血凝儀檢測原理及應用

關(guān)于血凝儀檢測原理及應用2（一）凝血常規(guī)（常規(guī)凝血功能篩選組合）

1.凝血常規(guī)1（6項）：PT、APTT、TT、Fib-C、D-二聚體、AT-Ⅲ

適合于：干部病房、ICU病房、呼吸內(nèi)科、消化內(nèi)科、血液內(nèi)科、產(chǎn)科、腫瘤科、心內(nèi)科、腎內(nèi)科和術(shù)后出血患者等，以及其它科室60歲以上高危人群。

2.凝血常規(guī)2（4項）：PT、APTT、TT、Fib-C適合于：一般手術(shù)患者。第2頁,共65頁，2024年2月25日，星期天3（二）DIC篩選試驗組合：

PT、APTT、TT、Fib-C、D-二聚體、FDP、AT-Ⅲ

（三）血友病組合：

PT、APTT、TT、Ⅷ:C、Ⅸ:C、Ⅷ抑制物檢查（四）凝血因子全套檢查：

PT、APTT、TT、Fib-C、Ⅱ:C、Ⅶ:C、Ⅷ：C、Ⅸ:C、Ⅹ:C、Ⅺ：C第3頁,共65頁，2024年2月25日，星期天4（五）藥物性出血的監(jiān)測

1.口服華法林治療監(jiān)測組合：PT2.普通肝素治療監(jiān)測組合：

TT、APTT、AT-Ⅲ3.溶栓藥物治療（SK、UK、t-PA）監(jiān)測組合：PT、APTT、D-二聚體、TT、Fib-C、FDP第4頁,共65頁，2024年2月25日，星期天5出血

血栓形成

正常止血血栓第5頁,共65頁，2024年2月25日，星期天6三個階段，兩個途徑

（內(nèi)源性、外源性）第一階段：凝血酶原激活物形成第二階段：凝血酶形成第三階段：纖維蛋白形成第6頁,共65頁，2024年2月25日，星期天7凝子因子參與的凝血途徑內(nèi)源性凝血途徑：Ⅷ，Ⅸ，Ⅺ，Ⅻ外源性凝血途徑：Ⅲ，Ⅶ共同凝血途徑：Ⅰ，Ⅱ，Ⅴ，Ⅹ，ⅩⅢ第7頁,共65頁，2024年2月25日，星期天8第8頁,共65頁，2024年2月25日，星期天9傳統(tǒng)的凝血途徑的修改外源性的Ⅶ因子在組織因子的結(jié)合下既可激活Ⅹ因子，又可激活內(nèi)源性的第Ⅸ因子，從而打破了內(nèi)源與外源的界限。Ⅻ因子缺乏時并不引起出血，這說明第Ⅺ因子并不一定只被Ⅻ因子激活，現(xiàn)已證明Ⅺ本身具有自身激活作用。凝血酶（Ⅱ因子）也可激活Ⅺ因子，原來認為只有Ⅻ因子才能激活Ⅺ因子。TF被激活并與Ⅶ因子結(jié)合后會被一種組織因子途徑抑制物（TFPI）所抑制；后者已成為一種新型抗凝劑。第9頁,共65頁，2024年2月25日，星期天10二、凝血檢驗標本收集和預處理第10頁,共65頁，2024年2月25日，星期天11（一）標本采集

1.抽血注意事項（1）抽血管首選優(yōu)質(zhì)塑料管；（2）定量抽血完畢，立即將標本輕柔顛倒混勻5次，避免劇烈搖動；（3）許多專家建議抽血的第一管血不用作血栓試驗，盡量選第二管。第11頁,共65頁，2024年2月25日，星期天122.抗凝劑問題（1）世界衛(wèi)生組織/美國臨床和實驗室標準協(xié)會（WHO/CLSI）都推薦使用0.109mol/L枸櫞酸鈉（3.2%Na3C6H5O7﹒2H2O）作為凝血檢驗的抗凝劑；（2）一般選用1份抗凝劑+9份靜脈血—當Hct25%～55%時；（3）若Hct＜25%或＞55%時，抗凝劑的用量=0.00185×全血量×[1-Hct]×100；第12頁,共65頁，2024年2月25日，星期天13Hct異常時抗凝劑和抽血量第13頁,共65頁，2024年2月25日，星期天14高Hct的影響病例：真性紅細胞增多癥患者，Hct0.562（1）1：9比例抗凝結(jié)果（錯誤）：

