動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)

動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)

1精選PPT動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)

1精選PPT動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)

動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)是建立在貼壁培養(yǎng)法和懸浮培養(yǎng)法基礎(chǔ)上，再融合了固定化細(xì)胞、流式細(xì)胞術(shù)、填充床、生物反應(yīng)器技術(shù)以及人工灌流等技術(shù)而發(fā)展起來的。主要包括懸浮培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、微囊化培養(yǎng)、中空纖維法等。如今這一技術(shù)已廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代生物制藥的研究和生產(chǎn)中。它的應(yīng)用大大減少了用于疾病預(yù)防、治療和診斷的實(shí)驗(yàn)動物，為生產(chǎn)疫苗、細(xì)胞因子、生物產(chǎn)品乃至人造組織等產(chǎn)品提供了強(qiáng)有力的工具。

2精選PPT動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)

動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)是建立在貼壁1懸浮培養(yǎng)技術(shù)基本操作(1)將動物培養(yǎng)材料分散成細(xì)胞懸浮液\過濾、離心、純化、漂洗后接種到有適宜培養(yǎng)液的培養(yǎng)系統(tǒng)中。傳代時(shí)按比例稀釋即可繼續(xù)培養(yǎng)。3精選PPT1懸浮培養(yǎng)技術(shù)基本操作3精選PPT4精選PPT4精選PPT對貼壁性細(xì)胞，最初采用在培養(yǎng)液中加人一定數(shù)量的小滾瓶，增加細(xì)胞生長的貼壁面積。此方法構(gòu)造簡單，成本低，重復(fù)性好，放大過程可依靠滾瓶數(shù)量的增加。但產(chǎn)率低，勞動強(qiáng)度大，占空間大。微載體系統(tǒng)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，一定程度上改變了以上這些不足。微載體是直徑60—250um的微珠。2微載體培養(yǎng)技術(shù)5精選PPT對貼壁性細(xì)胞，最初采用在培養(yǎng)液中加人一定數(shù)量的小滾瓶，增加細(xì)理想的細(xì)胞支持物應(yīng)該具備特征：(1)生物相容性．(2)簡便的無毒害固定化過程。(3)良好的傳質(zhì)特性。(4)良好的機(jī)械穩(wěn)定性。(5)最大的比表面積。(6)適合細(xì)胞生長的形狀和大小。(7)粒徑分布均一。6精選PPT理想的細(xì)胞支持物應(yīng)該具備特征：(1)生物相容性．6精(8)能高壓滅菌。(9)可重復(fù)利用，易于清洗。(10)能保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷。(11)接種方便。(12)能固定大部分細(xì)胞。(13)適合大規(guī)模培養(yǎng)。(14)易使細(xì)胞、載體與培養(yǎng)基分離。(15)適合于貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)。7精選PPT(8)能高壓滅菌。7精選PPT微載體系統(tǒng)培養(yǎng)細(xì)胞的步驟是：(1)選擇合適的微載體類型(2)浸泡水化及消毒(3)接種(4)培養(yǎng)觀察與細(xì)胞記數(shù)(5)消化(通常用酶消化法)。8精選PPT微載體系統(tǒng)培養(yǎng)細(xì)胞的步驟是：(1)選擇合適的微載體類型8精選采用膠原酶消化比胰蛋白酶-EDTA法可獲得更完整的細(xì)胞膜和更高的細(xì)胞活性。膠原酶專一性好，不損傷細(xì)胞膜，效果較好。9精選PPT采用膠原酶消化比胰蛋白酶-EDTA法可獲得更完整的細(xì)胞膜和更(6)分離細(xì)胞：對于回收率要求不高的細(xì)胞種類，分組沉降簡單易行。脫離微載體的培養(yǎng)液放入細(xì)長容器，于上清液中分離收集細(xì)胞，400r／min，2min離心加速微載體沉淀。10精選PPT(6)分離細(xì)胞：對于回收率要求不高的細(xì)胞種類，分組沉降(7)傳代培養(yǎng)：如果進(jìn)行放大培養(yǎng)，可在細(xì)胞脫離微載體后，加入一些新的微載體以增大培養(yǎng)體積，提高培養(yǎng)液的利用率，不過此法比全部用新微載體的細(xì)胞得率要少。盡量減少培養(yǎng)液中Ca2+濃度可促進(jìn)微載體之間的細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

