血液標本采集和血涂片制備

關(guān)于血液標本采集和血涂片制備第一章血液標本采集

和血涂片制備重點：血標本采集方法和血涂片制備技術(shù)難點：各種抗凝劑的優(yōu)缺點和使用選擇第2頁,共49頁，2024年2月25日，星期天

第一節(jié)血液標本采集和抗凝劑選擇血標本：全血：血細胞+血漿;臨床血液學(xué)檢查，血細胞計數(shù)、分類和形態(tài)學(xué)檢查血漿：全血除去血細胞；血漿病理性和生理性化學(xué)成分的測定，內(nèi)分泌激素、凝血因子（鈣除外）、血栓和止血檢查血清：離體后血液自然凝固后析出的液體成分（除纖維蛋白原等凝血因子）；臨床化學(xué)和臨床免疫學(xué)檢查第3頁,共49頁，2024年2月25日，星期天

一、采血方法

靜脈采血法部位：主要是肘靜脈。還可以在：手背、內(nèi)踝、股靜脈，幼兒可采用頸外靜脈采血采血器材：一次性注射器采血步驟和注意事項：止血帶壓迫時間不能過長；注射器和容器必須干燥第4頁,共49頁，2024年2月25日，星期天采血步驟選擇適宜靜脈，在臂扎上壓脈帶，于穿刺處皮膚做環(huán)形消毒讓病人握拳，使靜脈顯露。左手拇指固定穿刺部位下端，右手持注射器，使針筒刻度向上，先以約30o角度沿靜脈正面進針，穿過皮膚刺人靜脈腔。見回血后，右手固定注射器，用左手緩緩抽出注射器針栓，至所需血量后，解除壓脈帶，放松拳頭，以消毒棉簽壓住穿刺孔，拔出針頭第5頁,共49頁，2024年2月25日，星期天第6頁,共49頁，2024年2月25日，星期天部位：中指或無名指尖內(nèi)側(cè)、耳垂；半歲以下拇指或足部，特殊人員視情況而定所用器材：采血針、吸管采血步驟及注意事項：避免交叉應(yīng)嚴格實行一人一針制；穿刺的深度的適當，切忌用力擠壓，以免混入組織液，影響檢驗結(jié)果。皮膚采血法（毛細血管采血法）第7頁,共49頁，2024年2月25日，星期天部位：主要是肘靜脈。采血器材：真空采血裝置，頭套式、頭皮靜脈式兩種真空采血法（負壓采血法）第8頁,共49頁，2024年2月25日，星期天采血步驟及注意事項：利用真空貯血管中的負壓原理，自動定量的將血液引入貯血管內(nèi)；瓶塞穿刺針外具有止血護套，使用時請勿將其取下；采集血樣后，針對有輸液要求的病患者，醫(yī)務(wù)人員可將軟座與輸液器相接進行輸液，減少病人的靜脈穿刺次數(shù)；一次性使用，用后銷毀。

既有利于標本的收集運送和保存，又便于防止血液交叉感染，已開始在國內(nèi)推廣使用。第9頁,共49頁，2024年2月25日，星期天第10頁,共49頁，2024年2月25日，星期天方法學(xué)評價

靜脈采血皮膚采血真空采血缺點不同抗凝劑的使用，限制了重復(fù)實驗；價格高改變血液性質(zhì)，影易于溶血、凝血響有形成分的形態(tài);和可混入組織液環(huán)境污染優(yōu)點標本代表性大，無價廉、快速、操作減少溶血，操組織液影響，適于簡便，標本可直接作規(guī)范，防止臨床研究，可重復(fù)測定交叉感染，保實驗和追加其他實護環(huán)境驗第11頁,共49頁，2024年2月25日，星期天

質(zhì)量控制患者：活動情況、精神狀態(tài)、藥物、年齡、性別標本采集等采血：操作規(guī)范溶血：采集、轉(zhuǎn)移、保管、分離血標本處理：立即送檢實驗結(jié)果分析：藥物、飲食的影響；密切結(jié)合臨床第12頁,共49頁，2024年2月25日，星期天