PT19.2s，PT-INR1.78，APTT62.1s，

Fib-C1.67g/L，TT22.9s，與臨床不符。（2）0.20.00185×（100-56.2）計算后應抽血2.5ml，結(jié)果（正確）為：

PT13.9s，PT-INR1.30，APTT36.2s，

Fib-C1.70g/L，TT19.7s，與臨床相符。第14頁,共65頁，2024年2月25日，星期天15（二）離心問題

1.血栓試驗使用的血漿為PPP；

2.一般要求2000～2500g/min（3000r/min），離心時間為10min左右，轉(zhuǎn)速N（轉(zhuǎn)/分）與“g”的轉(zhuǎn)換關(guān)系：g=11.18×10-7×半徑（mm）×N（轉(zhuǎn)/分）；

3.離心溫度室溫即可，但不可超過25℃，4℃離心條件應該提倡。第15頁,共65頁，2024年2月25日，星期天16（三）即時試驗標本的要求

1.標本盡可能在4小時內(nèi)完成；

2.篩查試驗和一些因子測定時，應避免將標本長時間室溫放置；

3.Ⅶ因子測定時，標本要避免冷藏。第16頁,共65頁，2024年2月25日，星期天17（四）分離后血漿標本的處理1.建議將標本保存在-70℃以下條件，凝血因子至少可穩(wěn)定6個月；2.短期保存可在-35℃條件，-20℃條件通常是不理想的；3.冷凍血漿解凍應放置37℃水浴條件，并輕輕搖動4～5分鐘，分析前輕柔地顛倒混勻。室溫放置自然解凍是不可取的，因室溫放置會有冷沉淀形成，Ⅷ:C和vWF會減少，并有纖維蛋白原析出。冷凍過的血漿不能再次冷凍。第17頁,共65頁，2024年2月25日，星期天18XIIXIIXVIII外源凝血途徑檢查PT內(nèi)源凝血途徑檢查APTT組織因子VII+XXaII凝血酶原IIa（凝血酶）I(FIB)Ia(凝塊)V組織因子途徑TFTFPI共同途徑途徑檢查TT凝血途徑示意圖第18頁,共65頁，2024年2月25日，星期天19三、凝血酶原時間測定（PT）第19頁,共65頁，2024年2月25日，星期天20IIIIVPLIIICa

,PL2+Ca

,PL2+XIIVIIXIIIIIXVIIIVIIVIVIIIIIXIXII

inBlood血液中

inPlasma血漿中PTReagentFibrinExtrinsicSystem外在系統(tǒng)MeasureClottingTimewithoutTissueFactorCalcium（Ca）2+

Blood

SamplingwithoutwithoutTrisodium

CitrateNormalRange9-14sec37℃XVIXIIXIIIXVIIIXVIIIVIVIIIIIIPhospholipidXIXIII（一）檢測原理第20頁,共65頁，2024年2月25日，星期天21PT檢測的原理在受檢血漿中加入過量的組織凝血活酶和鈣離子，使凝血酶原變?yōu)槟?，后者使纖維蛋白原與轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白。觀察血漿凝固所需的時間即為凝血酶原時間。CA1500儀器法判斷終點采用光學法，即當纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白時，經(jīng)光照后產(chǎn)生的散射光發(fā)生變化，儀器判讀終點。第21頁,共65頁，2024年2月25日，星期天22（二）臨床應用

1.延長

（1）見于先天性外源凝血因子（Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ）缺乏癥和低/無FIB血癥，凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ輕微減少，PT的延長幅度也不大，Ⅱ因子減少病人，其PT經(jīng)常在正常范圍；（2）口服抗凝藥，如華法令等；（3）維生素K缺乏癥；（4）DIC及原發(fā)性纖溶癥；（5）肝臟疾??；（6）血中有抗凝物質(zhì)（狼瘡抗凝物、抗磷脂抗體、肝素、FDP以及抗Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ

的抗體）。

第22頁,共65頁，2024年2月25日，星期天23

2.縮短

（1）血栓前狀態(tài)和血栓性疾病；（2）見于先天性V因子增多；（3）長期口服避孕藥；（4）使用重組的Ⅶ因子治療時；（5）標本放置在2～8℃，Ⅶ因子冷激活發(fā)生，使PT縮短。

3.口服抗凝劑的檢測

PT和PT-INR是監(jiān)測口服抗凝劑的常用指標，中國人PT-INR在1.5-2.5用藥較為安全和有效。第23頁,共65頁，2024年2月25日，星期天24低ISI試劑的優(yōu)勢

ISI=1.0試劑 ISI=2.0試劑

MNPT

11sec 11sec

PT

22sec 15.6sec

PT-INR

(22/11)=2.0 (15.6/11)=2.0

當系統(tǒng)誤差是

(21/11)=1.91 (14.6/11)=1.761秒時的INR

(23/11)=

2.09

(16.6/11)=2.28INR誤差范圍1.91~2.09

1.76~2.28121122第24頁,共65頁，2024年2月25日，星期天25MNPT的確定方法標本：多份混合血漿（20份以上）年齡：18-55歲性別：男、女（非妊娠、非經(jīng)期）各半藥物的影響：激素、抗生素、口服避孕藥、降壓藥、維生素采血前的要求：勿劇烈運動空腹或只服少量無脂類食物第25頁,共65頁，2024年2月25日，星期天26四、活化部分凝血活酶時間（APTT）第26頁,共65頁，2024年2月25日，星期天27PLCa

