細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇

關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)活細(xì)胞：長時間、直接觀察、研究活細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生命活動可控制：選擇特定的細(xì)胞種類、性質(zhì)、階段可控制調(diào)節(jié)條件：物理、化學(xué)、生物等可采用各種研究技術(shù)、記錄方法樣品均一性：來源于同一組織同一種細(xì)胞經(jīng)濟(jì)、規(guī)模第2頁,共112頁，2024年2月25日，星期天局限性人工模擬的條件和體內(nèi)實(shí)際情況仍不完全相同缺乏體內(nèi)的系統(tǒng)作用、失去神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞相互間的影響體外培養(yǎng)的細(xì)胞生活在缺乏動態(tài)平衡的環(huán)境環(huán)境中，必然發(fā)生變化。第3頁,共112頁，2024年2月25日，星期天本章主要內(nèi)容細(xì)胞培養(yǎng)的基本操作技術(shù)原代培養(yǎng)(primaryculture)傳代培養(yǎng)(subculture)體外培養(yǎng)細(xì)胞的影響因素細(xì)胞培養(yǎng)污染及對策培養(yǎng)細(xì)胞的生長測定方法細(xì)胞凍存和復(fù)蘇第4頁,共112頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞培養(yǎng)中的常用術(shù)語組織培養(yǎng)(TissueCulture)：指的是從體內(nèi)取出組織，模擬體內(nèi)生理環(huán)境，使之生存和生長并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。器官培養(yǎng)（OrganCulture）：培養(yǎng)的是器官的原基、器官的一部分或整個器官，使之在體外生存、生長和保持一定功能的方法。細(xì)胞培養(yǎng)(CellCulture)：培養(yǎng)物是單個細(xì)胞和細(xì)胞群。第5頁,共112頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞培養(yǎng)中的常用術(shù)語原代培養(yǎng)（primaryculture）：從體內(nèi)取出細(xì)胞或組織的第一次培養(yǎng)。傳代（passage）也稱再培養(yǎng)。無論是否稀釋，將細(xì)胞從一個培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移或移植到另一個培養(yǎng)瓶即稱為傳代或傳代培養(yǎng)。也稱再培養(yǎng)。細(xì)胞系（cellline）：原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后即為細(xì)胞系第6頁,共112頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞培養(yǎng)中的常用術(shù)語細(xì)胞株（cellstrain）：通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志的培養(yǎng)物稱細(xì)胞株。匯合（confluent）：細(xì)胞相互連接成片占據(jù)所有底物面積。接觸抑制（contactinhibition）：細(xì)胞匯合相互接觸后失去運(yùn)動的現(xiàn)象第7頁,共112頁，2024年2月25日，星期天一、細(xì)胞培養(yǎng)基本操作技術(shù)由于體外培養(yǎng)的細(xì)胞沒有抗感染能力，因此防污染是決定培養(yǎng)成功的首要條件。一切操作需要保證無菌和有條不紊。第8頁,共112頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)前準(zhǔn)備制定好實(shí)驗(yàn)計劃和操作程序有關(guān)數(shù)據(jù)的計算要事先做好。準(zhǔn)備各種所需器材和物品，清點(diǎn)無誤后將其放置在操作場所(培養(yǎng)室、超凈臺)內(nèi)，然后開始消毒。避免開始實(shí)驗(yàn)后，因物品不全往返拿取而增加污染機(jī)會。第9頁,共112頁，2024年2月25日，星期天消毒地面每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面—次(拖布要專用)，紫外線照射消毒30-50min超凈工作臺臺面每次實(shí)驗(yàn)前要用75％酒精擦洗。然后紫外線消毒30min。消毒時工作臺面上用品布局合理，不要過多或重疊放置，否則會遮擋射線降低消毒效果。一些操作用具如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺內(nèi)同時紫外線消毒。第10頁,共112頁，2024年2月25日，星期天洗手和著裝原則上和外科手術(shù)相同。僅做觀察不做培養(yǎng)操作時，可穿著細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)紫外線照射30min的清潔工作服在利用超凈臺工作時，因整個前臂要伸入箱內(nèi)，應(yīng)著長袖的清潔工作服，并于開始操作前要用75％酒精消毒手。進(jìn)入原代培養(yǎng)室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽。專用鞋或帶鞋套第11頁,共112頁，2024年2月25日，星期天火焰消毒在無菌環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)或做其它無菌工作時，首先要點(diǎn)燃酒精燈。按裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進(jìn)行。如實(shí)驗(yàn)用品需火焰滅菌，冷卻后接觸培養(yǎng)細(xì)胞，以防燒死細(xì)胞。