二、抗凝劑選擇抗凝：用物理或化學(xué)方法除去或抑制血液中的某些凝血因子的活性，以阻止血液凝固

抗凝劑：能夠阻止血液凝固的物質(zhì)，稱抗凝劑第13頁,共49頁，2024年2月25日，星期天

乙二胺四乙酸（EDTA）鹽抗凝原理：螯合鈣離子使用方法：15g/L濃度EDTA和血液1：10適用范圍：對血細胞形態(tài)、血小板計數(shù)影響?。挥绊懷“寰奂桶准毎淌晒δ?；不適合做凝血象檢驗及血小板功能試驗

第14頁,共49頁，2024年2月25日，星期天

草酸鹽（sodiumoxalate）

草酸鈉、草酸鉀、草酸銨原理：草酸鹽可與血中鈣離子生成草酸鈣沉淀，從而阻止血液凝固使用方法：草酸鈉0.1mol/L和血液1：9適用范圍：凝血象檢查第15頁,共49頁，2024年2月25日，星期天

肝素（heparin）

原理：低濃度時抑制因子Ⅸa、Ⅷ和PF3之間的作用，加強抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）滅活絲氨酸蛋白酶，從而阻止凝血酶形成,還能抑制凝血酶的自我催化及抑制因子Ⅹ的作用；高濃度時阻斷凝血酶和纖維蛋白的反應(yīng)適用方法：

1g/L濃度的肝素鈉與血液1：10優(yōu)點：抗凝能力強、不影響血細胞體積、不易溶血、能耐高溫適用范圍：紅細胞檢驗（紅細胞計數(shù)、血紅蛋白測定、紅細胞比積）和多種生化分析第16頁,共49頁，2024年2月25日，星期天

枸櫞酸鹽（枸櫞酸三鈉）

原理：螯合鈣離子使用方法：配成109mmol/L的濃度和血液1：9106mmol/L的濃度和血液1：4適用范圍：止血學(xué)檢驗、血沉、輸血保養(yǎng)液（毒性?。┑?7頁,共49頁，2024年2月25日，星期天

物理方法抗凝脫纖維蛋白：將血液注入有玻璃珠的器皿中，轉(zhuǎn)動，纖維蛋白纏繞凝固于玻璃球，從而防止血成凝塊。適

用于免疫學(xué)檢驗和紅斑性狼瘡細胞檢查。第18頁,共49頁，2024年2月25日，星期天

血液的貯存

1.血液標本檢驗前的預(yù)處理分離血清或血漿預(yù)溫血漿或血清分離細胞

第19頁,共49頁，2024年2月25日，星期天冷藏保存:血漿在4℃保存24h后，某些凝血因子活性減少95%。供血細胞分析儀使用的EDTA-k2抗凝全血應(yīng)保存于室溫，但不宜超過8h，如果在4℃保存可使血小板計數(shù)結(jié)果減低。

冷凍保存:要長時間保存血液中有活性的成分如凝血因子、酶類等，可采取分離血清或血漿后快速深低溫冷凍的方式，冷凍的標本一般應(yīng)避免反復(fù)凍融。

根據(jù)檢驗項目要求有些血液標本要求避光、隔絕空氣等

2.血液標本的保存第20頁,共49頁，2024年2月25日，星期天3.血液標本檢驗后的處理

血源性污染是醫(yī)源性污染的主要來源之一，檢驗后的血液標本處理不當，其危害極大。對于檢驗完畢的血液標本首先要進行高壓滅菌，然后再進行無害化處理。帶有血液的檢驗器材要用消毒液浸泡。采血用的注射器要進行毀形、消毒并進行無害化處理。第21頁,共49頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)血液涂片制備和細胞染色

血涂片的顯微檢查是血液細胞學(xué)檢查的基本方法，臨床上應(yīng)用極為廣泛，特別是對于各種血液病的診斷具有重要的價值，近年來血細胞分析儀的廣泛應(yīng)用，血涂片的觀察也可作為判斷儀器結(jié)果的簡易方法。

血涂片的用途：血細胞形態(tài)學(xué)檢驗、網(wǎng)織紅、異常寄生蟲檢驗。

第22頁,共49頁，2024年2月25日，星期天

一、血液涂片制備將推玻片向1的方向稍抽回，當血液充滿推玻片的寬度后，以一定均勻的速度向2的方向滑動。第23頁,共49頁，2024年2月25日，星期天圖1-3血涂片制備示意圖（上：側(cè)面觀，下：正面觀）