,PL2+Ca

,PL2+XIXXIXIIIActivatorIVIVIIIXIIIXIIXIXIXVIIIVIIVIIIXIIIXIIXIXIXVIIIVIIVIVIIIIIIAPTT檢測原理

inBlood

inPlasmawithout

Blood

SamplingwithoutwithoutTrisodium

CitrateAPTTReagentIntrinsicSystemMeasureClottingTimeEllagicacidCalcium（Ca）2+NormalRange20-40secCaCl2PhospholipidFibrin37℃VIIVIII第27頁,共65頁，2024年2月25日，星期天28APTT檢測的原理37℃條件下，以白陶土（激活劑）激活因子Ⅺ和Ⅻ，以腦磷脂（部分凝血活酶）代替血小板提供凝血的催化表面，在Ca2+的參與下，觀察貧血小板血漿凝固所需的時間即為活化部分凝血活酶時間。CA1500儀器法判斷重點采用光學法，即當纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白時，經(jīng)光照后產(chǎn)生的散射光發(fā)生變化，儀器判讀終點。第28頁,共65頁，2024年2月25日，星期天29臨床應用1.延長

（1）見于內(nèi)源性凝血因子（Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ）缺乏，如血友病A、血友病B及Ⅺ因子缺乏癥；（2）嚴重的凝血酶原、Ⅴ、Ⅹ和FIB缺乏，如肝臟疾病、阻塞性黃疸、新生兒出血癥、腸道滅菌綜合征、吸收不良綜合征、口服抗凝劑、應用肝素及FIB缺乏血癥；（3）纖溶活性增強，如繼發(fā)性、原發(fā)性纖溶亢進及循環(huán)血液中有纖維蛋白（原）降解產(chǎn)物（FDP）；

（4）血液中有抗凝物質(zhì)，如抗因子Ⅷ或Ⅸ抗體，狼瘡抗凝物質(zhì)等。

第29頁,共65頁，2024年2月25日，星期天302.縮短

（1）高凝狀態(tài)，如DIC的高凝期、促凝物質(zhì)進入血液以及凝血因子的活性增高等；（2）血栓性疾病，如心肌梗死、不穩(wěn)定性心絞痛、腦血管病變、糖尿病伴血管病變、肺梗死、深靜脈血栓形成妊以及高癥、腎病綜合征和嚴重的灼傷等。第30頁,共65頁，2024年2月25日，星期天31

3.肝素治療的監(jiān)測（1）肝素用于預防血栓形成時，APTT為同時檢測的正常對照值的1.5倍；

（2）肝素用于治療的安全有效范圍是APTT為同時檢測的正常對照值的1.5-2.5倍。第31頁,共65頁，2024年2月25日，星期天32APTT測定常見的問題1.分析前因素2.APTT試劑（激活劑）第32頁,共65頁，2024年2月25日，星期天33五、凝血酶時間測定（TT）第33頁,共65頁，2024年2月25日，星期天34第34頁,共65頁，2024年2月25日，星期天35第35頁,共65頁，2024年2月25日，星期天36臨床應用

1延長

（1）見于FIB水平或功能減低，如低FIB血癥或異常FIB血癥；

（2）應用肝素或肝素類物質(zhì)存在（如SLE、肝病和腎病等）；

（3）見于FDP增多。第36頁,共65頁，2024年2月25日，星期天372縮短

見于高凝狀態(tài)3

作為溶栓藥物，如鏈激酶（SK），尿激酶（UK）和組織性纖溶酶原激活劑（t-PA）等溶栓治療的監(jiān)測指標。TT在正常對照值的1.5—2.5倍，治療安全有效。

第37頁,共65頁，2024年2月25日，星期天38TT測定常見的問題1.分析前因素2.TT試劑①凝血酶試劑:來源于牛；②對肝素和FDP高度敏感；③TT試劑保存時間較短，不宜重復使用。第38頁,共65頁，2024年2月25日，星期天39PT、APTT、TT聯(lián)合分析一第39頁,共65頁，2024年2月25日，星期天40OATPT、APTT、TT聯(lián)合分析二第40頁,共65頁，2024年2月25日，星期天41凝血因子FVIII或IX或XI或XII缺陷PT、APTT、TT聯(lián)合分析三第41頁,共65頁，2024年2月25日，星期天42纖溶過程（纖溶系統(tǒng)）FIB（纖維蛋白原）纖維蛋白(血栓）FSPs(包括D-D)FDPs(統(tǒng)稱)FDP纖溶酶纖溶酶原(抗纖溶酶)激活劑抑制物抑制物FDP:FibrinogenDegradationProductsFSP:FibrinSplitProducts第42頁,共65頁，2024年2月25日，星期天43六、纖維蛋白原測定（Fib-C）第43頁,共65頁，2024年2月25日，星期天44IIaIIaIIIXIIIXIIXIXIXVIIIVIIVIVIIIIIIIXIIIXIIXIXIXVIIIVIIVIVII檢測原理（Clauss法）

