實(shí)驗(yàn)常規(guī)儀器的使用-課件

生物化學(xué)與分子生物學(xué)

實(shí)驗(yàn)技術(shù)2020/12/171ppt課件生物化學(xué)與分子生物學(xué)

實(shí)驗(yàn)技術(shù)2020/12/171ppt課20年代：微量分析技術(shù)導(dǎo)致了維生素、激素和輔酶等的發(fā)現(xiàn)。瑞典著名的化學(xué)家T.Svedberg奠基了“超離心技術(shù)的理論基礎(chǔ)，1924年制成了第一臺(tái)5000RCF的離心機(jī)（5000r/min-8000r/min，相對(duì)離心力“RCF”的單位可表示為“×g”)，并準(zhǔn)確測(cè)定了血紅蛋白等復(fù)雜蛋白質(zhì)的分子量，獲得了1926年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。。1.1生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)史2020/12/172ppt課件20年代：1.1生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)史2020/12/精品資料精品資料你怎么稱呼老師？如果老師最后沒(méi)有總結(jié)一節(jié)課的重點(diǎn)的難點(diǎn)，你是否會(huì)認(rèn)為老師的教學(xué)方法需要改進(jìn)？你所經(jīng)歷的課堂，是講座式還是討論式？教師的教鞭“不怕太陽(yáng)曬，也不怕那風(fēng)雨狂，只怕先生罵我笨，沒(méi)有學(xué)問(wèn)無(wú)顏見(jiàn)爹娘……”“太陽(yáng)當(dāng)空照，花兒對(duì)我笑，小鳥(niǎo)說(shuō)早早早……”實(shí)驗(yàn)常規(guī)儀器的使用-ppt課件精品資料精品資料你怎么稱呼老師？如果老師最后沒(méi)有總結(jié)一節(jié)課的重點(diǎn)的難點(diǎn)，你是否會(huì)認(rèn)為老師的教學(xué)方法需要改進(jìn)？你所經(jīng)歷的課堂，是講座式還是討論式？教師的教鞭“不怕太陽(yáng)曬，也不怕那風(fēng)雨狂，只怕先生罵我笨，沒(méi)有學(xué)問(wèn)無(wú)顏見(jiàn)爹娘……”“太陽(yáng)當(dāng)空照，花兒對(duì)我笑，小鳥(niǎo)說(shuō)早早早……”實(shí)驗(yàn)常規(guī)儀器的使用-ppt課件30年代：

電子顯微鏡技術(shù)打開(kāi)了微觀世界，使我們能夠看到細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)和某些生物大分子的大致結(jié)構(gòu)。美國(guó)哈佛大學(xué)的Folin教授和中國(guó)的吳憲教授建立了不少生物化學(xué)常用的分析方法如血糖分析、蛋白質(zhì)含量分析、氨基酸測(cè)定等。英藉德裔生物化學(xué)家Krebs，在1937年發(fā)現(xiàn)了三羧酸循環(huán)，對(duì)細(xì)胞代謝及分子生物學(xué)的研究作出了重要貢獻(xiàn)，他與美藉德裔生物化學(xué)家Lipmann共獲1953年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。2020/12/177ppt課件30年代：2020/12/177ppt課件40年代：兩位英國(guó)科學(xué)家Martin和Synge發(fā)明了分配色譜（層析），他們獲得了1952年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。由此，層析技術(shù)成為分離生化物質(zhì)的關(guān)鍵技術(shù)。

