi)毒素的工作標(biāo)準(zhǔn)品一支，用水稀釋至2入濃度溶液②取檢品S，計(jì)算MVD③把它稀釋成SMVD④取鱟試劑8支（0.1ml/支），2支作為樣品檢查管(S1、S2)，2支標(biāo)記為陽(yáng)性對(duì)照，2支為陽(yáng)性產(chǎn)品對(duì)照，2支標(biāo)記為陰性對(duì)照第15頁(yè),共19頁(yè)，2024年2月25日，星期天舉例-清開(kāi)靈注射液中

細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查設(shè)檢品為S，L=1.0EU/ml，選用效價(jià)為0.06EU/支、入=0.06EU/ml的鱟試劑，使用的細(xì)菌內(nèi)毒素的工作標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)為10EU/支。參數(shù)及MVD已經(jīng)過(guò)預(yù)試驗(yàn)驗(yàn)證。操作步驟（1）取內(nèi)毒素的工作標(biāo)準(zhǔn)品一支，用水稀釋至2入濃度溶液，即E0.12.（2）計(jì)算最大稀釋倍數(shù)MVD=L/入=1.0/0.06=16倍（3）取檢品S，把它稀釋呈SMVD：0.2mlS+3.0ml水→SMVD16第16頁(yè),共19頁(yè)，2024年2月25日，星期天（4）取鱟試劑8支（0.1ml/支），兩支作為樣品檢查管(S1、S2)，2支標(biāo)記為陽(yáng)性對(duì)照，2支為陽(yáng)性產(chǎn)品對(duì)照，2支標(biāo)記為陰性對(duì)照，如下圖所示s1s2陽(yáng)性對(duì)照陽(yáng)性產(chǎn)品對(duì)照陰性對(duì)照0.1ml水+0.1mlSMVD160.1ml水+0.1mlSMVD160.1ml水+0.1mlE2入0.1mlE2入+0.1mlSMVD160.2ml水第17頁(yè),共19頁(yè)，2024年2月25日，星期天（5）封閉管口，搖勻，放入37±1℃