法半夏配方顆粒PCR鑒別-公示稿

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C**

團體標(biāo)準(zhǔn)

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法半夏配方顆粒PCR鑒別

PCRidentificationofFabanxiaPeifangkeli

（文件類型：公示稿）

（完成時間：2020年11月）

中華中醫(yī)藥學(xué)會發(fā)布

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前言

本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》

的規(guī)定起草。

本標(biāo)準(zhǔn)由中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心提出。

本標(biāo)準(zhǔn)由中華中醫(yī)藥學(xué)會歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心、華潤三九醫(yī)藥股份有限公司、安徽省

食品藥品檢驗研究院、浙江省中醫(yī)院、成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院、安徽華潤金蟾藥業(yè)股份有

限公司、華潤三九（雅安）藥業(yè)有限公司

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：袁媛、張輝、蔣超、張亞中、蒲婧哲、胡沖、鄭敏霞、鄭琰、高波、

吳建國

II

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法半夏配方顆粒PCR鑒別

1.范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了使用PCR鑒別法半夏配方顆粒的通用方法和要求。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于法半夏配方顆粒的鑒別。

2.規(guī)范性引用文件

下列文件對本標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用

于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用本標(biāo)準(zhǔn)。

《中華人民共和國藥典》

GB/T6682《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》

GB/T27403《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測》

T/CACM010-2016《中藥分子鑒定通則》

3.術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

3.1

法半夏配方顆粒fabanxiapeifangkeli

為天南星科植物半夏Pinelliaternate(Thunb)Breit.的干燥塊莖經(jīng)炮制并按標(biāo)準(zhǔn)湯劑的主

要質(zhì)量指標(biāo)加工制成的配方顆粒。

4.儀器設(shè)備

應(yīng)符合規(guī)范性附錄A的要求。

5.試劑

應(yīng)符合規(guī)范性附錄A的要求。

6.鑒別引物序列

BX-123aF：5'-CGGCGGAGGCACGCAAT-3'

1

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BX-123R：5'-AATTCACACCACGTATCGCATTT-3'。

7.試劑

為防止交叉污染，收樣、取樣、粉碎、DNA提取、核酸擴增與產(chǎn)物檢測應(yīng)在不同操作

間或在同一操作間不同隔離區(qū)域進行，進入各區(qū)域應(yīng)嚴(yán)格按照單一方向進行，即樣品制備區(qū)

→核酸制備區(qū)→擴增區(qū)→檢測區(qū)。

7.1取樣

送檢樣品總量應(yīng)不低于10g，每批分為3等份，1/3供實驗室分析用，另1/3供復(fù)核用，其

余1/3留樣保存。收樣時應(yīng)檢查包裝的完整性，并在樣品袋上貼上標(biāo)簽，填寫采集數(shù)據(jù)表。

對商品包裝和送樣說明進行拍照記錄，照片隨樣品一起備檔。送檢樣品抽樣方法參照《中華

人民共和國藥典》四部通則0211進行取樣。

7.2DNA提取

送檢樣品DNA提取步驟如下：

a)取樣品1g，粉碎成粉末。

b)取上述粉末0.02g，置2mL離心管中，加入細胞核裂解液300μL、乙二胺四乙酸

二鈉溶液50μL、蛋白酶K溶液20μL、RNA酶A5μL，充分渦旋震蕩混勻3min，56℃

下水浴60min。

c)離心（12000×g）5min后，吸取上清液250μL至一新的2mL離心管中，加入裂

解緩沖液250μL，混勻，轉(zhuǎn)移至純化柱，離心（12000×g）5min；棄去濾過液。

d)往純化柱中加入洗脫液700μL，離心（12000×g）1min。

e)重復(fù)步驟d）2次。

f)棄去濾過液，再離心（12000×g）2min，取出純化柱，室溫放置2min，晾干吸附

材料中的剩余洗脫液。

g)將純化柱換入一個新的2mL離心管，向吸附膜的中央懸空滴加無菌雙蒸水100μL，

靜置3min，離心（12000×g）2min，取濾過液的上清液，作為供試品溶液，可置-20℃下

保存?zhèn)溆谩?/p>

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除上述方法外，也可用等效的DNA提取方法提取試樣DNA。