電泳技術(shù)由瑞典的著名科學(xué)家Tisellius奠基，從而開(kāi)創(chuàng)了電泳技術(shù)的新時(shí)代，他因此獲得了1948年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。層析技術(shù)和電泳技術(shù)用于分析生物大分子的組成和代謝的中間產(chǎn)物，示蹤技術(shù)的應(yīng)用推動(dòng)了代謝的研究。美國(guó)化學(xué)家Pauling確認(rèn)氫鍵在蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)中以及生物大分子間相互作用的重要性等，并因此而獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。2020/12/178ppt課件40年代：2020/12/178ppt課件50年代：自1935年Schoenheimer和Rittenberg首次將放射性同位素示蹤用于碳水化合物及類脂物質(zhì)的中間代謝的研究以后，射性同位素示蹤技術(shù)50年代有了大的發(fā)展，為各種生物化學(xué)代謝過(guò)程的闡明起了決定性的作用。1953年美國(guó)科學(xué)家Watson和英國(guó)科學(xué)家Crick提出DNA分子反向平行雙螺旋模型，1962年與英國(guó)科學(xué)家Wilkins分享諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，Wilkins和Franklin通過(guò)對(duì)DNA分子的X-射線衍射研究為Watson和Crick的DNA模型提供了有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，DNA雙螺旋模型的提出開(kāi)創(chuàng)了生物科學(xué)的歷史新紀(jì)元。在X-射線衍射技術(shù)方面，英國(guó)物理學(xué)家Perutz對(duì)血紅蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行X-射線結(jié)構(gòu)分析,Kendrew測(cè)定了肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)，成為研究生物大分子立體結(jié)構(gòu)的先驅(qū)，他們同獲1962年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。英國(guó)生物化學(xué)家Sanger還于1953年確定了牛胰島素中氨基酸的順序而獲得1958年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。Kornberg發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶Ⅰ，美藉西班牙裔科學(xué)家Uchoa發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌的多核苷酸磷酸化酶，研究并重建了將基因內(nèi)的遺傳信息通過(guò)RNA中間體翻譯成蛋白質(zhì)的過(guò)程。兩人分享了1959年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。2020/12/179ppt課件50年代：2020/12/179ppt課件60年代：各種儀器分析方法用于生物化學(xué)研究，取得了很大的發(fā)展，如HPLC技術(shù)、紅外、紫外、圓二色等光譜技術(shù)、NMR核磁共振技術(shù)等。自1958年Stem，Moore和Spackman設(shè)計(jì)出氨基酸自動(dòng)分析儀，大大加快了蛋白質(zhì)的分析工作。1967年Edman和Begg制成了氨基酸序列分析儀，到1973年Moore和Stein設(shè)計(jì)出氨基酸序列自動(dòng)分析儀，又大大加快了對(duì)多肽一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定，十多年間氨基酸的自動(dòng)測(cè)定工作得到了很大的發(fā)展和完善。在60年代，層析和電泳技術(shù)又有了重大的進(jìn)展，在1968-1972年Anfinsen創(chuàng)建了親和層析技術(shù)，開(kāi)辟了層析技術(shù)的新領(lǐng)域。1969年Weber應(yīng)用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)測(cè)定了蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量，使電泳技術(shù)取得了重大進(jìn)展。美國(guó)生物化學(xué)家Nirenberg在破譯遺傳密碼方面作出了重要貢獻(xiàn)，Holly闡明了酵母丙氨酸t(yī)RNA的核苷酸排列順序，后來(lái)證明所有tRNA的結(jié)構(gòu)均相似。美藉印度裔生物化學(xué)家Khorana提出按預(yù)定的序列合成核酸分子的方法。他們3人共獲1969年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。法國(guó)生物學(xué)家Lwoff、JAcob和生物化學(xué)家Monod由于在病毒DNA和mRNA等方面出色的大量研究工作而共獲1965年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。2020/12/1710ppt課件60年代：2020/12/1710ppt課件70年代：

基因工程技術(shù)取得了突破性的進(jìn)展，Arber，Smith和Nathans三個(gè)小組發(fā)現(xiàn)并純化了限制性內(nèi)切酶，1972年，美國(guó)斯坦福大學(xué)的Berg等人首次用限制性內(nèi)切酶切割了DNA分子，并實(shí)現(xiàn)了DNA分子的重組。1973年，又由美國(guó)斯坦福大學(xué)的Cohen等人第一次完成了DNA重組體的轉(zhuǎn)化技術(shù)，這一年被定為基因工程的誕生年，Cohen成為基因工程的創(chuàng)始人，從此，生物化學(xué)進(jìn)入了一個(gè)新的大發(fā)展時(shí)期。與此同時(shí)，各種儀器分析手段進(jìn)一步發(fā)展，制成了DNA序列測(cè)定儀、DNA合成儀等。