第24頁,共49頁，2024年2月25日，星期天[血涂片質(zhì)量評價]均勻、厚薄、頭體尾、邊緣、兩側(cè)注意：血滴大，速度快、角度大----血膜厚一張良好血涂片的標準是：厚薄適宜、頭體尾分明、細胞分布均勻、邊緣整齊、兩側(cè)及兩頭留有空隙。第25頁,共49頁，2024年2月25日，星期天第26頁,共49頁，2024年2月25日，星期天第27頁,共49頁，2024年2月25日，星期天

二、血液細胞染色

染料：生物學(xué)染色劑，將生物組織細胞和病原體染色，在顯微鏡下觀察結(jié)構(gòu)。發(fā)色基團和助色基團使生物學(xué)染色劑產(chǎn)生顏色和被染組織親合。第28頁,共49頁，2024年2月25日，星期天堿性染料：為陽離子染料，能接受質(zhì)子，染細胞核的染料。如亞甲藍、天青。酸性染料：為陰離子染料，能釋放質(zhì)子。主要有熒烷-氧雜蒽染料和偶氮染料兩類，能結(jié)合細胞的堿性成分并染色，如血紅蛋白、嗜酸性顆粒成分等。復(fù)合染料：同時具有陰、陽離子型的染料如瑞氏染料第29頁,共49頁，2024年2月25日，星期天

細胞染色原理：

一般以它們的物理現(xiàn)象和/或化學(xué)現(xiàn)象為依據(jù)物理作用：毛細管現(xiàn)象、滲透、吸收、吸附作用等化學(xué)作用：a.染料的化學(xué)成分：助色基團的存在，堿性染料在溶媒中為陽離子型，易與組織和細胞內(nèi)帶負電荷的酸性物質(zhì)結(jié)合；而酸性染料在溶媒中為陰離子型，與帶正電荷的堿性物質(zhì)結(jié)合。第30頁,共49頁，2024年2月25日，星期天b.蛋白質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)：蛋白質(zhì)中的氨基酸含有不同數(shù)量的氨基（-NH2）和羧基（-COOH），同時還有其它活性基團。在游離狀態(tài)時，-NH2獲得一個H+變成帶正電的-NH3+，而-COOH失去一個H+變成帶負電的-COO-。分別與不同染料結(jié)合。

c.周圍環(huán)境的酸堿度：如環(huán)境pH＜pI（pI為等電點），則蛋白質(zhì)帶正電，結(jié)合酸性染料；反之，pH＞pI，則結(jié)合堿性染料。第31頁,共49頁，2024年2月25日，星期天

細胞染色法的類型

普通染色法：經(jīng)物理和/或化學(xué)作用的吸附、結(jié)合熒光染色法：熒光染料，熒光顯微鏡細胞活體染色法：活體染料如燦爛甲酚藍等細胞化學(xué)染色法：用化學(xué)反應(yīng)顯示細胞內(nèi)某種成分細胞免疫化學(xué)染色法（應(yīng)用單克隆抗體技術(shù)、酶標記技術(shù)）

第32頁,共49頁，2024年2月25日，星期天

瑞氏染色法[瑞氏染料]

由酸性染料伊紅（eosin,E-）和堿性染料亞甲藍(methyleneblue,M+)組成有復(fù)合染料。亞甲藍為四甲基硫堇染料，有對醌型和鄰醌型兩種結(jié)構(gòu)。通常為氯鹽，即氯化美藍。美藍容易氧化為一、二、三甲基硫堇等次級染料。市售美藍中部分已被氧化為天青。伊紅通常為鈉鹽。將伊紅和美藍溶解在甲醇中，即瑞氏染料。第33頁,共49頁，2024年2月25日，星期天

[染色原理]

細胞的染色既有物理的吸附作用，又有化學(xué)的親和作用，各種細胞成分化學(xué)性質(zhì)不同，對各種染料的親和力也不一樣。因此，用本染料液染色后，在同一血片上，可以看到各種不同的色彩，例如血紅蛋白，嗜酸性顆粒為堿性蛋白質(zhì)，與酸性染料伊紅結(jié)果，染粉紅色，稱為嗜酸性物質(zhì)；細胞核蛋白和淋巴細胞胞漿為酸性，與堿性染料美藍或天青結(jié)合，染紫藍色，稱為嗜堿性物質(zhì)；中性顆粒呈等電狀態(tài)與伊紅和美藍均可結(jié)合，染淡紫色，稱為中性物質(zhì)。