第12頁,共112頁，2024年2月25日，星期天操作進(jìn)行培養(yǎng)時，動作要準(zhǔn)確敏捷不能太快，否則空氣流動增加污染機(jī)會。不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。第13頁,共112頁，2024年2月25日，星期天組織細(xì)胞取材及培養(yǎng)的基本要求取材的組織用培養(yǎng)液浸泡，4℃運(yùn)送，24h內(nèi)盡快培養(yǎng)。取材時應(yīng)嚴(yán)格無菌操作，避免對組織的機(jī)械損傷，盡量去除脂肪、神經(jīng)、結(jié)締、壞死組織，污染組織可用青鏈霉素和制霉菌素漂洗。原代培養(yǎng)，特別是正常細(xì)胞的培養(yǎng)，應(yīng)采用營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)液。一般來講,胚胎組織較成熟個體的組織容易培養(yǎng);分化低的較分化高的組織容易生長;腫瘤組織較正常組織容易培養(yǎng)。取材時應(yīng)盡量選用易培養(yǎng)的組織進(jìn)行培養(yǎng)。為了便于以后鑒別原代組織的來源和觀察細(xì)胞體外培養(yǎng)與原組織的差異性，原代取材同時保留組織學(xué)和電鏡標(biāo)本，對供體來源、部位及一般情況做記錄。第14頁,共112頁，2024年2月25日，星期天組織材料的分離機(jī)械法：適于較柔軟的組織，如腦、脾、淋巴結(jié)、胸腺等。剪切組織為1mm3碎塊后，置于組織勻漿器研磨或用注射器針芯擠壓后過不銹鋼篩網(wǎng)。化學(xué)法：胰蛋白酶、膠原酶、EDTA法細(xì)胞懸液的分離方法：低速離心法、密度梯度離心法第15頁,共112頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞懸液的分離方法低速離心法：血液和體液等細(xì)胞懸液500-1000rpm離心5-10min。離心速度過大、時間過長，會造成細(xì)胞損傷和死亡。密度梯度離心法：用離心法將細(xì)胞分到不同密度的梯度介質(zhì)中，再分別吸出各層細(xì)胞。適于分離密度不等的細(xì)胞。常用介質(zhì)有Ficoll400，Percoll，泛影葡胺等。第16頁,共112頁，2024年2月25日，星期天胰蛋白酶（Trypsin）對細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，使細(xì)胞離散。消化效果與PH值、溫度、酶濃度和組織塊大小與硬度有關(guān)。適于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，能有效地分離肝、腎、甲狀腺、羊膜、胚胎組織、上皮組織等。而對含結(jié)締組織較豐富的組織，如乳腺、滑膜、子宮、纖維肉瘤、腫瘤組織等無效．但若與膠原酶合用能增加其對組織的分離作用。鈣鎂離子和血清抑制其活性。常用劑量為0.25%，PH8，溫度37℃第17頁,共112頁，2024年2月25日，星期天膠原酶法（collagenase）水解結(jié)締組織中膠原蛋白成分，對上皮細(xì)胞影響不大。產(chǎn)品有ⅣⅦⅨ等型，分別適用于分離肝細(xì)胞、胰島、脂肪細(xì)胞及纖維組織。鈣鎂離子和血清不影響活性，PH6.5-7常用劑量為200U/ml第18頁,共112頁，2024年2月25日，星期天第19頁,共112頁，2024年2月25日，星期天EDTA法EDTA能與細(xì)胞上的鈣、鎂離子結(jié)合形成整合物，利用結(jié)合后的機(jī)械力使細(xì)胞變圓而分散細(xì)胞或使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫離。缺點(diǎn)是細(xì)胞易裂解或貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫離時呈片狀，有團(tuán)塊，常不單獨(dú)使用，可與胰蛋白酶混合使用(1：1或2：1)，既利于細(xì)胞脫壁又利于細(xì)胞分散?？山档鸵让傅挠昧亢投拘宰饔?。EDTA工作液的濃度為0.02％，用不含鈣、鎂PBS配制。第20頁,共112頁，2024年2月25日，星期天二、原代培養(yǎng)(primaryculture)從直接取自生物體細(xì)胞、組織或器官開始的培養(yǎng)，即將動物機(jī)體的各種組織從機(jī)體中取出，經(jīng)各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用EDTA）或機(jī)械方法處理，分散成單細(xì)胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長和繁殖的過程。第21頁,共112頁，2024年2月25日，星期天原代培養(yǎng)細(xì)胞組織和細(xì)胞剛剛離體，生物學(xué)特性未發(fā)生很大變化，仍具有二倍體遺傳性，最接近和反映體內(nèi)生長特性，是藥物測試、細(xì)胞分化等實(shí)驗(yàn)的很好對象；原代細(xì)胞培養(yǎng)也是建立各種細(xì)胞系（cellline)或細(xì)胞株（cellstrain）必須經(jīng)過的階段。原代細(xì)胞培養(yǎng)多由各種細(xì)胞成分組成，比較復(fù)雜，即使是經(jīng)過處理后的細(xì)胞，也仍具有異質(zhì)性（heterogeneous),主要表現(xiàn)在細(xì)胞形態(tài)和大小不一第22頁,共112頁，2024年2月25日，星期天原代培養(yǎng)的方法懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法器官培養(yǎng)法組織塊培養(yǎng)法細(xì)胞培養(yǎng)法第23頁,共112頁，2024年2月25日，星期天懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法對于懸浮生長的細(xì)胞．