分子生物學(xué)-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)匯編

聚合酶鏈反應(yīng)PolymerasechainreactionPCR4/2/20241聚合酶鏈反應(yīng)Polymerasechainreac

聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction），簡(jiǎn)稱PCR技術(shù)，是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種選擇性體外擴(kuò)增DNA或RNA片段的方法。

PCR特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單；擴(kuò)增速度快，可在數(shù)小時(shí)內(nèi)使DNA或RNA片段放大百萬(wàn)倍。

PCR應(yīng)用：PCR技術(shù)已滲透到分子生物學(xué)的各處領(lǐng)域，在分子克隆、遺傳病的基因診斷、法醫(yī)學(xué)等方面得到了廣泛應(yīng)用。4/2/20242聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechaPCR的基本原理

細(xì)胞中的DNA復(fù)制是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。參與復(fù)制的因素有多種。PCR是在試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng)（在體外模擬DNA復(fù)制反應(yīng)），基本原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相似，但反應(yīng)體系相對(duì)較簡(jiǎn)單。4/2/20243PCR的基本原理細(xì)胞中的DNA復(fù)制是一個(gè)復(fù)雜4/2/202444/1/20244PCR循環(huán)–第一步–加熱變性靶序列靶序列4/2/20245PCR循環(huán)–第一步–加熱變性靶序列靶序列4/1/2PCR循環(huán)-第二步–引物與靶序列退火靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’4/2/20246PCR循環(huán)-第二步–引物與靶序列退火靶序列靶序列PrPCR循環(huán)-第三步-引物延伸靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase4/2/20247PCR循環(huán)-第三步-引物延伸靶序列靶序列Prime第1個(gè)PCR循環(huán)完成后–

得到兩個(gè)拷貝的靶序列靶序列靶序列BiotinBiotin4/2/20248第1個(gè)PCR循環(huán)完成后–

得到30次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon4/2/2024930次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量No.of No.Ampli4/2/2024104/1/202410PCR擴(kuò)增過(guò)程圖示4/2/202411PCR擴(kuò)增過(guò)程圖示4/1/202411典型PCR反應(yīng)體系復(fù)制模板耐熱DNA聚合酶引物緩沖體系底物4/2/202412典型PCR反應(yīng)體系復(fù)制模板耐熱DNA聚合酶引物緩沖體系底物4

DNA的合成，無(wú)論是在體內(nèi)，還是在體外，都是在DNA聚合酶的作用下，在模板的指導(dǎo)下合成的。在PCR反應(yīng)中的模板，指的是待擴(kuò)增的DNA片段。4/2/202413DNA的合成，無(wú)論是在體內(nèi)，還是在體外，模板DNA：模板可以是基因組DNA、質(zhì)粒DNA、擴(kuò)增后的DNA或cDNA等，RNA的擴(kuò)增需要首先反轉(zhuǎn)錄成cDNA后才能進(jìn)行正常PCR循環(huán)。含有靶序列的DNA可以單鏈或雙鏈形式加入PCR混合液。通常小片段模板DNA的PCR效率要高于大分子DNA，因此PCR反應(yīng)前用機(jī)械剪切或用稀有限制酶酶解基因組DNA，以提高產(chǎn)量。PCR反應(yīng)中模板加入量一般為102~105拷貝。1μg人基因組DNA相當(dāng)于3×105個(gè)單拷貝的靶分子；10ng酵母DNA相當(dāng)于3×105靶分子；1ng大腸桿菌DNA相當(dāng)于3×105靶分子。4/2/202414模板DNA：模板可以是基因組DNA、質(zhì)粒DNA、擴(kuò)增后的DN耐熱DNA聚合酶包括TaqDNA聚合酶、TthDNA聚合酶、VENTDNA聚合酶和SacDNA聚合酶。其中TaqDNA聚合酶應(yīng)用最廣泛。TaqDNA聚合酶在92.5℃、95℃和97.5℃時(shí)半衰期分別為40分鐘、30分鐘和5~6分鐘，故PCR反應(yīng)中變性溫度不宜高于95℃。TaqDNA聚合酶最適溫度是72℃，較高溫度下的DNA合成錯(cuò)誤率較低。因此，一次加酶可滿足PCR反應(yīng)全過(guò)程的需要，使PCR走向自動(dòng)化。4/2/202415耐熱DNA聚合酶包括TaqDNA聚合酶、TthDNA聚