7.3PCR擴增

首次使用本方法時，應(yīng)校對PCR儀溫控準(zhǔn)確性，并使用陽性對照和陰性對照以核對使

用的TaqDNA聚合酶或PCR預(yù)混液的適用性。

7.3.1對照試驗

送檢樣品應(yīng)平行檢測2次，并設(shè)置陽性對照（使用半夏對照藥材，按7.2提取所得DNA

作為PCR擴增的陽性對照）、陰性對照（可選擇使用天南星對照藥材，按7.2提取DNA，所

獲的液體作為PCR擴增的陰性對照）和空白對照。

7.3.2PCR反應(yīng)體系

在200μL離心管中依次加入2×M5SuperFastTaqPCRMasterMixPCR預(yù)混液12.5μL、

引物溶液（含正向和反向引物）各0.4μL、模板DNA（10ng~50ng）3μL，用無菌雙蒸水

補足反應(yīng)體積至25μL。將反應(yīng)液振蕩混勻，瞬時離心。

7.3.3PCR反應(yīng)參數(shù)

將離心管置于PCR儀中，PCR反應(yīng)參數(shù)為：95℃預(yù)變性5min，循環(huán)反應(yīng)40次(95℃

30s,62℃30s,72℃30s),72℃延伸5min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取出PCR管，對反應(yīng)產(chǎn)

物進行檢測或置4°C下保存。

7.4擴增產(chǎn)物檢測

配制2%瓊脂糖凝膠，膠中加入適量核酸染料GelRed。取送檢樣品、陽性對照、陰性

對照及空白對照的PCR反應(yīng)產(chǎn)物各1μL，分別加入6×上樣緩沖液各5μL，混勻，分別上樣

于同一瓊脂糖凝膠上，DL1000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)溶液上樣量為2μL（0.5μg/μL）。按《中

華人民共和國藥典》四部通則1001“瓊脂糖凝膠電泳法（核酸檢測用）”試驗。電泳結(jié)束后，

取凝膠片在凝膠成像儀上或紫外透射儀上檢視。

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8.結(jié)果判定

在陰性對照、陽性對照和空白對照結(jié)果符合規(guī)定的情況下，供試品凝膠電泳圖譜中，在

與對照藥材凝膠電泳圖譜相應(yīng)的位置上，在100~200bp有單一DNA條帶者為陽性結(jié)果，反之

為陰性結(jié)果。

9.結(jié)果報告

9.1一般要求

檢測結(jié)果應(yīng)表示為陽性或陰性，陽性和陰性分別用“+”和“-”符號表示。

9.2檢測報告

樣品經(jīng)檢測后，實驗室應(yīng)根據(jù)實驗的具體操作程序和結(jié)果做好詳細的實驗記錄，出具檢

測報告。檢測報告包含的基本內(nèi)容應(yīng)參照T/CACM010-2016《中藥分子鑒定通則》的要求。

10.質(zhì)量保證

兩份平行樣檢測結(jié)果應(yīng)一致。當(dāng)一份送檢樣品的結(jié)果為陽性，另一份為陰性時，要重新

測試?？梢赃m當(dāng)增加核酸擴增反應(yīng)體系中DNA模板量，使兩份試樣得到同樣的結(jié)果。平行

樣本檢測結(jié)果不一致時應(yīng)檢測模板DNA的質(zhì)量，確保提取的DNA片段大于擴增片段。如果

經(jīng)過兩次以上從核酸提取開始的重復(fù)檢測，檢測結(jié)果不一致，可在測試報告中表述該實驗室

樣品的測試結(jié)果為陰性，并注明定量檢測和定性檢測方法的檢測低限。進行PCR反應(yīng)前，應(yīng)

確認所使用的聚合酶符合本標(biāo)準(zhǔn)的要求。

11.廢棄物處理

檢測過程中的廢棄物處理應(yīng)符合GB/T27403《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢

測》的要求。

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附錄A

（規(guī)范性）

為執(zhí)行本包括本標(biāo)準(zhǔn)，以下儀器、試劑必不可少：

A.1儀器設(shè)備

離心機(離心機最高重力離心力應(yīng)≥12000×g)、金屬?。☉?yīng)可放置2mL離心管，也可使

用水浴鍋替代）、制冰機、渦旋振蕩器、高壓滅菌鍋、PCR儀（使用前應(yīng)進行溫度校準(zhǔn)、電

泳儀及其附件（應(yīng)包括水平電泳槽、制膠器、鯊魚齒梳等）、凝膠成像儀（或紫外透射儀等

凝膠觀察設(shè)備）、核酸蛋白儀、電子天平（感量0.01g）、連續(xù)可調(diào)微量移液槍（至少應(yīng)該包

括2.5μL、10μL、200μL、1000μL等4種不同規(guī)格，并包括配套一次性吸頭）、低溫冰箱

（溫度可維持在4°C及-20°C）

A.2試劑與試藥

除另有規(guī)定外，實驗試劑為不含DNA和DNase的分析純或生化試劑；實驗用水符合GB/T

6682的要求；所配制的試劑均應(yīng)滅菌后保存，并在容器上注明試劑名稱、濃度、配制時間、

保存條件、失效日期和配制者姓名；PCR試劑應(yīng)小量分裝保存以減少污染；材料及試劑的保

存都應(yīng)有防污染措施。

主要試劑與試藥包括：2×M5SuperFastTaqPCRMasterMixPCR預(yù)混液、DNA提取試

劑盒（可采用商品化DNA提取試劑盒，包括細胞核裂解液、乙二胺四乙酸二鈉溶液、裂解

緩沖液、洗脫液、DNA純化柱等）、DNA提取試劑盒（應(yīng)在-20°C下保存，使用時置冰上操

作）、引物溶液（用無菌雙蒸水將上述引物溶解至10μmol/L）、DL1000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)溶

液（DL1000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)凝膠電泳后應(yīng)出現(xiàn)100bp、200bp、300bp、400bp、500

bp和1000bp大小的指示條帶）、50×TAE電泳緩沖液、6×上樣緩沖液、半夏對照藥材粉末、

20mg/mL蛋白酶K溶液、10mg/mL核糖核酸酶A（RNA酶A）溶液、核酸凝膠染色劑GelRed

（10mg/mL或10000×）、2%瓊脂糖凝膠

50×TAE電泳緩沖液配制方法：在800mL去離子水中溶解242gTris，37.2g乙二胺四乙

酸二鈉（Na2EDTA·2H2O），加入57.1mL的醋酸，充分混勻，加去離子水定容至1L，室溫

保存，使用時用去離子水50倍稀釋?；蚴褂猛纫?guī)格商業(yè)產(chǎn)品。

6×上樣緩沖液配制方法：在80mL去離子水中溶解溴酚藍0.25g，二甲苯氰FF0.25g，蔗

糖40g，加水定容至100mL，分裝?；蚴褂猛纫?guī)格商業(yè)產(chǎn)品。

2%瓊脂糖凝膠配制方法：參照《中華人民共和國藥典》四部1001進行配制。取瓊脂糖

2.0g適量，加入電泳緩沖液100mL，加熱使溶脹完全，加人適量核酸染色劑，混勻，倒入

插有鯊魚齒梳的模具中，待凝膠結(jié)成無氣泡的均勻薄層，即得。

A.3適用范圍

本標(biāo)準(zhǔn)僅用于法半夏配方顆粒與其常見混偽品的真?zhèn)舞b定。本標(biāo)準(zhǔn)不適用于正偽混合樣

品的鑒定。

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附錄B

（資料性）

法半夏配方顆粒PCR反應(yīng)體系的建立

A.1特異性引物設(shè)計

通過測序及從GenBank數(shù)據(jù)庫查找正品半夏物種及半夏常見混偽品（半夏屬Pinellia

Tenore、天南星屬ArisaemaMart.、犁頭尖屬TyphoniumSchott）ITS序列。用BioEdit軟件

進行序列比較，找到半夏特異性SNP位點，設(shè)計鑒別引物BX-123aF：5'-

CGGCGGAGGCACGCAAT-3'和BX-123R：5'-AATTCACACCACGTATCGCATTT-3'。引

物設(shè)計如圖1所示。

圖1半夏特異性PCR鑒定的引物設(shè)計

A.2聚合酶對PCR鑒別結(jié)果的影響

不同TaqDNA聚合酶對半夏配方顆粒PCR鑒別的適用性不同，使用2×T5SuperPCR

Mix（北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司）、2×M5SuperFastTaqPCRMasterMix（聚合美生物