如白血病細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、胸水和腹水中的癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞無須消化，可采用低速離心分離,直接培養(yǎng)。第24頁,共112頁，2024年2月25日，星期天器官培養(yǎng)(organculture)指組織、器官原基，以至整個器官或其一部分在體外的維持或生長，它們可以分化與保持原來的結(jié)構(gòu)與功能。第25頁,共112頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞培養(yǎng)法方法與步驟1)動物處死：將出生2～3d乳鼠，用脫頸方法處死。用酒精棉球擦拭解剖部位。2)取材及剪切：在無菌條件下將組織取出，置于無菌培養(yǎng)皿中，剪去多余的組織（脂肪等），用PBS液洗滌1-2次；放入另一培養(yǎng)皿中，將組織剪成1mm3大小的塊。第26頁,共112頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞培養(yǎng)法方法與步驟3)消化及分散組織塊：將上述清洗過的組織放入無菌試管內(nèi)，加入5～6倍量的0.25％胰蛋白酶液（pH7.4～7.6），置37℃水浴中消化20～40min，每隔10min搖動一次，直到組織塊變得疏松，粘稠，且顏色略變?yōu)榘咨珵橹?。取出試管，加?ml培養(yǎng)液，用吸管反復(fù)吹打組織塊，使其分散成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液用兩層滅菌紗布過濾至另一燒杯中。第27頁,共112頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞培養(yǎng)法方法與步驟4)計數(shù)與稀釋:從過濾的細(xì)胞懸液中取出適量滴于血細(xì)胞計數(shù)板上，按白細(xì)胞計數(shù)法進(jìn)行計數(shù)；計數(shù)后用培養(yǎng)液稀釋，稀釋后的濃度一般以每毫升含3～5×105個細(xì)胞為宜。5)分裝與培養(yǎng)：將稀釋好的細(xì)胞懸液分裝于細(xì)胞培養(yǎng)瓶or培養(yǎng)皿中，蓋好，做好標(biāo)記，置于37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6)觀察：逐日檢查培養(yǎng)物是否污染，觀察細(xì)胞生長情況。待細(xì)胞已基本長成致密單層時，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。第28頁,共112頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞培養(yǎng)法注意事項(xiàng)取材的組織最好盡快培養(yǎng)，若不能及時培養(yǎng)，可將組織浸泡于培養(yǎng)液內(nèi)放置于冰浴或40C冰箱。若組織塊很大，應(yīng)先將其切成1cm2以下的小塊再低溫保存，但時間不能超過24小時，因放置時間長或組織塊太大都易造成細(xì)胞的死亡；取材時嚴(yán)格無菌操作。用預(yù)先消毒好的器皿和帶有少量培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶進(jìn)行取材。所取組織要盡量避免紫外線照射或接觸任何化學(xué)試劑及有害藥物如碘、汞等。3.取材時要細(xì)心去除組織中的血液、結(jié)締組織、脂肪及壞死組織等。修剪和切碎過程中，為避免組織干燥，可將其浸泡于少量培養(yǎng)液中；第29頁,共112頁，2024年2月25日，星期天組織塊培養(yǎng)法組織塊培養(yǎng)是常用、簡便易行和成功率較高的原代培養(yǎng)方法，也是早期采用培養(yǎng)細(xì)胞的方法，故也被稱為組織培養(yǎng)(tissueculture)。第30頁,共112頁，2024年2月25日，星期天組織塊培養(yǎng)法(1)取材、修剪、組織剪或切成1mm3左右的小塊。(2)將剪切好的組織小塊用眼科鑷送入培養(yǎng)瓶內(nèi)。25ml培養(yǎng)瓶(底面積約為17.5cm2）以20一30小塊為宜。(3)放置2—4h待組織小塊貼附后．將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放、靜止培養(yǎng)第31頁,共112頁，2024年2月25日，星期天注意事項(xiàng)組織塊接種后l-3天，游出細(xì)胞數(shù)很少,組織塊的粘貼不牢固。觀察、移動過程中要注意動作輕巧。盡量不要引起液體的振蕩而產(chǎn)生對組織塊的沖擊力使其漂起。在原代培養(yǎng)的1-2d內(nèi)要持別注意觀察，是否有細(xì)菌、霉菌的污染。一旦發(fā)現(xiàn)，要及時清除，以防給培養(yǎng)箱內(nèi)的其它細(xì)胞帶來污染。原代培養(yǎng)3-5d需換液一次，去除漂浮的組織塊和殘留的血細(xì)胞，以免影響原代細(xì)胞的生長。第32頁,共112頁，2024年2月25日，星期天幾種細(xì)胞的原代培養(yǎng)圖示1.細(xì)胞種類：人肺部成纖維細(xì)胞；2.培養(yǎng)的天數(shù)：2d->4d->7d;3.放大倍數(shù)：200倍；4.培養(yǎng)基種類：1640+10%胎牛血清；5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡述:細(xì)胞呈梭形，貼壁生長;第33頁,共112頁，2024年2月25日，星期天幾種細(xì)胞的原代培養(yǎng)圖示1.細(xì)胞種類：小鼠胚胎成纖維細(xì)胞