11精選PPT(7)傳代培養(yǎng)：如果進(jìn)行放大培養(yǎng)，可在細(xì)胞脫離微載體后除了交聯(lián)葡聚糖為基質(zhì)的微載體,還可采用以下微載體：1)纖維素為基質(zhì)微載體：2)蛋白質(zhì)為基質(zhì)微載體：變性膠原微載體，蛋黃色，表面特性好，易與細(xì)胞結(jié)合。3)高分子材料為基質(zhì)微載體：4)無機(jī)玻璃基質(zhì)微載體。

12精選PPT除了交聯(lián)葡聚糖為基質(zhì)的微載體,還可采用以下微載體：12精選P3多孔載體培養(yǎng)

一優(yōu)點(diǎn)降低血清用量，增加細(xì)胞固定性。大的生長空間，免受機(jī)械損傷，可以提高攪拌強(qiáng)度和通氣量，強(qiáng)化傳質(zhì)。多孔載體不僅能培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，也適合懸浮細(xì)胞的固定化連續(xù)灌流培養(yǎng)。多孔載體固定細(xì)胞過程簡單，對細(xì)胞無毒害和損傷，細(xì)胞可從長滿細(xì)胞的微載體中自動轉(zhuǎn)移到未長細(xì)胞的新載體上生長，接種方便，培養(yǎng)簡單，特別適合于反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)。13精選PPT3多孔載體培養(yǎng)

一優(yōu)點(diǎn)13精選PPT多孔載體制備的材料選擇主要考慮材料的生物相容性、機(jī)械穩(wěn)定性和熱穩(wěn)(1）生物相容性：材料對細(xì)胞必須無毒害，對貼壁細(xì)胞有良好的黏附作用。(2)機(jī)械穩(wěn)定性：微載體在長時(shí)間攪拌狀態(tài)下不破碎；同時(shí)滿足微載體清洗處理、回收利用的要求。(3)熱穩(wěn)定性：在121℃、蒸汽滅菌下不分解、不破碎、不軟化。14精選PPT多孔載體制備的材料選擇主要考慮材料的生物相容性、機(jī)械穩(wěn)定性和4微囊化培養(yǎng)技術(shù)微囊是一種用人造的半透膜制成的多孔微球體，小分子物質(zhì)可以自由透過，而各種酶、輔酶、離子交換劑、活性炭及蛋白等大分子物質(zhì)可包裹在其中不能逸出，利用它們催化反應(yīng)底物。微囊化培養(yǎng)是借鑒固定化技術(shù)將細(xì)胞包裹在微囊中，在培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)。細(xì)胞生長在各自的微小環(huán)境里受到一定的保護(hù)，細(xì)胞總的生長體積有了一定的增加，而且減少了攪拌對細(xì)胞產(chǎn)生的剪切力。微囊化培養(yǎng)為單克隆抗體、干擾素等生產(chǎn)提供了有效途徑。15精選PPT4微囊化培養(yǎng)技術(shù)微囊是一種用人造的半透膜制成的多孔微球體，5中空纖維法中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是理查德·克瑞克等在1972年發(fā)明的。最初使用的空心纖維是一種由醋酸纖維素和硝酸纖維素混合組成的可透性膜，表面有許多海綿狀多孔結(jié)構(gòu)。這樣，水分子、營養(yǎng)物質(zhì)和氣體可以透過，細(xì)胞也可在上面帖附生長。16精選PPT5中空纖維法16精選PPT中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)就是模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長的三維狀態(tài)，利用人工的“毛細(xì)血管”——中空纖維供給細(xì)胞生長的營養(yǎng)等條件。培養(yǎng)系統(tǒng)的核心部分由3-6層這樣的空心纖維組成，培養(yǎng)時(shí)將待培養(yǎng)細(xì)胞接種于空心纖維的外腔。培養(yǎng)一段時(shí)間后，逐漸用無血培養(yǎng)基代替含血培養(yǎng)基。此時(shí)雖然細(xì)胞不再增殖，但能正常生活并分泌所需的代謝產(chǎn)物。由手這種培養(yǎng)方法在分離和純化分泌物時(shí)比較方便，因而在生產(chǎn)激素和單抗時(shí)經(jīng)常采用。17精選PPT中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)就是模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長的三維狀態(tài)，利用人九動物細(xì)胞生物反應(yīng)器培養(yǎng)9．1生物反應(yīng)器的特點(diǎn)分析由于動物細(xì)胞沒有細(xì)胞壁、非常脆弱、對剪切敏感以及對體外培養(yǎng)環(huán)境有嚴(yán)格的要求，傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵反應(yīng)器不適用于動物細(xì)胞的大量培養(yǎng)，因而對動物細(xì)胞培養(yǎng)用反應(yīng)器的設(shè)計(jì)和過程控制提出了特殊的要求。細(xì)胞培養(yǎng)用生物反應(yīng)器的種類越來越多，規(guī)模也越來越大，反應(yīng)器的主要結(jié)構(gòu)形式仍以攪拌式、氣升式和固定床為主。18精選PPT九動物細(xì)胞生物反應(yīng)器培養(yǎng)9．1生物反應(yīng)器的特點(diǎn)分析18用于動物細(xì)胞與組織培養(yǎng)的