DNA聚合酶只能從3’OH延長(zhǎng)DNA，而不能從頭合成DNA，必須有一個(gè)引物引發(fā)DNA的合成。因此，選擇合適的引物是PCR成功的關(guān)鍵。引物設(shè)計(jì)的基本要求（原則）：（1）引物長(zhǎng)度一般為15~30個(gè)核苷酸。引物過(guò)短會(huì)影響PCR的特異性，引物過(guò)長(zhǎng)會(huì)提高相應(yīng)的退火溫度并使延伸溫度超過(guò)TaqDNA聚合酶的最適溫度，也會(huì)影響產(chǎn)物生成。4/2/202416DNA聚合酶只能從3’OH延長(zhǎng)DNA，而不能（2）引物中的堿基組成盡可能隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶堿基堆積現(xiàn)象。尤其是引物的3’端不應(yīng)有連續(xù)3個(gè)G和C。使引物在模板的G+C富集序列區(qū)錯(cuò)誤配對(duì)。G+C含量在引物堿基中一般占40%~60%。設(shè)計(jì)引物時(shí)要考慮3’端和5’端具有相似的Tm值，按引物的堿基組成計(jì)算Tm值的公式為：Tm值=4（G+C）+2（A+T）4/2/202417（2）引物中的堿基組成盡可能隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶堿基（3）引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列以避免折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。按經(jīng)驗(yàn)，引物自身存在的連續(xù)互補(bǔ)序列，一般不超過(guò)3bp。（4）兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其應(yīng)避免3’端的互補(bǔ)重疊。（5）引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過(guò)70%，引物3’末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。4/2/202418（3）引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列以避免折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。按經(jīng)驗(yàn)，（6）引物3’端堿基是引發(fā)延伸的起點(diǎn)，因此一定要與模板DNA配對(duì)。引物3’端最佳堿基選擇是G和C。因?yàn)樗鼈冃纬傻膲A基配對(duì)比較穩(wěn)定。（7）引物濃度，引物的濃度一般為0.1~0.5μmol/L，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。4/2/202419（6）引物3’端堿基是引發(fā)延伸的起點(diǎn)，因此一定要與模板DNA

引物3’端錯(cuò)配對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的影響是有一定規(guī)律的。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中用2UTaqDNA聚合酶和200μmol/LdNTP,以質(zhì)粒（103個(gè)拷貝）為模板，按95℃，25秒；55℃，25秒；72℃，1分鐘的循環(huán)參數(shù)擴(kuò)增HIV-1gag區(qū)時(shí)，引物3’端錯(cuò)配對(duì)擴(kuò)增效率的影響為：4/2/202420引物3’端錯(cuò)配對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的影響是有一定規(guī)律的。在標(biāo)引物3’端錯(cuò)配對(duì)擴(kuò)增效率的影響5’4/2/202421引物3’端錯(cuò)配對(duì)擴(kuò)增效率的影響5’4/1/20242PCR反應(yīng)的緩沖體系：PCR的緩沖液一般制成10×，含有：500mmol/LKCl;100mmol/LTris-HCl(pH8.3);15mmol/LMgCl2;0.1%明膠。

使用時(shí)稀釋10倍。其中Tris-HCl可維持反應(yīng)體系的pH，KCl有利于引物的復(fù)性，但濃度過(guò)高會(huì)抑制TaqDNA聚合酶的活性，明膠可保護(hù)酶不變性失活，Taq酶需要Mg2+，它會(huì)影響反應(yīng)的特異性和擴(kuò)增DNA的產(chǎn)率，因此要將Mg2+濃度調(diào)至最佳。4/2/202422PCR反應(yīng)的緩沖體系：PCR的緩沖液一般制成10×，含有：5延伸溫度與時(shí)間：TaqDNA聚合酶的生物學(xué)活性：

70～80℃150核苷酸/S/酶分子

70℃60核苷酸/S/酶分子

55℃24核苷酸/S/酶分子

高于90℃時(shí)，DNA合成幾乎不能進(jìn)行4/2/202423延伸溫度與時(shí)間：TaqDNA聚合酶的生物學(xué)活性：

延伸溫度與時(shí)間：延伸溫度：一般選擇在70～75℃之間常用溫度為72℃過(guò)高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。延伸反應(yīng)時(shí)間：根據(jù)待擴(kuò)增片段長(zhǎng)度而定1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時(shí)間1min（足夠）3～4kb的靶序列需3～4min擴(kuò)增10Kb需延伸至15min延伸進(jìn)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長(zhǎng)些4/2/202424延伸溫度與時(shí)間：延伸溫度：一般選擇在70～75℃之間4/1/

底物：dNTP常用的濃度為20~200μmol/L，而且4種dNTP的終濃度相等。dNTP濃度過(guò)高雖可加快反應(yīng)速度，但會(huì)增加堿基的錯(cuò)誤摻入率，適當(dāng)?shù)牡蜐舛葧?huì)提高反應(yīng)的精確度。另外，dNTP是磷酸根的來(lái)源，會(huì)與Mg2+結(jié)合，也應(yīng)注意協(xié)調(diào)Mg2+濃度和dNTP濃度之間的關(guān)系。4/2/202425底物：dNTP常用的濃度為20~200μmPCR溫度循環(huán)參數(shù)：