2.培養(yǎng)的天數(shù)：4d；

3.放大倍數(shù)：倒置顯微鏡；

4.培養(yǎng)基種類：1640+10%X小牛血清；5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡述:細(xì)胞呈長梭形，貼壁生長第34頁,共112頁，2024年2月25日，星期天幾種細(xì)胞的原代培養(yǎng)圖示神經(jīng)元原代培養(yǎng):神經(jīng)元是高度分化的細(xì)胞,在體外培養(yǎng)條件下難以增殖.因此,目前神經(jīng)元的培養(yǎng)主要用于原代培養(yǎng).

神經(jīng)元胞體呈圓形或長桿狀,核大而圓,核仁明顯.可見有細(xì)小突起從胞體長出.

培養(yǎng)液中需加入高濃度的葡萄糖,以利于神經(jīng)元的生長.第35頁,共112頁，2024年2月25日，星期天三、傳代培養(yǎng)(passageorsubculture)細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，已基本上飽和，為使細(xì)胞能繼續(xù)生長，同時也將細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)大，就必須進(jìn)行傳代（再培養(yǎng)）。不論是否稀釋，將細(xì)胞以一個培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移或移植到另一個培養(yǎng)瓶即稱為傳代或傳代培養(yǎng)(passage)。第36頁,共112頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞的傳代培養(yǎng)根據(jù)細(xì)胞生長的特點(diǎn)，傳代方法有2種。懸浮生長細(xì)胞傳代離心法傳代：離心（1000rpm）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時，將上清培養(yǎng)液去除l／2～2／3，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。第37頁,共112頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞的傳代培養(yǎng)貼壁生長細(xì)胞傳代采用酶消化法傳代。在傳代時，需要用胰蛋白酶將細(xì)胞消化，使其從支持物上脫落，或用EDTA溶液與胰蛋白酶按1：1或2：1比例混合后聯(lián)合使用。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。第38頁,共112頁，2024年2月25日，星期天

Optimalconfluencyformovingcellstoanewdishis70-80%toolow,cellswillbeinlagphaseandwon’tproliferateToohighandcellsmayundergounfavorablechangesandwillbedifficulttoremovefromplate第39頁,共112頁，2024年2月25日，星期天貼壁生長細(xì)胞傳代方法第40頁,共112頁，2024年2月25日，星期天酶消化過程第41頁,共112頁，2024年2月25日，星期天酶消化過程第42頁,共112頁，2024年2月25日，星期天注意問題操作全過程注意無菌操作胰酶消化時間要適度吹打細(xì)胞時用力要適度，盡量減少氣泡第43頁,共112頁，2024年2月25日，星期天貼壁生長細(xì)胞的生長過程游離期貼壁期潛伏期對數(shù)生長期停止期（平臺期）第44頁,共112頁，2024年2月25日，星期天游離期細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)，也稱懸浮期細(xì)胞質(zhì)回縮，胞質(zhì)呈圓球形10分鐘-4小時第45頁,共112頁，2024年2月25日，星期天貼壁期細(xì)胞附著于底物上，游離期結(jié)束。底物：膠原、玻璃、塑料等細(xì)胞株平均在10分鐘-4小時貼壁血清中有促使細(xì)胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白。進(jìn)口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長基質(zhì)（化學(xué)合成的功能基團(tuán)）第46頁,共112頁，2024年2月25日，星期天潛伏期、對數(shù)生長期、停止期潛伏期：細(xì)胞有生長活動，而無細(xì)胞分裂，細(xì)胞株潛伏期一般為6-24小時。對數(shù)生長期：細(xì)胞數(shù)隨時間變化成倍增長，活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。停止期：細(xì)胞長滿瓶壁，雖有活力但不再分裂，機(jī)制為接觸抑制、密度依賴性。第47頁,共112頁，2024年2月25日，星期天第48頁,共112頁，2024年2月25日，星期天四、影響體外培養(yǎng)細(xì)胞的因素組織和細(xì)胞供體年齡培養(yǎng)條件細(xì)胞的粘附培養(yǎng)技術(shù)方法促生長因子第49頁,共112頁，2024年2月25日，星期天組織和細(xì)胞供體年齡幼年個體比老年者易于培養(yǎng)，所有動物的胚胎組織都是最好的培養(yǎng)對象。來自同一個體的組織，分化低的比分化高的容易培養(yǎng)。第50頁,共112頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)條件不同的細(xì)胞對培養(yǎng)基需求不同，當(dāng)前尚無一種培養(yǎng)基是萬能的，應(yīng)選擇相應(yīng)的培養(yǎng)基。應(yīng)了解所培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)性狀和特殊需求成分。細(xì)胞在體外進(jìn)行培養(yǎng)，失去了機(jī)體的調(diào)節(jié)和控制。因此，除滿足營養(yǎng)的要求外，還必須使細(xì)胞生存環(huán)境盡量接近活體的環(huán)境。外環(huán)境的培養(yǎng)條件如溫度、滲透壓、氣體環(huán)境、PH值等均能影響細(xì)胞的生長。第51頁,共112頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞貼附的過程第52頁,共112頁，2024年2月25日，星期天影響細(xì)胞貼附的因素細(xì)胞類型