生物反應(yīng)器應(yīng)具備的基本要求：(1)混合系統(tǒng)設(shè)計(jì)應(yīng)能提供均勻、溫和的混合狀態(tài)，剪切力小，保證良好的傳質(zhì)效果。(2)反應(yīng)器內(nèi)空間利用率高，選用合適的載體系統(tǒng)和材料。(3)能嚴(yán)格保證無菌環(huán)境。(4)能精確地控制溫度、酸堿度、溶解氧和C02濃度等條件。(5)能夠方便地實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)液的連續(xù)添加、樣品的采樣和觀察。19精選PPT用于動物細(xì)胞與組織培養(yǎng)的

生物反應(yīng)器應(yīng)具備的基本要求：9．2生物反應(yīng)器應(yīng)用概況

采用生物反應(yīng)器進(jìn)行動物細(xì)胞培養(yǎng)是一種有效的途徑。但是，由于動物細(xì)胞、組織的多樣性，使得在培養(yǎng)材料、培養(yǎng)環(huán)境等方面千差萬別，因此，如何根據(jù)培養(yǎng)對象體內(nèi)生存環(huán)境的特點(diǎn)，開發(fā)合適的生物反應(yīng)器模擬體內(nèi)營養(yǎng)與環(huán)境進(jìn)行高效離體培養(yǎng)，并對培養(yǎng)條件、工藝等進(jìn)行優(yōu)化將是重要的研究課題。動物細(xì)胞培養(yǎng)用生物反應(yīng)器一般有微載體式、中空纖維式、灌注培養(yǎng)式、旋轉(zhuǎn)壁式等，幾種新型的反應(yīng)器類型特點(diǎn)介紹如下：20精選PPT9．2生物反應(yīng)器應(yīng)用概況