有限公司）、MightyAmpDNAPolymeraseVer.2（Takara生物科技有限公司）、2×TransStart?

FastPfuFlyPCRSuperMix（全式金生物技術(shù)有限公司）進行測試，結(jié)果僅2×M5SuperFastTaq

PCRMasterMix在半夏藥材、半夏配方顆粒浸膏、半夏配方顆粒中均能擴增出123bp的單

一鑒別條帶（圖2）。

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圖2不同聚合酶種類對半夏特異性PCR鑒別結(jié)果的影響

M:Trans2KDNAMarker；Pt：半夏；PtE（河北安國）：法半夏配方顆粒浸膏；PtG：法半夏

配方顆粒；Pp：虎掌南星（河北霸州）；Ae：天南星（湖南慈利）；Td：水半夏（廣西玉林）；

Tg：白附子（遼寧）；N：空白對照。

A.3方法的適用性考察

采用標(biāo)準(zhǔn)所述體系對不同來源的半夏配方顆粒進行鑒定，所有半夏配方顆粒均可擴增獲

得123bp特異性鑒別條帶，混偽品配方顆粒在相應(yīng)位置上均無擴增條帶(圖3)。

圖3不同企業(yè)、批次半夏及其混偽品配方顆粒鑒定結(jié)果

M.Trans2KDNAMarker；1-3：法半夏配方顆粒浸膏；4-23：法半夏配方顆粒；24-27：清

半夏配方顆粒；28-34：制天南星配方顆粒；35-37：制白附子配方顆粒；38-39：附片配方顆

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粒；N：空白對照

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參考文獻

[1]聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法通則起草組.《中國藥典》聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法的建立[J].中國中藥

雜志,2020,45(19):4537-4544.

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目次

前言...........................................................................................................錯誤!未定義書簽。

目錄...........................................................................................................錯誤!未定義書簽。

1.范圍......................................................................................................................................1

2.規(guī)范性引用文件..................................................................................................................1

3.術(shù)語和定義..........................................................................................................................1

4.儀器設(shè)備..............................................................................................................................1

5.試劑......................................................................................................................................1

6.鑒別引物序列......................................................................................................................1

7.檢驗程序..............................................................................................................................2

8.結(jié)果判定..............................................................................................................................4

9.結(jié)果報告..............................................................................................................................4

10.質(zhì)量保證............................................................................................................................4

11.廢棄物處理........................................................................................................................4

附錄A.......................................................................................................................................5

附錄B.......................................................................................................................................6

參考文獻...................................................................................................................................9

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法半夏配方顆粒PCR鑒別

1.范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了使用PCR鑒別法半夏配方顆粒的通用方法和要求。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于法半夏配方顆粒的鑒別。

2.規(guī)范性引用文件

下列文件對本標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用

于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用本標(biāo)準(zhǔn)。

《中華人民共和國藥典》

GB/T6682《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》

GB/T27403《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測》

T/CACM010-2016《中藥分子鑒定通則》

3.術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

3.1

法半夏配方顆粒fabanxiapeifangkeli

為天南星科植物半夏Pinelliaternate(Thunb)Breit.的干燥塊莖經(jīng)炮制并按標(biāo)準(zhǔn)湯劑的主

要質(zhì)量指標(biāo)加工制成的配方顆粒。

4.儀器設(shè)備

應(yīng)符合規(guī)范性附錄A的要求。

5.試劑

應(yīng)符合規(guī)范性附錄A的要求。

6.鑒別引物序列

BX-123aF：5'-CGGCGGAGGCACGCAAT-3'