(附著最強(qiáng))巨噬細(xì)胞一成纖維細(xì)胞——上皮細(xì)胞——血細(xì)胞(最弱)

生物因素血清、培養(yǎng)液中的促附著因子機(jī)械，物理等其他因素離心：促進(jìn)附著流動：培養(yǎng)液流動可阻止細(xì)胞附著低溫：可抑制附著第53頁,共112頁，2024年2月25日，星期天促生長因子現(xiàn)已證明，很多激素如胰島素、氫化可的松等具有促進(jìn)細(xì)胞生長作用。胰島素能促進(jìn)細(xì)胞利用葡萄糖和氨基酸，用量為1～10U/ml。氫化可的松可促進(jìn)表皮細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞生長，并能提高膠質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的克隆形成率，用量為10-8

～10-7mol/L。人表皮生長因子（hEGF)對大鼠宮頸鱗狀上皮細(xì)胞(RCEC)有促進(jìn)增殖的作用。表皮生長因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)等生長調(diào)節(jié)因子都能促進(jìn)細(xì)胞的生長和增殖。第54頁,共112頁，2024年2月25日，星期天五、細(xì)胞培養(yǎng)污染及對策培養(yǎng)細(xì)胞生長狀況常規(guī)檢查培養(yǎng)液：顏色與透明度的變化細(xì)胞生長狀況。細(xì)胞形態(tài)變化。微生物污染第55頁,共112頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)液PH值（顏色變化）變黃，表示PH值下降，細(xì)胞生長旺盛，代謝產(chǎn)生的酸性物不斷積累導(dǎo)致。變紅或紫紅色，表示PH值上升，細(xì)胞生長停滯、死亡。一般生長穩(wěn)定的細(xì)胞需要2-3天換液1次，生長慢的細(xì)胞需要3-4天換液一次。第56頁,共112頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞換液原代細(xì)胞經(jīng)24小時培養(yǎng)，培養(yǎng)液顏色變淺，表示細(xì)胞代謝好。少量換液可刺激細(xì)胞生長。通常每周兩次，每次換半量或1/5-1/3量。原代細(xì)胞第1次換液時，切記不要把培養(yǎng)液全部倒掉。細(xì)胞株（系）：條件合適時生長迅速，過夜就變黃，可進(jìn)行全量換液。這種情況下，最好減少細(xì)胞接種數(shù)，延長換液的時間。第57頁,共112頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞生長狀況常規(guī)應(yīng)特別注意細(xì)胞的生長增殖情況。原代細(xì)胞：經(jīng)歷一個適應(yīng)或潛伏期。細(xì)胞系：多為24小時以內(nèi)。細(xì)胞長滿瓶底80%時應(yīng)及時傳代。第58頁,共112頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞形態(tài)變化生長良好細(xì)胞：透明度大，折光性強(qiáng)，輪廓不清。生長狀態(tài)不良時，細(xì)胞折光性變?nèi)?，輪廓增?qiáng)，胞質(zhì)中常出現(xiàn)空泡，脂滴，顆粒樣物質(zhì)，細(xì)胞之間空隙加大。第59頁,共112頁，2024年2月25日，星期天微生物污染培養(yǎng)液顏色與透明度：培養(yǎng)液混濁，液體內(nèi)漂菌絲或細(xì)胞菌。支原體污染，沒有明顯癥狀，但細(xì)胞生長卻明顯變緩。第60頁,共112頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞培養(yǎng)污染的概念不僅僅指微生物，包括所有混入培養(yǎng)環(huán)境中對細(xì)胞生存有害的成份和造成細(xì)胞不純的異物，因此一般包括微生物(真菌、細(xì)菌、病毒和支原體)、化學(xué)物質(zhì)(影響細(xì)胞生存、非細(xì)胞所需的化學(xué)成份)及細(xì)胞(非同一種的其它細(xì)胞)。其中以微生物污染最多見。另外隨著細(xì)胞種類增多．不同種細(xì)胞交叉污染也時有發(fā)生、從而造成細(xì)胞不純。第61頁,共112頁，2024年2月25日，星期天污染的途徑空氣：空氣是微生物傳播的最主要途徑。凈化工作臺使用過久，濾器受塵埃阻塞，可使凈化工作不能正常進(jìn)行工作時不戴口罩或面對操作野大聲講話、咳嗽等使外界氣流過強(qiáng)減少空氣流動是防止污染的重要環(huán)節(jié)。第62頁,共112頁，2024年2月25日，星期天污染的途徑器材：各種培養(yǎng)器皿及器械清洗消毒不徹底洗刷不干凈，污物殘留及培養(yǎng)用液等滅菌不徹底CO2溫箱．由于溫箱內(nèi)濕度大，溫度適宜，取存細(xì)胞時不慎將培養(yǎng)液漏出，易使細(xì)菌、霉菌孽生，而CO2溫箱內(nèi)是開放式培養(yǎng)．如不定期消毒,可形成污染.第63頁,共112頁，2024年2月25日，星期天污染的途徑操作無菌觀念不強(qiáng)、動作不準(zhǔn)確、使用污染的器具或封瓶時不嚴(yán)培養(yǎng)兩種以上細(xì)胞時，操作不規(guī)范、交叉使用吸管或營養(yǎng)液瓶等有可能導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。第64頁,共112頁，2024年2月25日，星期天污染的途徑血清：有些血清在生產(chǎn)時就已被支原體或病毒等污染，即可成為污染的來源。組織樣本：原代培養(yǎng)的污染多數(shù)來源于組織樣本；另一方面手術(shù)時使用碘酒消毒，這些混入組織中的碘可以影響細(xì)胞生長。