PCR反應(yīng)中，變性溫度一般為90~95℃。變性所需的時(shí)間取決于DNA的復(fù)雜性，多用94℃30秒對(duì)模板DNA進(jìn)行變性，過(guò)高的溫度及過(guò)長(zhǎng)的時(shí)間會(huì)降低Taq酶的活性。引物的退火溫度通過(guò)Tm=4（G+C）+2（A+T）計(jì)算得到，一般55~80℃30秒。延伸溫度選在70~75℃之間，此時(shí)Taq酶的活性最高。延伸反應(yīng)的時(shí)間根據(jù)擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定，一般1kb以內(nèi)延伸一分鐘，更長(zhǎng)的片段需相應(yīng)延長(zhǎng)時(shí)間。PCR的循環(huán)次數(shù)取決于模板DNA的濃度一般20~30次。4/2/202426PCR溫度循環(huán)參數(shù)：PCR反應(yīng)中，變性溫度一般PCR實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意的事項(xiàng)：

由于PCR反應(yīng)具有極強(qiáng)的擴(kuò)增能力和檢測(cè)的靈敏性，微量的樣品污染便有可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)。為此在實(shí)驗(yàn)操作中應(yīng)謹(jǐn)防污染的發(fā)生，并設(shè)置嚴(yán)格的對(duì)照，以提高PCR結(jié)果的正確性。常采用的措施有（1）隔離不同操作區(qū)，包括樣品制備區(qū)；PCR操作區(qū)；反應(yīng)產(chǎn)物分析區(qū)等；（2）對(duì)于所用試劑必須分裝，以減少重復(fù)取樣所致的污染；（3）采用一次性吸頭和加樣器進(jìn)行PCR取樣和加樣操作，樣品制備應(yīng)嚴(yán)格按無(wú)菌操作原則進(jìn)行。4/2/202427PCR實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意的事項(xiàng)：由于PCR反應(yīng)具有為防止PCR過(guò)程中出現(xiàn)假陽(yáng)性，應(yīng)設(shè)置以下幾個(gè)對(duì)照：（1）陽(yáng)性對(duì)照：陽(yáng)性DNA模板參與的PCR反應(yīng)；（2）陰性對(duì)照：陰性DNA模板參與的PCR反應(yīng)；（3）試劑對(duì)照：不含任何DNA模板，但具有所有反應(yīng)試劑的PCR反應(yīng)。4/2/202428為防止PCR過(guò)程中出現(xiàn)假陽(yáng)性，應(yīng)設(shè)置以下幾個(gè)對(duì)照：（1）陽(yáng)性PCR循環(huán)次數(shù)與產(chǎn)物的積累：從變性、退火到延伸一次稱為一個(gè)循環(huán)，每循環(huán)一次產(chǎn)物增加一倍，即以指數(shù)增長(zhǎng)。理論上講，循環(huán)次數(shù)越多，產(chǎn)物積累越多。但PCR反應(yīng)是在酶的作用下完成的，隨著產(chǎn)物的增加，引物和底物的消耗，使酶促反應(yīng)越來(lái)越慢，達(dá)到所謂的平臺(tái)期。4/2/202429PCR循環(huán)次數(shù)與產(chǎn)物的積累：從變性、退火到延PCR技術(shù)的主要類型筑巢PCR（nested-primerPCR）共享引物PCR(sharedprimerPCR)多重PCR（multiplePCR）不對(duì)稱PCR（asymmetricPCR）錨定PCR（anchoredPCR）反向PCR（invertedPCR）彩色PCR（colorcomplementationassay）原位PCR（insituPCR）定量PCR（quantifiedPCR）差異顯示PCR（differentialdisplayPCR）重組PCR（recombinantPCR）PCR技術(shù)的類型4/2/202430PCR技術(shù)的主要類型筑巢PCR（nested-primer

筑巢PCR用兩對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增。第一對(duì)引物（外引物），擴(kuò)增含目的基因的大片段，再用第二對(duì)引物（內(nèi)引物）以擴(kuò)增的大片段為模板進(jìn)行擴(kuò)增的方式，稱筑巢PCR。進(jìn)行筑巢PCR時(shí)，外引物設(shè)計(jì)得比內(nèi)引物長(zhǎng)一些，且用量較少，采用較高退火溫度使內(nèi)引物不能與模板結(jié)合，故只有外引物擴(kuò)增。待外引物用盡后，降低退火溫度即可直接進(jìn)行內(nèi)引物的擴(kuò)增。筑巢PCR特點(diǎn)：筑巢PCR擴(kuò)增時(shí)，對(duì)目的DNA的特異性高且適合于極少量模板的擴(kuò)增。4/2/202431筑巢PCR用兩對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增。第一對(duì)引物（外5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’35’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’3’5’3’5’3’5’3’5’4/2/2024325’3’3’5’5’3’3’5’5’3’35’3’5’3’5共享引物PCR