2020/12/1711ppt課件70年代：2020/12/1711ppt課件80年代基因工程技術(shù)進(jìn)入輝煌發(fā)展的時(shí)期，1980年，英國(guó)劍橋大學(xué)的生物化學(xué)家Sanger和美國(guó)哈佛大學(xué)的Gilbert分別設(shè)計(jì)出兩種測(cè)定DNA核苷酸序列的方法，而與Berg共獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，從此，DNA序列分析法成為生物化學(xué)與分子生物學(xué)最重要的研究手段之一。他們3人在DNA重組和RNA結(jié)構(gòu)研究方面都作出了杰出的貢獻(xiàn)。1981年由Jorgenson和Lukacs首先提出的高效毛細(xì)管電泳技術(shù)（HPCE），由于其高效、快速、經(jīng)濟(jì)，尤其適用于生物大分子的分析，因此受到生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)和化學(xué)等學(xué)科的科學(xué)工作者的極大重視，發(fā)展極為迅速，是生化實(shí)驗(yàn)技術(shù)和儀器分析領(lǐng)域的重大突破，意義深遠(yuǎn)?，F(xiàn)今，由于HPCE技術(shù)的異軍突起，HPLC技術(shù)的發(fā)展重點(diǎn)己轉(zhuǎn)到制備和下游技術(shù)。2020/12/1712ppt課件80年代2020/12/1712ppt課件1984年德國(guó)科學(xué)家Kohler、美國(guó)科學(xué)家Milstein和丹麥科學(xué)家Jerne由于發(fā)展了單克隆抗體技術(shù)，完善了極微量蛋白質(zhì)的檢測(cè)技術(shù)而共享了諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。1985年美國(guó)加利福尼亞州Cetus公司的Mullis等發(fā)明了用PCR技術(shù)（PolymeraseChainReaction）即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA的技術(shù)，對(duì)于生物化學(xué)和分子生物學(xué)的研究工作具有劃時(shí)代的意義，因而與第一個(gè)設(shè)計(jì)基因定點(diǎn)突變的Smith共享1993年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)1988年，美國(guó)遺傳學(xué)家McClintock由于在二十世紀(jì)五十年代提出并發(fā)現(xiàn)了可移動(dòng)的遺傳因子而獲得諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。1989年，美國(guó)科學(xué)家Altman和Cech由于發(fā)現(xiàn)某些RNA具有酶的功能（稱為核酶）而共享諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。2020/12/1713ppt課件1984年德國(guó)科學(xué)家Kohler、美國(guó)科學(xué)家Mils90年代：1993年，美國(guó)科學(xué)家Roberts和Sharp由于在斷裂基因方面的工作而榮獲諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。1994年，美國(guó)科學(xué)家Gilman和Rodbell由于發(fā)現(xiàn)了G蛋白在細(xì)胞內(nèi)信息傳導(dǎo)中的作用而分享諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。1995年，美國(guó)科學(xué)家Lewis、德國(guó)科學(xué)家Nusslein-Volhard和美國(guó)科學(xué)家Wieschaus由于在20世紀(jì)40-70年代先后獨(dú)立鑒定了控制果蠅體節(jié)發(fā)育基因而共享諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái)，PCR技術(shù)、生物芯片技術(shù)不斷完善，基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、生物信息學(xué)發(fā)展迅速。2020/12/1714ppt課件90年代：2020/12/1714ppt課件我國(guó)生物化學(xué)界的主要成就我國(guó)生物化學(xué)界的先驅(qū)吳憲教授在20年代初由美回國(guó)后，在協(xié)和醫(yī)科大學(xué)生化系與汪猷、張昌穎等人一道完成了蛋白質(zhì)變性理論、血液生化檢測(cè)和免疫化學(xué)等一系列有重大影響的研究。1965年我國(guó)化學(xué)和生物化學(xué)家用化學(xué)方法在世界上首次人工合成了具有生物活性的結(jié)晶牛胰島素，1983年又通過(guò)大協(xié)作完成了酵母丙氨酸轉(zhuǎn)移核糖核酸的人工合成。近年來(lái)，在酶學(xué)研究、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及生物膜的結(jié)構(gòu)與功能等方面都有舉世矚目的研究成果。90年代以來(lái)，我國(guó)參與了人類基因組計(jì)劃，在水稻基因組研究中處于國(guó)際領(lǐng)先水平，在功能基因組學(xué)研究中取得不少成績(jī)。2020/12/1715ppt課件我國(guó)生物化學(xué)界的主要成就2020/12/1715ppt課件1.2生化實(shí)驗(yàn)室的基本設(shè)施與裝備溫度與環(huán)境設(shè)施許多生化實(shí)驗(yàn)都要求在一定的溫度和濕度下進(jìn)行操作，因此，一個(gè)正規(guī)的生化實(shí)驗(yàn)室必須能夠保持恒溫、恒濕的環(huán)境。為了保持這些條件，實(shí)驗(yàn)室都應(yīng)裝備空調(diào)和加濕器等，而儀器分析室則要求保持干燥，一些怕潮濕和易水解的試劑應(yīng)保存在干燥箱中。由于各種生物材料、制劑和各種生化試劑要求在不同的溫度下保存，實(shí)驗(yàn)室必須備有4℃、－20℃、－80℃的冰箱，需要在更低溫度下保存的樣品，則須使用液氮罐。對(duì)于需在較高溫度下進(jìn)行的操作，則可使用烘箱和高溫電爐等。實(shí)驗(yàn)室還應(yīng)備有干冰，以便使用乙醇-干冰浴進(jìn)行樣品的快速冷凍分裝。