第65頁,共112頁，2024年2月25日，星期天污染對細(xì)胞的影響支原體和病毒對細(xì)胞的形態(tài)和機(jī)能的影響是長期的、緩慢的和潛在的霉菌和細(xì)菌繁殖迅速，能在很短時間內(nèi)壓制細(xì)胞生長或產(chǎn)生有毒物質(zhì)殺滅細(xì)胞?；瘜W(xué)物質(zhì)污染如重金屬或其它化學(xué)試劑混入培養(yǎng)液中后，有的毒性較小、如能及時排出，細(xì)胞仍可存活．但有些烴化物如多環(huán)芳烴等有致突變性，能導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化第66頁,共112頁，2024年2月25日，星期天細(xì)菌的污染和檢測細(xì)菌污染是實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染，即使在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入了抗菌素，也可能因?yàn)椴僮鞑簧鞫鹞廴尽Ｗ畛Ｒ姷挠懈锾m氏陽性菌，如枯草桿菌、白色葡萄球菌，以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌。培養(yǎng)細(xì)胞受細(xì)菌污染后，會出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變。污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡。第67頁,共112頁，2024年2月25日，星期天細(xì)菌污染第68頁,共112頁，2024年2月25日，星期天細(xì)菌污染的檢測肉眼直接觀察法培養(yǎng)檢查法顯微鏡觀察法PCR檢測第69頁,共112頁，2024年2月25日，星期天真菌污染真菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)過程中最常見的一種，最常見的真菌有煙曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。培養(yǎng)細(xì)胞受真菌污染后，可見培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色的小點(diǎn)，肉眼可見；有的散在生長，倒置顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯在細(xì)胞之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列，培養(yǎng)液一般不發(fā)生渾濁。真菌污染后，細(xì)胞生長變慢，但最后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡第70頁,共112頁，2024年2月25日，星期天真菌污染第71頁,共112頁，2024年2月25日，星期天支原體污染和檢測支原體是介于細(xì)菌與病毒之間能獨(dú)立生活的最小微生物，最小直徑0.2um，一般過濾除菌無法去除它，光鏡下難以看清它的形態(tài)結(jié)構(gòu)。開始不易發(fā)現(xiàn)，能在偏堿條件下生存，對青霉素有抗藥性。多吸附于細(xì)胞表面或散在于細(xì)胞之間。培養(yǎng)細(xì)胞受支原體污染后，部分敏感細(xì)胞可見細(xì)胞生長增殖變慢，部分細(xì)胞變圓，從瓶壁脫落。但多數(shù)細(xì)胞污染后無明顯變化，或略有變化，若不及時處理，還會產(chǎn)生交叉污染。第72頁,共112頁，2024年2月25日，星期天掃描電鏡法顯示支原體，附于細(xì)胞表面眾多的圓形顆粒為支原體第73頁,共112頁，2024年2月25日，星期天支原體污染的檢測相差顯微鏡觀察法Hayflick培養(yǎng)基直接培養(yǎng)法DNA熒光染色法（Hoechst33258）PCR方法（即用型細(xì)胞培養(yǎng)中支原體檢測PCR試劑盒）第74頁,共112頁，2024年2月25日，星期天病毒的污染和檢測細(xì)胞的直接觀察動物接種檢查電子顯微鏡觀察PCR技術(shù)第75頁,共112頁，2024年2月25日，星期天污染的預(yù)防防止污染，預(yù)防是關(guān)鍵，預(yù)防措施應(yīng)貫穿于整個細(xì)胞培養(yǎng)的始終。器皿準(zhǔn)備—開始操作前—操作過程中—其他細(xì)節(jié)方面的預(yù)防在培養(yǎng)液中加入適量的抗菌素。常規(guī)加入青霉素和鏈霉素各100U/ml。必要時加入慶大霉素、卡那霉素或兩性霉素B等。培養(yǎng)箱內(nèi)應(yīng)經(jīng)常清潔消毒，放置含硫酸銅的消毒水。購入的未滅活血清應(yīng)采取56℃水浴滅活30min的措施以使血清中的補(bǔ)體和支原體滅活。第76頁,共112頁，2024年2月25日，星期天支原體污染的預(yù)防小牛血清是造成支原體初級污染的主要來源次級污染源，即已污染支原體的細(xì)胞在污染的傳播中更為重要保證培養(yǎng)細(xì)胞的來源絕對干凈，同時應(yīng)做好檢測，一旦發(fā)現(xiàn)支原體污染就應(yīng)廢棄嚴(yán)禁已知污染了支原體的細(xì)胞進(jìn)入未污染的工作區(qū)域。嚴(yán)格無菌操作，杜絕人為污染。對每批小牛血清嚴(yán)格檢查，滅活、過濾有利于抑制支原體的污染。第77頁,共112頁，2024年2月25日，星期天污染的清除培養(yǎng)的細(xì)胞一旦污染應(yīng)及時處理，防止污染其他細(xì)胞。高壓滅菌被污染的細(xì)胞，然后棄掉。有價值的細(xì)胞被污染，并且污染程度較輕，可以通過及時排除污染物，挽救細(xì)胞恢復(fù)正常常用的排除微生物污染的方法有以下4種第78頁,共112頁，2024年2月25日，星期天抗生素排除法