共享引物PCR利用3條引物擴(kuò)增兩種不同的DNA序列，其中一條引物與兩種待擴(kuò)增序列都互補(bǔ)，與另兩條引物共同組成兩對(duì)引物。這種PCR方法常用于細(xì)菌學(xué)鑒定，確定同一種屬細(xì)菌的不同種類。4/2/202433共享引物PCR共享引多重PCR多重PCR是在一次反應(yīng)中加入多對(duì)引物，同時(shí)擴(kuò)增一份模板樣品中不同序列的PCR過(guò)程。擴(kuò)增時(shí)，不同引物擴(kuò)增模板的不同片段，得到的產(chǎn)物為模板不同部位、不同長(zhǎng)短的混合片段。因此，多重PCR適用于基因片段缺失、突變的檢測(cè)。PCR后，進(jìn)行電泳圖譜分析，即可找出缺失或突變的片段。back4/2/202434多重PCR多重PC不對(duì)稱PCR不對(duì)稱PCR是一種快速制備單鏈DNA的技術(shù)。目前DNA測(cè)序時(shí)，DNA樣品常用這種方法制備。

不對(duì)稱擴(kuò)增時(shí)，兩條引物鏈的比例相著較大，當(dāng)較少的引物用盡后，再進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，全部為單鏈DNA產(chǎn)物。4/2/202435不對(duì)稱PCR不對(duì)back4/2/202436back4/1/202436錨定PCR一般的PCR反應(yīng)，必須知道模板兩側(cè)的序列，以便設(shè)計(jì)引物。但在許多情況下，對(duì)模板兩側(cè)的序列并不清楚。對(duì)這樣的模板進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，可用錨定PCR技術(shù)。這一技術(shù)經(jīng)常用于未知cDNA的制備或低豐度cDNA文庫(kù)的構(gòu)建，而不適合于基因級(jí)DNA的擴(kuò)增。其原理為，在一通用引物反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的第一條cDNA3’加上同聚物尾（polyG），再用錨定引物（polyC）和通用引物進(jìn)行cDNA的擴(kuò)增。4/2/202437錨定PCR一般的PCR反back4/2/202438back4/1/202438反向PCR模板上某一序列是已知的，但我們想擴(kuò)增其兩側(cè)的片段，這種情況在PCR反應(yīng)中也會(huì)遇到，反向PCR就可以解決這一問(wèn)題。其方法是，用合適的限制酶對(duì)基因組DNA進(jìn)行消化，切除多余DNA后以已知序列DNA片段為核心進(jìn)行環(huán)化，然后再對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增。4/2/202439反向PCR模板上某一序列是back4/2/202440back4/1/202440彩色PCR

在進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)，將各種熒光物質(zhì)對(duì)引物5’端進(jìn)行標(biāo)記，擴(kuò)增后的產(chǎn)物帶有不同色彩的熒光染料，在激發(fā)燈的照射下可以發(fā)出不同的色彩。本法更適合于多重PCR對(duì)DNA突變或缺失，以及遺傳性疾病的基因基因診斷4/2/202441彩色PCR原位PCR原位PCR是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型PCR技術(shù)，是PCR技術(shù)和常規(guī)的原位雜交技術(shù)的結(jié)合，通過(guò)PCR技術(shù)對(duì)靶序列在染色體上或組織細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行原位擴(kuò)增，使其拷貝數(shù)大增，然后通過(guò)原位雜交方法檢測(cè)，從而對(duì)靶核酸進(jìn)行定性定位定量分析。原位PCR具有PCR的快速、靈敏、特異性強(qiáng)和原位雜交的定位精確的特點(diǎn)。4/2/202442原位PCR原位PCR原位PCR原位PCR的流程大致為：（1）染色體、細(xì)胞及組織切片樣品的制備。此階段中固定很重要，10%福爾馬林、4%的多聚甲醛溶液和酒精為常用固定劑；（2）PCR前處理：包括石蠟切片、去石蠟、染色體變性和細(xì)胞穿透；（3）PCR擴(kuò)增；（4）原位雜交及檢測(cè)。4/2/202443原位PCR原位PCR的流程大致為：（原位PCR原位PCR按檢測(cè)方法不同分為直接原位PCR和間接原位PCR，間接原位PCR是在PCR結(jié)束后，利用探針來(lái)探測(cè)專一性擴(kuò)增序列，特異性較高；直接原位PCR是在PCR中直接摻入標(biāo)記核苷酸，PCR結(jié)束后不必進(jìn)行原位雜交而直接檢測(cè)。該方法具有快速、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，但專一性往往不夠，容易產(chǎn)生假象，尤其在組織切片上進(jìn)行原位PCR。4/2/202444原位PCR原位PCR按檢測(cè)定量PCR是利用PCR定量檢測(cè)標(biāo)本中靶基因的拷貝數(shù)的技術(shù)，這在研究基因的擴(kuò)增等方面具有重要意義。該法是將目的基因和一個(gè)單拷貝的參照基因置于同一個(gè)試管中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物后呈兩條區(qū)帶。比較兩條區(qū)帶的豐度或在引物5’端標(biāo)記上放射性核素后，通過(guò)檢測(cè)兩條區(qū)帶放射性強(qiáng)度即可測(cè)出目的基因的拷貝數(shù)。4/2/202445定量PCR是利用PC定量PCR定量方法有幾種，最直接的是測(cè)定PCR產(chǎn)物中的標(biāo)記核苷酸或引物量，但使用標(biāo)記核苷酸會(huì)造成凝膠電泳時(shí)高背景，給測(cè)定帶來(lái)困難。而標(biāo)記引物法會(huì)產(chǎn)生引物二聚體和非特異性擴(kuò)增，直接測(cè)定有時(shí)會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。目前常用的是雜交技術(shù)，其中最常用的是同位素標(biāo)記探針對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行Southern雜交，然后對(duì)其放射活性進(jìn)行測(cè)定。4/2/202446定量PCR定量方法有PCR反應(yīng)比較靈敏，不少因素都會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。因此，在定量PCR時(shí)，要設(shè)內(nèi)參照。參照基因與待測(cè)基因在同一反應(yīng)試管內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目的基因和內(nèi)參照基因的PCR產(chǎn)物在凝膠電泳上分開(kāi)，起到校正作用。內(nèi)參照有兩種：一種是內(nèi)源性的，此基因在許多細(xì)胞中都表達(dá)，且水平較恒定；另一種是外源性的，是人工合成的RNA或DNA，正常情況下不存在于待測(cè)樣品中。4/2/202447PCR反應(yīng)比較靈敏，不少因素都會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影差異顯示PCR高等生物一般具有105個(gè)基因，但每個(gè)細(xì)胞或個(gè)體僅表達(dá)其中15%的基因，即約15000種mRNA，不同細(xì)胞間基因表達(dá)的差異決定了生命活動(dòng)的多樣性，如發(fā)育和分化、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、衰老和死亡等。正常的代謝過(guò)程或病理變化，不管是由單基因控制還是由多基因體系控制，本質(zhì)上都是基因表達(dá)改變所致。因此，比較研究細(xì)胞間基因表達(dá)的差異為我們揭示生命活動(dòng)的規(guī)律提供了依據(jù)。4/2/202448差異顯示PCR高等生物一般具