2020/12/1716ppt課件1.2生化實(shí)驗(yàn)室的基本設(shè)施與裝備溫度與環(huán)境設(shè)施2020/1實(shí)驗(yàn)室用純水生化實(shí)驗(yàn)室使用最多的溶劑是“水”，配制生化實(shí)驗(yàn)用試劑不能用自來(lái)水，只能使用經(jīng)過(guò)純化的水。生化實(shí)驗(yàn)對(duì)所用水的純度是要求比較高的，通?？梢哉J(rèn)為，水的質(zhì)量越高，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果就越真實(shí)可靠和準(zhǔn)確，為此必須保證實(shí)驗(yàn)用水的質(zhì)量。常用的兩種純水是二次蒸餾水和無(wú)離子水。在超純分析和特殊的生化實(shí)驗(yàn)中要求更高的水質(zhì)，如無(wú)菌水、亞沸蒸餾水、無(wú)二氧化碳蒸餾水等。根據(jù)實(shí)際工作的需要，來(lái)選用水的種類，如：無(wú)離子水、普通蒸餾水、二次蒸餾水、亞沸蒸餾水及按特殊要求制備的高純水等。所有的各種純水，在貯存中都會(huì)被污染：塑料容器會(huì)產(chǎn)生有紫外吸收的有機(jī)物；玻璃和金屬容器會(huì)產(chǎn)生金屬離子的污染；長(zhǎng)時(shí)間放置更會(huì)使水長(zhǎng)菌，空氣中的二氧化碳會(huì)溶入水中，所以貯存高純水一定要隔絕空氣，密封蓋嚴(yán)，必要時(shí)貯存在冰箱的冷藏室中。2020/12/1717ppt課件實(shí)驗(yàn)室用純水2020/12/1717ppt課件消毒系統(tǒng)生化實(shí)驗(yàn)要進(jìn)行生物培養(yǎng)和生物反應(yīng)的操作，這些操作都必須排除其他生物因素的干擾，因此在做這些實(shí)驗(yàn)之前，都必須對(duì)實(shí)驗(yàn)中用到的、可能造成污染的材料、器械等進(jìn)行消毒滅菌處理。常用的滅菌方法有：高溫、高壓滅菌、紫外線照射、火焰焚燒、過(guò)濾除菌、酒精等試劑浸泡消毒等，因此實(shí)驗(yàn)室必須配備各種無(wú)菌處理設(shè)備。離心設(shè)備離心方法是分離和制備生物大分子最常用的手段，因而生化實(shí)驗(yàn)室必須備有各種形式的離心機(jī)。常用的有普通臺(tái)式離心機(jī)、高速冷凍離心機(jī)和超速離心機(jī)等。2020/12/1718ppt課件消毒系統(tǒng)2020/12/1718ppt課件計(jì)量系統(tǒng)