抗生素是細(xì)胞培養(yǎng)中殺滅細(xì)菌的主要手段。聯(lián)合應(yīng)用比單用效果好，預(yù)防性應(yīng)用比污染后應(yīng)用好有的抗生素對細(xì)菌僅有抑制作用，無殺滅效應(yīng)。反復(fù)使用抗生素還能使微生物產(chǎn)生耐藥性，而且對細(xì)胞本身也有一定影響盡量不用抗生素處理一些有價值的細(xì)胞被污染后，仍需要用抗生素挽救，在這種情況下，可采用5－10倍于常用量的沖擊法，加入高濃度抗生素后作用24－48小時，再換入常規(guī)的培養(yǎng)液，有時可以奏效第79頁,共112頁，2024年2月25日，星期天加溫除菌根據(jù)支原體耐熱性能差的特點(diǎn)。有人將受支原體污染的細(xì)胞置于41度作用5－10小時（最長可以達(dá)18小時）殺滅支原體但是41度對細(xì)胞本身應(yīng)有較大影響，故在處理前，應(yīng)先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，確定最大限度殺傷支原體而對細(xì)胞影響較小的處理時間。第80頁,共112頁，2024年2月25日，星期天動物體內(nèi)接種受微生物污染的腫瘤細(xì)胞可以接種到同種動物皮下或腹腔，借動物體內(nèi)免疫系統(tǒng)消滅掉微生物，腫瘤細(xì)胞卻能在體內(nèi)生長，待一定時間，從體內(nèi)取出再進(jìn)行培養(yǎng)繁殖。第81頁,共112頁，2024年2月25日，星期天與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)在良好的體外培養(yǎng)條件下巨噬細(xì)胞可以存活7－10天，并可以分泌一些細(xì)胞因子支持其他細(xì)胞的克隆生長。巨噬細(xì)胞在體外條件下仍然可以吞噬微生物并將其消化。利用96孔板將極少培養(yǎng)細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，可以在高度稀釋培養(yǎng)細(xì)胞、極大地降低微生物污染程度地同時，更有效地發(fā)揮巨噬細(xì)胞清除污染的效能。與抗生素聯(lián)合應(yīng)用效果更佳。第82頁,共112頁，2024年2月25日，星期天六、培養(yǎng)細(xì)胞生長的測定方法細(xì)胞計數(shù)法胎盤蘭染色法MTT比色法細(xì)胞生長曲線法[3H]-TdR([3H]-胸腺嘧啶核苷）摻入法BrdU(5-bromo-2—deoxyuridine，5-溴脫氧尿嘧啶核苷）摻入法第83頁,共112頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞計數(shù)法細(xì)胞計數(shù)法是用血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)目，以測定細(xì)胞增殖和調(diào)整細(xì)胞濃度。細(xì)胞計數(shù)結(jié)果以細(xì)胞數(shù)/毫升表示第84頁,共112頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞計數(shù)板第85頁,共112頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞計數(shù)板第86頁,共112頁，2024年2月25日，星期天第87頁,共112頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞計數(shù)操作步驟將血球計數(shù)板及蓋片用軟紗布擦試干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板上。將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間。靜置3分鐘。鏡下觀察，計算計數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計左側(cè)和上方的第88頁,共112頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞計數(shù)操作步驟按下式計算：（細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)）/ml＝（四個大格子細(xì)胞數(shù)/4)×稀釋倍數(shù)×104/ml公式中除以4因?yàn)橛嫈?shù)了4個大格的細(xì)胞數(shù)。公式中乘以104因?yàn)橛嫈?shù)板中每一個大格的體積為：