采用生物反應(yīng)器進(jìn)行動物細(xì)胞培養(yǎng)(一)柱狀中空纖維反應(yīng)器中空纖維細(xì)胞反應(yīng)器主體是由微孔中空纖維管束制成的，纖維束由外殼包裹，因此可分為殼體空間及管體空間兩部分，每部分各有其進(jìn)出口。一般講，細(xì)胞生長在殼體部分，新鮮培養(yǎng)液從殼體部分導(dǎo)人，氣體在管體部分通過，其中一部分則均勻地?cái)U(kuò)散至殼體部分。殼體部分的細(xì)胞如是附壁性的，則附著在纖維外側(cè)，在培養(yǎng)結(jié)束后用胰蛋白酶消化液將其消化并沖出：若是非附壁性的應(yīng)采用微濾材料將其截留在殼體內(nèi)而讓廢培養(yǎng)液排出。21精選PPT(一)柱狀中空纖維反應(yīng)器中空纖維細(xì)胞反應(yīng)器主體是由微(二)板框式中空纖維反應(yīng)器因柱狀中空纖維反應(yīng)器中營養(yǎng)供應(yīng)和代謝產(chǎn)物會存在濃度梯度，所以細(xì)胞分布受到影響而不均勻。人們開發(fā)出板框式中空纖維反應(yīng)器。該反應(yīng)器的中心是一束中空纖維淺床，置于兩個(gè)不銹鋼微孔濾板之間。22精選PPT(二)板框式中空纖維反應(yīng)器因柱狀中空纖維反應(yīng)器中營養(yǎng)供應(yīng)板框式中空纖維反應(yīng)器

液營養(yǎng)

中空纖維板23精選PPT板框式中空纖維反應(yīng)器液營養(yǎng)中空纖維板23精三、中心灌流式反應(yīng)器24精選PPT三、中心灌流式反應(yīng)器24精選PPT四、灌流微載體生物反應(yīng)器25精選PPT四、灌流微載體生物反應(yīng)器25精選PPT(五)旋轉(zhuǎn)壁式反應(yīng)器一般由水平放置的內(nèi)外兩個(gè)同心圓柱組成。靜態(tài)的內(nèi)柱由半透膜構(gòu)成，使氣體可以通過該膜進(jìn)行交換。旋轉(zhuǎn)的外柱由非通透性材料制成。26精選PPT(五)旋轉(zhuǎn)壁式反應(yīng)器一般由水平放置的內(nèi)外兩個(gè)同心圓柱組成。靜10生物反應(yīng)器動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)1.病毒疫苗2.非抗體免疫調(diào)節(jié)劑3.多肽生長因子4.酶類5.激素6.腫瘤特異性抗原7.單克隆抗體8.病毒殺蟲劑27精選PPT10生物反應(yīng)器動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)1.病毒疫苗27精選PPT注意幾個(gè)問題：

(一)細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境(1)氨離子：細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中抑制因素的積聚是提高細(xì)胞密度的主要限制因素。(2)乳酸：(3)二氧化碳：二氧化碳積聚，對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用或者改變細(xì)胞代謝水平。(4)甲基乙二醛(Mc)：(5)滲透壓：(6)載體：可考慮采用多孔敬載體替代容易使細(xì)胞受機(jī)械攪拌與噴氣損傷的常規(guī)載體。28精選PPT注意幾個(gè)問題：

(一)細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境28精選PPT(二)細(xì)胞死亡與凋亡

大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的后期，維持細(xì)胞高的活力是個(gè)富有挑戰(zhàn)性的課題。最初的研究似乎表明細(xì)胞死亡大多由于壞死，而人們逐漸認(rèn)識到至少是一些細(xì)胞系在生物反應(yīng)器中死亡主要原因是細(xì)胞凋亡。

用基因工程方法將bcl—2基因這種細(xì)胞凋亡抑制基因?qū)爰?xì)胞。bcl—2基因的過量表達(dá)能抑制細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞密度和目的蛋白產(chǎn)量。大規(guī)模動物細(xì)胞培養(yǎng)條件下，可通過“細(xì)胞靜止”過程來降低營養(yǎng)成分消耗和代謝毒物產(chǎn)生。

29精選PPT(二)細(xì)胞死亡與凋亡

大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的后期，維持細(xì)胞高

(三)培養(yǎng)基與細(xì)胞系

動物細(xì)胞培養(yǎng)基是細(xì)胞賴以生長、增殖的重要因素。天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基后，無血清培養(yǎng)基開發(fā)成為當(dāng)今細(xì)胞領(lǐng)域的一大課題。無血清培養(yǎng)基的優(yōu)勢在于避免血清的批次、質(zhì)量、成分等對細(xì)胞造成的污染、毒性和不利于產(chǎn)品純化等不良影響。在生產(chǎn)疫苗、單抗和各種生物活性蛋白等生物制品的應(yīng)用領(lǐng)域中，優(yōu)化無血清培養(yǎng)基的成分可使不同的細(xì)胞在最有利于細(xì)胞生長和表達(dá)目的產(chǎn)物的環(huán)境中維持高密度培養(yǎng)。30精選PPT(三)培養(yǎng)基與細(xì)胞系