生化實(shí)驗(yàn)都要求在各種標(biāo)準(zhǔn)的定量條件下進(jìn)行，因此實(shí)驗(yàn)室必須配備各種標(biāo)準(zhǔn)的定量系統(tǒng)。常用的定量系統(tǒng)有：稱量系統(tǒng)、液體體積度量系統(tǒng)、pH測(cè)定系統(tǒng)、液體溶質(zhì)定量系統(tǒng)等。⑴稱量?jī)x器：最常用的設(shè)備是各種千分之一的扭力天平、單、雙盤天平和各種萬(wàn)分之一的電子天平等，它們分別用于各種緩沖液的配制和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的稱量等。⑵液體體積度量?jī)x器：常用的有各種量筒、移液管、容量瓶、微量進(jìn)樣器和各種自動(dòng)取液器等。⑶酸堿度pH測(cè)量?jī)x器：最常用的是pH試紙和pH計(jì)。⑷液體溶質(zhì)定量?jī)x器：此系統(tǒng)主要是根據(jù)液體溶質(zhì)的某些理化特性而設(shè)計(jì)的，不同的物質(zhì)在一定的條件下有特定的吸收光譜，其吸收值的大小與其在溶液中的濃度有一定的關(guān)系，可以通過(guò)測(cè)定某物質(zhì)在溶液中的吸收光譜來(lái)計(jì)算出該物質(zhì)的濃度，因而分光光度計(jì)就是生化實(shí)驗(yàn)室必備的儀器分析手段。主要有可見(jiàn)分光光度計(jì)和高檔的快速掃描紫外／可見(jiàn)分光光度計(jì)等。

2020/12/1719ppt課件計(jì)量系統(tǒng)2020/12/1719ppt課件電泳裝置電泳是生化實(shí)驗(yàn)中最常用最重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一，主要用于分析、鑒定，也可用于制備。電泳裝置由電源和電泳槽兩部分組成，詳見(jiàn)第4章。層析系統(tǒng)層析又稱為色譜，是分離各種生物大分子的主要手段之一，因而各種層析系統(tǒng)和核酸蛋白檢測(cè)器就是生化實(shí)驗(yàn)室最常用的儀器設(shè)備。主要的層析技術(shù)有：吸附層析、凝膠排阻層析、離子交換層析和親和層析等，詳見(jiàn)第3章。PCR儀PCR(PolymeraseChainReaction)是指聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。該反應(yīng)是用DNA聚合酶在體外大量擴(kuò)增DNA片段的一種方法。PCR儀就是將此方法實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化操作的一種儀器，是生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)常用和必備的設(shè)備。2020/12/1720ppt課件電泳裝置2020/12/1720ppt課件其它設(shè)備

實(shí)驗(yàn)室除以上常規(guī)設(shè)備和設(shè)施外，還必須裝備下列一些常用設(shè)備：A.通風(fēng)柜：用于有害和有毒氣體的操作。B.微波爐：用于化凍、滅菌及其他一些需要快速加熱的操作。C.組織打碎機(jī)和勻漿器：用于各種生物材料、動(dòng)植物組織和細(xì)胞的破碎。D.超聲清洗機(jī)：用于各種器皿、移液管和自動(dòng)取液器吸頭的清洗和高效液相色譜儀所用流動(dòng)相的脫氣等。E.冰凍干燥機(jī)：用于生物大分子水溶液的冰凍干燥，可由其水溶液直接制得固體干粉。F.機(jī)械和水環(huán)式真空泵：用于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器和各種真空抽氣操作。G.旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：用于各種水溶液和有機(jī)溶液的旋轉(zhuǎn)減壓蒸餾操作。H.酶標(biāo)儀：用于免疫化學(xué)實(shí)驗(yàn)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定。2020/12/1721ppt課件其它設(shè)備2020/12/1721ppt課件絕對(duì)誤差（absoluteerror）：絕對(duì)誤差是測(cè)量值與真實(shí)值之差。δ=x?μ(δ：絕對(duì)誤差；x：測(cè)量值；μ：真實(shí)值）絕對(duì)誤差是以測(cè)量值的單位為單位，可以是正值，也可以是負(fù)值。測(cè)量值越接近真實(shí)值，絕對(duì)誤差越小。真實(shí)值是一個(gè)可以接近而不可達(dá)到的理論值。上式可以寫成：

μ=x-δ說(shuō)明在已知絕對(duì)誤差值的情況下，真實(shí)值可以從測(cè)定值減去絕對(duì)誤差而求得。2020/12/1722ppt課件絕對(duì)誤差（absoluteerror）：2020/12/1相對(duì)誤差（relativeerror）：為了反映誤差在測(cè)量結(jié)果中所占的比例，分析工作中經(jīng)常使用相對(duì)誤差。相對(duì)誤差是以真實(shí)值的大小為基礎(chǔ)表示的誤差值，沒(méi)有單位。