1

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BX-123R：5'-AATTCACACCACGTATCGCATTT-3'。

7.試劑

為防止交叉污染，收樣、取樣、粉碎、DNA提取、核酸擴增與產(chǎn)物檢測應(yīng)在不同操作

間或在同一操作間不同隔離區(qū)域進行，進入各區(qū)域應(yīng)嚴(yán)格按照單一方向進行，即樣品制備區(qū)

→核酸制備區(qū)→擴增區(qū)→檢測區(qū)。

7.1取樣

送檢樣品總量應(yīng)不低于10g，每批分為3等份，1/3供實驗室分析用，另1/3供復(fù)核用，其

余1/3留樣保存。收樣時應(yīng)檢查包裝的完整性，并在樣品袋上貼上標(biāo)簽，填寫采集數(shù)據(jù)表。

對商品包裝和送樣說明進行拍照記錄，照片隨樣品一起備檔。送檢樣品抽樣方法參照《中華

人民共和國藥典》四部通則0211進行取樣。

7.2DNA提取

送檢樣品DNA提取步驟如下：

a)取樣品1g，粉碎成粉末。

b)取上述粉末0.02g，置2mL離心管中，加入細胞核裂解液300μL、乙二胺四乙酸

二鈉溶液50μL、蛋白酶K溶液20μL、RNA酶A5μL，充分渦旋震蕩混勻3min，56℃

下水浴60min。

c)離心（12000×g）5min后，吸取上清液250μL至一新的2mL離心管中，加入裂

解緩沖液250μL，混勻，轉(zhuǎn)移至純化柱，離心（12000×g）5min；棄去濾過液。

d)往純化柱中加入洗脫液700μL，離心（12000×g）1min。

e)重復(fù)步驟d）2次。

f)棄去濾過液，再離心（12000×g）2min，取出純化柱，室溫放置2min，晾干吸附

材料中的剩余洗脫液。

g)將純化柱換入一個新的2mL離心管，向吸附膜的中央懸空滴加無菌雙蒸水100μL，

靜置3min，離心（12000×g）2min，取濾過液的上清液，作為供試品溶液，可置-20℃下

保存?zhèn)溆谩?/p>

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除上述方法外，也可用等效的DNA提取方法提取試樣DNA。

7.3PCR擴增

首次使用本方法時，應(yīng)校對PCR儀溫控準(zhǔn)確性，并使用陽性對照和陰性對照以核對使

用的TaqDNA聚合酶或PCR預(yù)混液的適用性。

7.3.1對照試驗

送檢樣品應(yīng)平行檢測2次，并設(shè)置陽性對照（使用半夏對照藥材，按7.2提取所得DNA

作為PCR擴增的陽性對照）、陰性對照（可選擇使用天南星對照藥材，按7.2提取DNA，所

獲的液體作為PCR擴增的陰性對照）和空白對照。

7.3.2PCR反應(yīng)體系

在200μL離心管中依次加入2×M5SuperFastTaqPCRMasterMixPCR預(yù)混液12.5μL、

引物溶液（含正向和反向引物）各0.4μL、模板DNA（10ng~50ng）3μL，用無菌雙蒸水

補足反應(yīng)體積至25μL。將反應(yīng)液振蕩混勻，瞬時離心。

7.3.3PCR反應(yīng)參數(shù)

將離心管置于PCR儀中，PCR反應(yīng)參數(shù)為：95℃預(yù)變性5min，循環(huán)反應(yīng)40次(95℃

30s,62℃30s,72℃30s),72℃延伸5min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取出PCR管，對反應(yīng)產(chǎn)

物進行檢測或置4°C下保存。

7.4擴增產(chǎn)物檢測

配制2%瓊脂糖凝膠，膠中加入適量核酸染料GelRed。取送檢樣品、陽性對照、陰性

對照及空白對照的PCR反應(yīng)產(chǎn)物各1μL，分別加入6×上樣緩沖液各5μL，混勻，分別上樣

于同一瓊脂糖凝膠上，DL1000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)溶液上樣量為2μL（0.5μg/μL）。按《中