差異顯示PCR就是一種篩選和克隆受發(fā)育、突變各種因素影響下差異表達(dá)基因的方法。首先將所要比較的兩種mRNA樣品逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA第一鏈，然后利用3’錨定引物和5’隨機(jī)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。

一個(gè)理想的顯示技術(shù)應(yīng)具備兩個(gè)最基本的條件：（1）重復(fù)性好；（2）便于分離與鑒定。4/2/202449差異顯示PCR就是一種篩選和克隆受發(fā)育、突變?yōu)榱梭w現(xiàn)上述兩個(gè)基本條件，合成兩組引物，通過(guò)隨機(jī)組合，使15000種mRNA均有擴(kuò)增機(jī)會(huì)，并顯示出清楚的電泳帶。利用真核生物mRNA都有3’端的poly(A)，而在poly(A)前面的兩個(gè)堿基只有倒數(shù)第二位可為A，即：——AAAAAAAAAAAAAAAAAA的特點(diǎn)，把mRNA3’端引物設(shè)計(jì)成T12MN（M）不能為T，共有12種引物，分別對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，把mRNA分成12等份，每份將獲得1/12的cDNA亞群。再用隨機(jī)引物對(duì)cDNA亞群進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到能在測(cè)序膠上分辨的條帶，電泳后可以發(fā)現(xiàn)細(xì)胞群體中有差異的cDNA片段，這此有差異的片段就是差異表達(dá)基因的cDNA。4/2/202450為了體現(xiàn)上述兩個(gè)基本條件，合成兩組引物，通過(guò)完整工作程序4/2/202451完整工作程序4/1/202451重組PCR通過(guò)設(shè)計(jì)兩對(duì)部分重疊引物，將兩個(gè)基因分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。混合兩種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)變性和復(fù)性，兩組PCR產(chǎn)物通過(guò)互補(bǔ)序列發(fā)生粘連，其中一條重組雜合鏈可在PCR條件下發(fā)生延伸反應(yīng)產(chǎn)生睛個(gè)包含兩個(gè)不同基因的重組基因用重組PCR技術(shù)進(jìn)行基因融合可組建天然基因、合成基因及突變基因等。

4/2/202452重組PCR通過(guò)設(shè)計(jì)兩對(duì)部重組PCR方法示意圖5’4/2/202453重組PCR方法示意圖5’4/1/PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析凝膠電泳分析法：PCR產(chǎn)物可通過(guò)瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，后者靈敏度遠(yuǎn)高于前者，但配制方法復(fù)雜，故常用前者。在配制瓊脂糖時(shí)加入0.5μg/ml的溴化乙錠（EB）或電泳后凝膠用同樣濃度的EB染色20min，去離子水漂洗兩次，每次15min，于UV燈下觀察結(jié)果。