inBlood

inPlasmawithout

Blood

SamplingwithoutwithoutTrisodium

CitrateFbgReagentFibrinMeasureClottingTimeThrombinNormalRange200-400mg/dLCalculatedforFibrinogenconcentration37℃I第44頁,共65頁，2024年2月25日，星期天45ODOD1OD2OD3250mg/dl125mg/dl62mg/dlOD3OD2OD1062125250Mg/dl[FIB]時間ODFIBFIBFIBODx[FIB]檢測原理（PT演算法）PT演算法的原理

PT測定完后纖蛋白原會轉(zhuǎn)變成纖維蛋白，其形成的濁度與纖維蛋白質(zhì)的含量成正比，因此不需要任何試劑，即可由產(chǎn)生的濁度直接推算出纖維蛋白原的含量。第45頁,共65頁，2024年2月25日，星期天46檢測原理（免疫學方法）①利用抗FIB多克隆抗體與FIB特異性結(jié)合反應進行測定；

②方法有免疫濁度、單向免疫擴散和ELISA等。第46頁,共65頁，2024年2月25日，星期天47臨床應用1增高

（1）動脈粥樣硬化（2）糖尿病（3）急性傳染病，急性感染（4）結(jié)締組織?。?）急性腎炎和尿毒癥（6）妊娠晚期和妊高癥（7）放療后，灼傷，休克，外科大手術(shù)后，惡性腫瘤等

第47頁,共65頁，2024年2月25日，星期天482減少

（1）DIC、原發(fā)型纖溶、重癥肝炎，肝硬化；

（2）作為蛇毒治療（抗栓酶、去纖酶）和溶栓治療（UK、t-PA）的監(jiān)測指標。FIB在1.2～1.5g/L，治療安全有效。第48頁,共65頁，2024年2月25日，星期天49方法學問題①Clauss法—功能檢測，操作簡單，結(jié)果可靠，WHO推薦為Fib-C的參考方法（凝血酶為30～100U/ml，OVB的pH值應在7.35）；②PT演算法—更快速，簡便，且重復性較好，當Fib在正常范圍或輕度異常時，與Clauss法結(jié)果差異不大，但當Fib＞6.0g/L或Fib＜1.5g/L時，PT演算法結(jié)果不可信，一般高于Clauss法；第49頁,共65頁，2024年2月25日，星期天50Clauss法與PT演算法比較第50頁,共65頁，2024年2月25日，星期天51七、D-Dimer測定第51頁,共65頁，2024年2月25日，星期天52DDDDDDDDDDDDDDDDVisibleagglutinationDDDDEEDDDEDEnoagglutinationD-DimerD,EfragmentsDDD-DimerLatexAntibodyDED,E碎片D-Dimer—乳膠凝集方法第52頁,共65頁，2024年2月25日，星期天53D-Dimer臨床應用D-Dimer增高提示機體內(nèi)存在血栓形成和繼發(fā)性纖溶亢；D-Dimer在血栓形成（高凝狀態(tài)）、肝臟疾病和惡性腫瘤等疾病的鑒別診斷和治療檢測等方面具有較好的應用效果；由于D-Dimer具有高度的敏感性和良好的陰性預期，對于排除肺栓塞和靜脈血栓有較大的價值；手術(shù)后患者D-Dimer可顯著增高，發(fā)生靜脈血栓和肺栓塞的風險較大，檢測D-Dimer的水平變化可預測患者的血栓風險。第53頁,共65頁，2024年2月25日，星期天54FDP臨床應用

1.原發(fā)性纖溶亢進時，F(xiàn)DP含量可明顯升高。

2.高凝狀態(tài)、彌散性血管內(nèi)凝血、肝栓塞、器官移植的排異反應、妊娠高血壓綜合征、惡性腫瘤、心、肝、腎疾病及靜脈血栓、溶栓治療等所致的繼發(fā)性纖溶亢進時，F(xiàn)DP含量升高。第54頁,共65頁，2024年2月25日，星期天55臨床指標

①D-Dimer是交聯(lián)纖維蛋白的特異性降解產(chǎn)物，是血栓形成的特異性指標；②D-Dimer是繼發(fā)性纖溶的特異性指標；

③纖維蛋白原和纖維蛋白的降解產(chǎn)物