華人民共和國藥典》四部通則1001“瓊脂糖凝膠電泳法（核酸檢測用）”試驗。電泳結(jié)束后，

取凝膠片在凝膠成像儀上或紫外透射儀上檢視。

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8.結(jié)果判定

在陰性對照、陽性對照和空白對照結(jié)果符合規(guī)定的情況下，供試品凝膠電泳圖譜中，在

與對照藥材凝膠電泳圖譜相應(yīng)的位置上，在100~200bp有單一DNA條帶者為陽性結(jié)果，反之

為陰性結(jié)果。

9.結(jié)果報告

9.1一般要求

檢測結(jié)果應(yīng)表示為陽性或陰性，陽性和陰性分別用“+”和“-”符號表示。

9.2檢測報告

樣品經(jīng)檢測后，實驗室應(yīng)根據(jù)實驗的具體操作程序和結(jié)果做好詳細的實驗記錄，出具檢

測報告。檢測報告包含的基本內(nèi)容應(yīng)參照T/CACM010-2016《中藥分子鑒定通則》的要求。

10.質(zhì)量保證

兩份平行樣檢測結(jié)果應(yīng)一致。當(dāng)一份送檢樣品的結(jié)果為陽性，另一份為陰性時，要重新

測試。可以適當(dāng)增加核酸擴增反應(yīng)體系中DNA模板量，使兩份試樣得到同樣的結(jié)果。平行

樣本檢測結(jié)果不一致時應(yīng)檢測模板DNA的質(zhì)量，確保提取的DNA片段大于擴增片段。如果

經(jīng)過兩次以上從核酸提取開始的重復(fù)檢測，檢測結(jié)果不一致，可在測試報告中表述該實驗室

樣品的測試結(jié)果為陰性，并注明定量檢測和定性檢測方法的檢測低限。進行PCR反應(yīng)前，應(yīng)

確認所使用的聚合酶符合本標(biāo)準(zhǔn)的要求。

11.廢棄物處理

檢測過程中的廢棄物處理應(yīng)符合GB/T27403《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢

測》的要求。

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T/CACM****－20**

附錄A

（規(guī)范性）

為執(zhí)行本包括本標(biāo)準(zhǔn)，以下儀器、試劑必不可少：

A.1儀器設(shè)備

離心機(離心機最高重力離心力應(yīng)≥12000×g)、金屬浴（應(yīng)可放置2mL離心管，也可使

用水浴鍋替代）、制冰機、渦旋振蕩器、高壓滅菌鍋、PCR儀（使用前應(yīng)進行溫度校準(zhǔn)、電

泳儀及其附件（應(yīng)包括水平電泳槽、制膠器、鯊魚齒梳等）、凝膠成像儀（或紫外透射儀等

凝膠觀察設(shè)備）、核酸蛋白儀、電子天平（感量0.01g）、連續(xù)可調(diào)微量移液槍（至少應(yīng)該包

括2.5μL、10μL、200μL、1000μL等4種不同規(guī)格，并包括配套一次性吸頭）、低溫冰箱

（溫度可維持在4°C及-20°C）

A.2試劑與試藥

除另有規(guī)定外，實驗試劑為不含DNA和DNase的分析純或生化試劑；實驗用水符合GB/T

6682的要求；所配制的試劑均應(yīng)滅菌后保存，并在容器上注明試劑名稱、濃度、配制時間、

保存條件、失效日期和配制者姓名；PCR試劑應(yīng)小量分裝保存以減少污染；材料及試劑的保

存都應(yīng)有防污染措施。

主要試劑與試藥包括：2×M5SuperFastTaqPCRMasterMixPCR預(yù)混液、DNA提取試

劑盒（可采用商品化DNA提取試劑盒，包括細胞核裂解液、乙二胺四乙酸二鈉溶液、裂解

緩沖液、洗脫液、DNA純化柱等）、DNA提取試劑盒（應(yīng)在-20°C下保存，使用時置冰上操

作）、引物溶液（用無菌雙蒸水將上述引物溶解至10μmol/L）、DL1000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)溶

液（DL1000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)凝膠電泳后應(yīng)出現(xiàn)100bp、200bp、300bp、400bp、500