動物細(xì)胞培養(yǎng)基是細(xì)胞賴以生(四)過程監(jiān)控測量在線氧吸收速率確定從細(xì)胞生長期生產(chǎn)病毒到病毒感染期和細(xì)胞死亡后終止感染的轉(zhuǎn)換時(shí)間；用在線葡萄糖分析儀的測定調(diào)整灌流速度；測定氧消耗估計(jì)營養(yǎng)供應(yīng)率的代謝負(fù)荷；測定氧吸收速率估測ATP的形成；測量在線氧化還原能力作為活細(xì)胞濃度的指標(biāo)等均得以應(yīng)用。31精選PPT(四)過程監(jiān)控測量在線氧吸收速率確定從細(xì)胞生長期生產(chǎn)病毒到病測定在線氧吸收速率并用質(zhì)譜儀分析廢氣中二氧化碳呼出率計(jì)算呼吸商。一般來說，呼吸商應(yīng)接近1.0，這就要求細(xì)胞培養(yǎng)中盡量降低氧消耗和二氧化碳排出。用親和層析與在線取樣系統(tǒng)偶聯(lián)進(jìn)行在線蛋白質(zhì)含量測定。另外，用在線蛋白分解與反相色譜監(jiān)測重組蛋白的糖基化以了解產(chǎn)品的一致性。32精選PPT測定在線氧吸收速率并用質(zhì)譜儀分析廢氣中二氧化碳呼出率計(jì)算呼吸計(jì)數(shù)法(細(xì)胞運(yùn)輸)

當(dāng)前培養(yǎng)細(xì)胞既在國內(nèi)進(jìn)行寄贈、交換和購買，也在國際交流，為此需要裝運(yùn)細(xì)胞的方法。

一種是用液氮或干冰貯存運(yùn)輸，需要特殊容器，較麻煩，且不適于長時(shí)間運(yùn)行。另一方法為充液法，方便當(dāng)行，是當(dāng)前多采用的方法。

具體方法：選生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，待培養(yǎng)近單層后，去掉培養(yǎng)液充滿新培養(yǎng)液。液量要達(dá)培養(yǎng)瓶頸部，擰緊螺帽或塞一吸塞，保留微量空氣?？諝饬袅窟^多，運(yùn)輸時(shí)大氣泡來回流動對細(xì)胞有干擾作用。

一般經(jīng)4～5天運(yùn)輸對細(xì)胞活力無大影響。時(shí)間過長,細(xì)胞活力下降。到達(dá)后，倒出大部分培養(yǎng)液，保留維持細(xì)胞生長所需的液體量。置37攝氏度培養(yǎng)，

次日傳代。33精選PPT計(jì)數(shù)法(細(xì)胞運(yùn)輸)當(dāng)前培養(yǎng)細(xì)胞既在國內(nèi)進(jìn)行寄贈、交換和十一動物細(xì)胞體外培養(yǎng)舉例

腫瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)與建系過程體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的歷史一定程度上代表了動物細(xì)胞體外培養(yǎng)的發(fā)展歷史。1952年，蓋爾(Gey)首先成功地建立世界上第一個(gè)細(xì)胞系——子宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞系，并且使惡性腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)從間葉組織源性的細(xì)胞轉(zhuǎn)向上皮源性細(xì)胞。34精選PPT十一動物細(xì)胞體外培養(yǎng)舉例

腫瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)與建系過程34

腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展成就主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：(1)在培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞類型上，從間充質(zhì)源性的細(xì)胞轉(zhuǎn)向上皮源性細(xì)胞，再由神經(jīng)外胚層源性到造血細(xì)胞源