δ/μ=(x-μ)/μ通常以%，‰或ppm表示。例如：測(cè)定純NaCl中Cl的百分含量為60.52%，而其真實(shí)含量（理論值）為60.66%。則絕對(duì)誤差=60.52%?60.66%=-0.14%相對(duì)誤差=[（60.52%?60.66%）/60.66%]×1000‰=-2.3‰

2020/12/1723ppt課件相對(duì)誤差（relativeerror）：2020/12/1

如果不知道真實(shí)值，而知道絕對(duì)誤差值，則相對(duì)誤差也可以表示為：

相對(duì)誤差=δ

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100%x例如：用分析天平稱兩個(gè)重量，一個(gè)是0.0021g，另一個(gè)是0.5432g，兩個(gè)重量的絕對(duì)誤差都是0.0001g，可是相對(duì)誤差卻大不相同，一個(gè)是（1/21）×100%，另一個(gè)是（1/5432）×100%?？梢?jiàn)，由于兩個(gè)被測(cè)組分含量高低不同，即使絕對(duì)誤差相同，相對(duì)誤差也不同。對(duì)高含量組分測(cè)定的相對(duì)誤差應(yīng)當(dāng)要求小些，低含量組分測(cè)定的相對(duì)誤差要求允許大些。例如：用重量法和滴定法測(cè)量樣品主要成分，相對(duì)誤差需要達(dá)到千分之一，而用比色法測(cè)定樣品重微量成分時(shí)，相對(duì)誤差只要求達(dá)到百分之幾即可。2020/12/1724ppt課件如果不知道真實(shí)值，而知道絕對(duì)誤差值，2.系統(tǒng)誤差系統(tǒng)誤差（systematicerror）也叫“可定誤差”，是由某種確定的原因引起的，一般有固定的方向（正或負(fù)）和大小，重復(fù)測(cè)定時(shí)重復(fù)出現(xiàn)。根據(jù)系統(tǒng)誤差的來(lái)源，可分為：（1）方法誤差方法誤差是由于不適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)或所選方法不恰當(dāng)所引起的，通常影響較大。比如：滴定分析中終點(diǎn)與化學(xué)計(jì)量點(diǎn)不相符合、重量分析中沉淀的溶解度過(guò)大或有共沉淀等，都會(huì)產(chǎn)生誤差。（2）儀器或試劑誤差是由于儀器未經(jīng)校準(zhǔn)或試劑不合規(guī)格引起的。例如：天平砝碼不準(zhǔn)、容量?jī)x器刻度不準(zhǔn)或試劑不純等，均能產(chǎn)生這種誤差。2020/12/1725ppt課件2.系統(tǒng)誤差2020/12/1725ppt課件（3）操作誤差

操作誤差是由于分析者操作不符合要求引起的。例如：分析者對(duì)滴定終點(diǎn)顏色改變的判斷能力不夠高，總是偏深或偏淺，便會(huì)產(chǎn)生誤差。由于系統(tǒng)誤差是重復(fù)的以固定方向和大小出現(xiàn)，所以能用加校正值的方法加以消除，但不能用增加平行測(cè)定次數(shù)的方法消除。2020/12/1726ppt課件（3）操作誤差2020/12/1726ppt課件3.隨機(jī)誤差（accidentalerror):也稱偶然誤差，是由于偶然的原因，如測(cè)量條件、實(shí)驗(yàn)室溫度、濕度等變動(dòng)而未能得到控制的條件波動(dòng)引起的，其大小和正負(fù)都不固定。偶然誤差的出現(xiàn)看起來(lái)似乎沒(méi)有規(guī)律，但多次測(cè)量就會(huì)發(fā)現(xiàn)絕對(duì)值相同的正負(fù)偶然誤差出現(xiàn)的概率大致相等，它們之間能完全或部分抵消。因此通過(guò)增加平行測(cè)定次數(shù)，就可以減免測(cè)定結(jié)果中這種誤差。也可以通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法估計(jì)出偶然誤差值，并在測(cè)定結(jié)果中予以正確表達(dá)。系統(tǒng)誤差和偶然誤差往往不能區(qū)分。比如：在觀察滴定終點(diǎn)的顏色變化時(shí)，有人總是偏深，產(chǎn)生系統(tǒng)誤差。但多次測(cè)定中偏深程度不一樣，又必然有偶然誤差。2020/12/1727ppt課件3.隨機(jī)誤差（accidentalerror):20204.準(zhǔn)確度和精密度（1）準(zhǔn)確度（accuracy）：表示分析結(jié)果與真實(shí)值接近的程度。準(zhǔn)確度的大小，用誤差表示。誤差越大，準(zhǔn)確度越低。（2）精密度（precision）：表示平行測(cè)量的各測(cè)量值之間的相互接近程度,表示測(cè)量的重現(xiàn)性。用以下幾個(gè)指標(biāo)表示:A.偏差d=Xi-X平均B.平均偏差：各個(gè)偏差絕對(duì)值的平均值,即平均偏差=∑偏差/nC.相對(duì)平均偏差S=（平均偏差/X平均）×100%。D.標(biāo)準(zhǔn)偏差:各個(gè)偏差的平方值和除以樣本個(gè)數(shù)n?1，再開(kāi)平方。即