4/2/202454PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析凝膠電泳分析法：PCR產(chǎn)物可通過(guò)瓊脂糖PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析瓊脂糖凝膠電泳常用于臨床檢測(cè)（定性）聚丙烯酰胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好，條帶比較集中可用于科研及檢測(cè)分析4/2/202455PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析瓊脂糖凝膠電泳4/1/202455瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳是一種非常簡(jiǎn)便、快速、最常用的分離純化和鑒定核酸的方法瓊脂糖是從海藻中提取的一種線狀高聚物根據(jù)瓊?cè)芙鉁囟龋循傊欠譃橐话悱傊呛偷腿埸c(diǎn)瓊脂糖低熔點(diǎn)瓊脂糖熔點(diǎn)為62～65℃，溶解后在37℃下維持液體狀態(tài)約數(shù)小時(shí)，主要用于DNA片段的回收，質(zhì)粒與外源性DNA的快速連接等4/2/202456瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳是一種非常簡(jiǎn)便、快速、最常用的分凝膠濃度選擇瓊脂糖濃度(%)線型DNA分子的分離范圍(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2瓊脂糖凝膠的濃度與DNA分離范圍4/2/202457凝膠濃度選擇瓊脂糖濃度(%)線型DNA分子的分離范圍(Kb)電泳緩沖液

常用三種緩沖液Tris-硼酸（TBE）Tris-乙酸（TAE）Tris-磷酸（TPE）TBE與TPE：緩沖容量高，DNA分離效果好，但TPE在DNA片段回收時(shí)含磷酸鹽濃度高，容易使DNA沉淀TAE：緩沖容量低，但價(jià)格較便宜，因而推薦選用TAE。緩沖液中的EDTA可螯合二價(jià)陽(yáng)離子，從而抑制DNA酶的活性，防止PCR擴(kuò)增產(chǎn)物降解4/2/202458電泳緩沖液常用三種緩沖液4/1/20245810×TBE緩沖液的配制配方Tris108克EDTA9.3克硼酸55克H2O至1000mlpH應(yīng)為8.0～8.2臨用時(shí)用水稀至0.5×TBE（20倍稀釋）4/2/20245910×TBE緩沖液的配制配方4/1/202459核酸電泳的指示劑指示劑：溴酚蘭二甲苯青溴酚蘭：在堿性液體中呈紫蘭色電泳中，溴酚蘭的遷移率與雙鏈線性DNA片段瓊脂糖凝膠濃度0.6%1%1.4%2%遷移率1Kb0.6Kb0.2Kb0.15Kb4/2/202460核酸電泳的指示劑指示劑：瓊脂糖凝膠濃度0.6%1%1.4%2核酸電泳的指示劑二甲苯青：水溶液呈蘭色，電泳時(shí)，其遷移速率與雙鏈線性DNA大致相當(dāng)瓊脂糖凝膠濃度1%1.4%遷移率2Kb1.6Kb4/2/202461核酸電泳的指示劑二甲苯青：水溶液呈蘭色，瓊脂糖凝膠濃度1%1載樣緩沖液指示劑一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成載樣緩沖液作用：①增加樣品密度，使其比重增加，以確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)②在電泳中形成肉眼可見(jiàn)的指

示帶，可預(yù)測(cè)核酸電泳的速度和位置③使樣品呈色，使加樣操作更方便4/2/202462載樣緩沖液指示劑一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成載樣緩沖液核酸電泳的染色劑最常用的染色劑溴化乙錠銀染色4/2/202463核酸電泳的染色劑最常用的染色劑4/1/202463核酸電泳的染色劑溴化乙錠（ethidiumbromide，EB）是一種熒光染料，EB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對(duì)之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光可在凝膠電泳液中加入終濃度為0.5ug/ml的EB，有時(shí)亦可在電泳后，將凝膠浸入該濃度的溶液中染色10～15min瓊脂糖凝膠EB染色，肉眼可見(jiàn)核酸電泳帶，其DNA量一般>5ng溴化乙錠太多，凝膠染色過(guò)深，核酸電泳帶看不清時(shí)，可將凝膠放入蒸餾水浸泡30min后再觀察4/2/202464核酸電泳的染色劑溴化乙錠（ethidiumbromide，核酸電泳的染色劑銀染色：銀染色液中的銀離子(Ag+)可與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物，然后用還原劑如甲醛使Ag+還原成銀顆粒，可把核酸電泳帶染色黑褐色主要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳染色，也用于瓊脂糖凝膠染色靈敏度比EB高200倍，但銀染色后，DNA不宜回收4/2/202465核酸電泳的染色劑銀染色：銀染色液中的銀離子(Ag+)可與核酸電泳電泳裝置電泳儀電泳槽灌膠模具等4/2/202466電泳電泳裝置4/1/202466電泳槽水平平板垂直平板4/2/202467電泳槽水平平板4/1/2024674/2/2024684/1/2024684/2/2024694/1/2024694/2/2024704/1/202470電泳方法用蒸餾水將電泳槽和梳子沖洗干凈，放在水平桌面上，并架好梳子根據(jù)核酸分子量的大小配制不同濃度的瓊脂糖凝膠，一般200～400bp的DNA片段（可配制1.2～1.7%）4/2/202471電泳方法用蒸餾水將電泳槽和梳子沖洗干凈，放在水平桌面上，并架電泳方法