1.0mm（長）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）＝0.1mm3

而1ml＝1000mm3。第89頁,共112頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞計數(shù)注意事項(xiàng)要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于104個/ml，如果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中。要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好，否則影響計數(shù)準(zhǔn)確性。取樣計數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液，尤其是多次取樣計數(shù)時更應(yīng)該每次取樣都要混勻，以求計數(shù)準(zhǔn)確。第90頁,共112頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞計數(shù)注意事項(xiàng)數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞，若細(xì)胞聚集成團(tuán)時只按照一個細(xì)胞計算。如果細(xì)胞壓在格線上時，則只計上線，不計下線，只計左線，不計右線。操作時，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計數(shù)。第91頁,共112頁，2024年2月25日，星期天臺盼藍(lán)染色法在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，活細(xì)胞所占總細(xì)胞中的百分比叫做細(xì)胞活力。由組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對細(xì)胞是否有損傷作用。復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。細(xì)胞死亡后，細(xì)胞膜通透性改變，臺盼藍(lán)大量進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)而不被排出呈藍(lán)色?；罴?xì)胞選擇性強(qiáng)，不易著色第92頁,共112頁，2024年2月25日，星期天臺盼藍(lán)染色法0.5ml臺盼藍(lán)＋0.3ml培養(yǎng)液＋0.2ml細(xì)胞懸液染色5－15min

至少計數(shù)500個細(xì)胞中著色細(xì)胞數(shù)細(xì)胞活力=（總細(xì)胞數(shù)－著色細(xì)胞)/總細(xì)胞數(shù)×100％第93頁,共112頁，2024年2月25日，星期天噻唑藍(lán)（MTT）比色法原理：活細(xì)胞線粒體中琥珀酸脫氫酶能將MTT黃色溶液還原成不溶于水的藍(lán)紫色產(chǎn)物顆粒（formazan)，并沉積在細(xì)胞中。二甲基亞砜（DMSO）或酸性異丙醇能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺（以O(shè)D值表示）與所含的formazan量成正比?？煞从郴罴?xì)胞的代謝水平。而死細(xì)胞沒有這種功能MTT法簡單快速、準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、腫瘤放射敏感性實(shí)驗(yàn)等第94頁,共112頁，2024年2月25日，星期天噻唑藍(lán)（MTT）比色法加入培養(yǎng)液量10％的MTT(5g/L)，繼續(xù)3～4h培養(yǎng)吸去培養(yǎng)液，加入等量異丙醇或DMSO，振蕩10min

490/630nm測定OD值細(xì)胞存活率＝實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值×100％第95頁,共112頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞生長曲線法觀察同一代細(xì)胞的增殖過程，根據(jù)細(xì)胞生長曲線分析細(xì)胞的增殖速度，確定具體實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞傳代、細(xì)胞凍存的最佳時間第96頁,共112頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞生長曲線法計數(shù)細(xì)胞濃度，等量加入培養(yǎng)板各孔，培養(yǎng)7天以接種時間始，每隔24h計數(shù)3孔細(xì)胞數(shù)目，取均值

以橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時間，縱坐標(biāo)為細(xì)胞濃度（×104/ml)注：1、各孔消化時間應(yīng)一致。

2、計數(shù)細(xì)胞前應(yīng)混勻。第97頁,共112頁，2024年2月25日，星期天第98頁,共112頁，2024年2月25日，星期天[3H]-TdR摻入法和BrdU摻入法[3H]-TdR摻入法是將用[3H]標(biāo)記的胸腺嘧啶脫氧核苷摻入到新合成的DNA中，通過測定[3H]放射性脈沖數(shù)比較不同細(xì)胞的增殖活性。溴脫氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,BrdU）是DNA前體胸腺嘧啶核苷類似物,通過競爭摻入S期細(xì)胞單鏈DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶。BrdU被摻入到DNA復(fù)制位點(diǎn)，這些復(fù)制位點(diǎn)可用熒光劑或酶偶聯(lián)的抗體檢測。

第99頁,共112頁，2024年2月25日，星期天七、細(xì)胞凍存和復(fù)蘇細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少入力、經(jīng)費(fèi)，減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化。第100頁,共112頁，2024年2月25日，星期天凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反，結(jié)晶很大，大結(jié)晶會造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。第101頁,共112頁，2024年2月25日，星期天低溫保護(hù)劑在細(xì)胞凍存時加入低溫保護(hù)劑，能大大提高凍存效果