（S)=[∑偏差2/（n－1）]1/2

E.相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=（標(biāo)準(zhǔn)偏差/X平均）×100%。2020/12/1728ppt課件4.準(zhǔn)確度和精密度2020/12/1728ppt課件5.提高分析準(zhǔn)確度的方法（1）選擇恰當(dāng)?shù)姆治龇椒ú煌椒ǖ臏?zhǔn)確度和靈敏度不同。重量分析法和容量分析法靈敏度雖然不高，但對(duì)常量組分的測(cè)定可以獲得比較準(zhǔn)確的結(jié)果，一般相對(duì)誤差不超過(guò)千分之幾。但對(duì)于微量和痕量組分的分析，常常做不出來(lái)，談不上精確度。

儀器分析法對(duì)測(cè)定常量組分無(wú)法準(zhǔn)確，但對(duì)測(cè)定微量和痕量組分靈敏度很高，盡管相對(duì)誤差較大，但絕對(duì)誤差不大，能符合準(zhǔn)確度的要求?？傊仨毟鶕?jù)分析對(duì)象，樣品情況以及對(duì)分析結(jié)果的要求，選擇恰當(dāng)?shù)姆治龇椒ā?020/12/1729ppt課件5.提高分析準(zhǔn)確度的方法（1）選擇恰當(dāng)?shù)姆治龇椒?02（2）減小測(cè)量誤差為了保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確度，必須盡量減小各步的測(cè)量誤差。例如：一般分析天平的稱量誤差為+0.0001g，用減重法稱量?jī)纱?，可能引起的最大誤差是+0.0002g，為了使稱量的相對(duì)誤差小于0.1%，取樣量就不能小于0.2g。

2020/12/1730ppt課件（2）減小測(cè)量誤差2020/12/1730ppt課件（3）消除測(cè)量中的系統(tǒng)誤差A(yù)、校準(zhǔn)儀器：對(duì)砝碼、滴定管和移液管進(jìn)行校準(zhǔn)。B、做對(duì)照實(shí)驗(yàn)：用含量已知的標(biāo)準(zhǔn)試樣或純物質(zhì)當(dāng)樣品進(jìn)行分析，由分析結(jié)果和其已知含量的差值，確定分析的誤差。C、做空白實(shí)驗(yàn)：在不加樣品的情況下，以與樣品相同的方法、步驟進(jìn)行分析，把所得的結(jié)果作為空白值從樣品分析結(jié)果中減去。這樣可以消除由于試劑不純或容器不符合要求所帶進(jìn)的誤差。2020/12/1731ppt課件（3）消除測(cè)量中的系統(tǒng)誤差2020/12/1731pp

8.有效數(shù)字

有效數(shù)字是指分析工作中實(shí)際測(cè)到的數(shù)字，允許最后一個(gè)數(shù)字是可疑數(shù)，反映測(cè)量值的準(zhǔn)確度，要與測(cè)量的方法相適應(yīng)。

一般分析數(shù)據(jù)保留4位有效數(shù)字，保留的位數(shù)太多無(wú)實(shí)際意義，反而增加計(jì)算的麻煩。要注意0.0052的有效數(shù)字只有2位，3個(gè)0是用于定位的無(wú)效數(shù)字。