配制瓊脂糖凝膠及倒膠0.5×TBE電泳緩沖液100ml于三角燒瓶中，稱取一定量的瓊脂糖粉放入后沸水鍋或微波爐內(nèi)加熱熔化，冷卻至60℃(需要時(shí)可加入EB)，倒入電泳槽中，待凝固向電泳槽中倒入0.5×TBE，其量以沒(méi)過(guò)膠面2mm為宜，小心移去梳子（如樣品孔內(nèi)有氣泡，應(yīng)除去）4/2/202472電泳方法

配制瓊脂糖凝膠及倒膠0.5×TBE電泳緩沖液1004/2/2024734/1/202473電泳方法

上樣與通電在DNA樣品中加入0.2體積的載樣緩沖液，混勻后，加入樣品孔內(nèi)接通電源，一般紅色為正極黑色為負(fù)極，切記DNA樣品由負(fù)極往正極泳動(dòng)（靠近加樣孔的一端為負(fù)），電壓為1—5V/cm（長(zhǎng)度以兩個(gè)電極之間的距離計(jì)算）根據(jù)指示劑泳動(dòng)的位置，判斷是否終止電泳，一般200～400bp的PCR產(chǎn)物50V電壓，電泳20～40min4/2/202474電泳方法

上樣與通電在DNA樣品中加入0.2體積的載樣緩沖液電泳方法

結(jié)果觀察紫外儀上觀察電泳帶及其位置并與核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)比較被擴(kuò)增產(chǎn)物的大小4/2/202475電泳方法

結(jié)果觀察紫外儀上觀察電泳帶及其位置4/1/2024聚丙烯酰胺凝膠電泳適宜分離鑒定低分子量蛋白質(zhì)、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析其裝載的樣品量大，回收DNA純度高，長(zhǎng)度僅相差0.2%（即500bp中的1bp）的核苷酸分子即能分離4/2/202476聚丙烯酰胺凝膠電泳適宜分離鑒定低分子量蛋白質(zhì)、小于1Kb的D聚丙烯酰胺凝膠由丙烯酰胺單體，在催化劑TEMED（N，N，N，N‘一四甲基乙二胺）和過(guò)硫酸銨的作用下，丙烯酰胺聚合形成長(zhǎng)鏈，聚丙烯酰胺鏈在交聯(lián)劑，N，N'一亞甲雙丙烯酰胺參與下，聚丙烯胺鏈與鏈之間交叉聯(lián)接而形成凝膠聚丙烯酰胺凝膠孔徑的大小是由丙烯酰胺的濃度決定的4/2/202477聚丙烯酰胺凝膠由丙烯酰胺單體，在催化劑TEMED（N，N，N不同濃度丙烯酰胺和DNA有效分離范圍

丙烯酰胺（%）有效分離范圍（bp）溴酚蘭*二甲苯青*3.5100～20001004605.080～500652608.060～4004516012.040～200307015.025～150156020.010～10012454/2/202478不同濃度丙烯酰胺和DNA有效分離范圍丙烯酰胺有效分離范圍（材料電泳儀器：電泳儀垂直電泳槽及其附件.30%丙烯酰胺丙烯酰胺，29克N，N‘一亞甲基雙丙烯酰胺，1克H2O，加至100ml

裝于棕色瓶?jī)?nèi)，4℃可保存二個(gè)月4/2/202479材料電泳儀器：4/1/202479材料10%過(guò)硫酸銨過(guò)硫酰銨，1克，加水至10ml

4℃可保存一周，-20℃可保存一個(gè)月1×TBE電泳緩沖液TEMED（四甲基乙烯基二胺）4/2/202480材料10%過(guò)硫酸銨4/1/202480聚丙烯酰胺凝膠的制備與電泳配膠：根據(jù)分離DNA片段的大小及需凝膠的容積，配制聚丙烯酰胺凝膠按要求裝配好垂直電泳板，兩塊玻璃板的兩側(cè)及底部用1%的瓊脂糖封邊，防止封閉不嚴(yán)而使聚丙烯酰胺液漏出將裝好的玻璃電泳板傾斜成45～60℃角按表3配制所需%濃度凝膠的毫升數(shù)加入TEMED后，立即混勻，緩緩倒入兩玻璃板間的膠床中，直到液體接近溢出時(shí)為止4/2/202481聚丙烯酰胺凝膠的制備與電泳配膠：根據(jù)分離DNA片段的大小及需聚丙烯酰胺凝膠的制備與電泳立即插入適當(dāng)?shù)氖嶙?，密切注意防止梳齒下產(chǎn)生氣泡，用一有力