M+CL+Na+E→ME+NaCL

美藍伊紅伊紅化美藍（瑞氏染料）

第34頁,共49頁，2024年2月25日，星期天

圖1-4瑞氏染色原理示意圖

第35頁,共49頁，2024年2月25日，星期天[PH對細胞染色有影響]

細胞各種成分均為蛋白質(zhì)，由于蛋白質(zhì)系兩性電解質(zhì)，所帶電荷隨溶液PH而定，在偏酸性環(huán)境中正電荷增多，易與伊紅結(jié)合，染色偏紅；在偏堿性環(huán)境中負電荷增多，易與美藍或天青結(jié)合，染色偏藍。因此細胞染色對氫離子濃度十分敏感，染色用玻片必須清潔，無酸堿污染。配制瑞氏染液必須用優(yōu)質(zhì)甲醇，稀釋染色必須用緩沖液，沖洗用水應(yīng)近中性，否則可導(dǎo)致各種細胞染色反應(yīng)異常，以致識別困難，甚至造成錯誤。第36頁,共49頁，2024年2月25日，星期天[試劑]

Wright染液：瑞氏染粉0.1g,甲醇60.0ml甲醇：有強大的脫水力，可將細胞固定為一定形態(tài)，并使蛋白質(zhì)沉淀為顆粒狀、網(wǎng)狀等結(jié)構(gòu)，增加細胞與染料接觸表面積，提高對染料的吸附作用，增強染色效果。磷酸鹽緩沖液（PBS，pH6.4-6.8）：磷酸二氫鉀（無水）0.3g，磷酸氫二鈉（無水）0.2g,蒸餾水加到1000ml。配好后用磷酸鹽溶液校正pH，塞緊瓶口備用。第37頁,共49頁，2024年2月25日，星期天[染色方法]1.用蠟筆在血膜兩頭劃線，平放于染色架上。2.加瑞氏染液覆蓋血膜，固定1min。3.滴加等量或稍多的緩沖液，混勻，染色5-10分鐘。4.用清水沖洗，待干后鏡檢。第38頁,共49頁，2024年2月25日，星期天【質(zhì)量控制】血膜要干透后才能染色，否則染色時易脫落.染色時間與染液濃度、室溫及細胞多少有關(guān)，一般染液淡、染色時間長些效果好。染液不能過少，以防蒸發(fā)沉淀。沖洗時不能先倒掉染液，應(yīng)以流水沖，防止染料沉著。沖洗時間也不能長。染色過淡，可復(fù)染。染色過深可用水沖洗或浸泡，還可用甲醇脫色.第39頁,共49頁，2024年2月25日，星期天第40頁,共49頁，2024年2月25日，星期天【染色結(jié)果評價】

正常情況：血膜外觀呈淡琥珀色。在顯微鏡下紅細胞染成粉紅色，在厚薄均勻處略有碟狀感。白細胞胞質(zhì)中的顆粒能顯示出各種細胞的特有色彩，細胞核染紫紅色，核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)清楚。染色環(huán)境偏酸：則紅細胞和嗜酸性顆粒偏紅，白細胞核呈淺藍色或不著色，染色過酸pH<3.5時，則呈現(xiàn)一片紅色，白細胞中除嗜酸性顆粒外均不著色。染色環(huán)境偏堿：則所有細胞呈灰藍色，微偏堿者紅細胞暗紅、白細胞顆粒深暗。嗜酸性顆粒可染成暗褐色甚至黑紫色或藍色。中性顆粒也偏粗染成紫黑色，血膜過厚的地方呈綠色。第41頁,共49頁，2024年2月25日，星期天姬姆薩染色法[原理]

吉姆薩染液由天青，伊紅組成。染色原理和結(jié)果與瑞特染色法基本相同。但本法對細胞核和寄生蟲著色較好，結(jié)構(gòu)顯示更不清晰，而胞質(zhì)和中性顆粒則著色較差。為兼顧二者之長，可用復(fù)合染色法。即以稀釋吉姆薩液代替緩沖液，按瑞特染色法染10min。或先用瑞特染色法染色后，再用稀釋吉姆薩復(fù)染。第42頁,共49頁，2024年2月25日，星期天吉姆薩染料1.0g甘油66.0ml甲醇（AR）66.0ml[染色方法]1.甲醇固定干燥血膜3-5min2.將血膜在染液中浸染10-30min3.流水沖洗,待干