的夾將梳子夾在一邊的玻璃板上，然后將玻璃板斜靠在物體上，使成10°角，可減少液體泄漏的機(jī)會(huì)室溫聚合一小時(shí)后，將玻璃板插入電泳槽中，上緊，倒入0.1×TBE緩沖液4/2/202482聚丙烯酰胺凝膠的制備與電泳立即插入適當(dāng)?shù)氖嶙?，密切注意防止梳聚丙烯酰胺凝膠的制備與電泳小心取出梳子，立即用緩沖液沖洗加樣孔，因?yàn)槭嶙尤〕龊螅嶙由衔降募澳z頂部未聚合的丙烯酰胺會(huì)流入加樣孔內(nèi)聚合，產(chǎn)生不規(guī)則的表面，將導(dǎo)致以后DNA電泳帶型不規(guī)則將DNA樣品與適量的載樣緩沖液混勻后，加到樣品孔內(nèi)，加樣時(shí)不要產(chǎn)生氣泡4/2/202483聚丙烯酰胺凝膠的制備與電泳小心取出梳子，立即用緩沖液沖洗加樣聚丙烯酰胺凝膠的制備與電泳接好電極，電壓為1-8V/cm，進(jìn)行電泳電泳畢，切斷電源，取出膠床板，小心移去一塊玻璃板，讓凝膠吸附在另一塊玻璃板上，浸入含0.5ug/ml的溴化乙錠溶液中，15～30min后取出水洗，紫外儀下觀察結(jié)果聚丙烯酰胺凝膠電泳只能檢出>10ng以上量的DNA條帶（要求更高的靈敏度，可用銀染）4/2/202484聚丙烯酰胺凝膠的制備與電泳接好電極，電壓為1-8V/cm，進(jìn)4/2/2024854/1/2024854/2/2024864/1/202486酶切分析根據(jù)PCR產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)，用相應(yīng)的酶進(jìn)行酶切酶切產(chǎn)物電泳分離后，獲得符合理論的片段此法既能進(jìn)行產(chǎn)物的鑒定，又能對(duì)靶基因分型，還能進(jìn)行變異性研究4/2/202487酶切分析根據(jù)PCR產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)，用相應(yīng)的酶進(jìn)行酶分子雜交檢測(cè)PCR產(chǎn)物特異性的有力證據(jù)檢測(cè)PCR產(chǎn)物堿基突變的有效方法主要的雜交Southern印跡雜交斑點(diǎn)雜交4/2/202488分子雜交檢測(cè)PCR產(chǎn)物特異性的有力證據(jù)4/1/202488Southern印跡雜交：在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈并作標(biāo)記（探針）與PCR產(chǎn)物雜交此法既可作特異性鑒定，又可以提高檢測(cè)PCR產(chǎn)物的靈敏度，還可知其分子量及條帶形狀，主要用于科研。4/2/202489Southern印跡雜交：在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈并4/2/2024904/1/2024904/2/2024914/1/2024914/2/2024924/1/202492斑點(diǎn)雜交：將PCR產(chǎn)物點(diǎn)在硝酸纖維素膜或尼龍膜薄膜上寡核苷酸探針雜交觀察有無(wú)著色斑點(diǎn)主要用于PCR產(chǎn)物特異性鑒定及變異分析4/2/202493斑點(diǎn)雜交：將PCR產(chǎn)物點(diǎn)在硝酸纖維素膜或尼龍膜薄膜上4/14/2/2024944/1/2024944/2/2024954/1/2024954/2/2024964/1/2024964/2/2024974/1/202497PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析斑點(diǎn)雜交分析法：將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物固定于硝酸纖維素濾膜上，再用放射性或非放射性標(biāo)記物標(biāo)記的與產(chǎn)物部分或全長(zhǎng)核苷酸序列的探針進(jìn)行雜交。本法檢測(cè)靈敏度高且有助于檢測(cè)突變DNA的突變類型，常用于人類遺傳病診斷和某些基因的分析。常規(guī)使用時(shí)，用非放射性標(biāo)記的寡核苷酸探針?lè)治鯬CR產(chǎn)物，更加安全。4/2/202498PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析斑點(diǎn)雜交分析法：將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物固定于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析微孔板雜交法：夾心雜交法：將捕獲探針固定于微孔板上后，與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，然后再用標(biāo)記的檢測(cè)探針與產(chǎn)物的另一區(qū)域雜交，漂洗后觀察結(jié)果；直接將特異探針固定于微孔板上，然后用標(biāo)記的PCR產(chǎn)物與其進(jìn)行雜交后觀察結(jié)果。4/2/202499PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析微孔板雜交法：4/1/202499PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析微孔板雜交的基本過(guò)程包括：DNA固定、探針的雜交和酶聯(lián)顯色。關(guān)鍵在于DNA的固定。鹽濃度合適時(shí)DNA一端被固定在微孔板上，鹽濃度過(guò)高或過(guò)低都可使DNA平躺固定于孔內(nèi)而影響雜交。要用一系列鹽濃度進(jìn)行摸索以選擇最佳鹽濃度。4/2/2024100PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析微孔板雜交的基本過(guò)程包括：DNA固定、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析試劑：固定液：10mmol/L磷酸鈉10mmol/LEDTA,pH7.0合適濃度的NaCl漂洗液：PBS0.5%Tween204/2/2024101PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析試劑：4/1/2024101PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析操作方法（1）待固定DNA100℃加熱變性5