修約有效數(shù)字的原則是四舍六入五成雙。如23.455±0.546修約為23.46±0.55，28.445±0.675修約為28.44±0.68，要避免出現(xiàn)0.00002±0.00001之類的數(shù)字，或3658.2543±0.0058之類的數(shù)字。2020/12/1732ppt課件8.有效數(shù)字

有效數(shù)字是五、生物化學(xué)常用緩沖液（一）基本概念

⑴Bronsted-Lowry酸堿理論（酸堿質(zhì)子理論）:1923年由丹麥化學(xué)家J.N.Brφnsted和英國(guó)化學(xué)家T.M.Lowry同時(shí)提出了酸堿質(zhì)子學(xué)說(shuō)，認(rèn)為凡能釋放質(zhì)子的分子或離子（如：H2O，HCl，NH4+，HSO4-等）稱為酸，凡能接受質(zhì)子的分子或離子（如：H2O，NH3，Cl-等）稱為堿。因此，一種酸釋放質(zhì)子后即成為堿，稱為該酸的共軛堿，同樣一種堿與質(zhì)子結(jié)合后，形成對(duì)應(yīng)的酸，稱為該堿的共軛酸。如鹽酸在水中的解離：

HClCl-＋H+

HCl是酸，Cl-是它的共軛堿。pH=pKa+log{[質(zhì)子受體]/[質(zhì)子供體]}

2020/12/1733ppt課件五、生物化學(xué)常用緩沖液2020/12/1733ppt課件⑵緩沖體系的設(shè)計(jì)：1960年，N.E.Good和他的同事們提出，適合生命科學(xué)研究使用的緩沖體系應(yīng)具有以下特性：①pKa值在6-8之間；②在水中的溶解度高；③不易穿透生物膜；④鹽效應(yīng)??；⑤離子濃度、溶液組成和溫度對(duì)解離的影響?。虎薏慌c金屬離子生成復(fù)合物或沉淀；⑦該緩沖劑化學(xué)穩(wěn)定；⑧紫外和可見(jiàn)光波長(zhǎng)范圍內(nèi)光吸收?。虎嵋字频酶呒兌鹊柠}。2020/12/1734ppt課件⑵緩沖體系的設(shè)計(jì)：2020/12/1734ppt課件（二）生物化學(xué)常用緩沖液

⑴磷酸鹽緩沖液：磷酸鹽是生物化學(xué)研究中使用最廣泛的一種緩沖劑，由於它們是二級(jí)解離，有二個(gè)pKa值，所以用它們配制的緩沖液，pH范圍最寬：NaH2PO4：pKa1＝2.12，pKa2＝7.21Na2HPO4：pKa1＝7.21，pKa2＝12.32配酸性緩沖液：用NaH2PO4，pH＝1-4，配中性緩沖液：用混合的兩種磷酸鹽，pH＝6-8，配堿性緩沖液：用Na2HPO4，pH＝10-12。用鉀鹽比鈉鹽好，因?yàn)榈蜏貢r(shí)鈉鹽難溶，鉀鹽易溶，但若配制SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的緩沖液時(shí)，只能用磷酸鈉而不能用磷酸鉀，因?yàn)镾DS（十二烷基硫酸鈉）會(huì)與鉀鹽生成難溶的十二烷基硫酸鉀。2020/12/1735ppt課件（二）生物化學(xué)常用緩沖液2020/12/1735ppt課件磷酸鹽緩沖液的優(yōu)點(diǎn)為：①容易配制成各種濃度的緩沖液；②適用的pH范圍寬；③pH受溫度的影響小；④緩沖液稀釋后pH變化小，如稀釋十倍后pH的變化小于0.1。其缺點(diǎn)為：①易與常見(jiàn)的鈣Ca++離子、鎂Mg++離子以及重金屬離子締合生成沉淀；②會(huì)抑制某些生物化學(xué)過(guò)程，如對(duì)某些酶的催化作用會(huì)產(chǎn)生某種程度的抑制作用。2020/12/1736ppt課件磷酸鹽緩沖液的優(yōu)點(diǎn)為：2020/12/1736ppt課件⑵Tris（三羥甲基氨基甲烷）緩沖液：Tris緩沖液在生物化學(xué)研究中使用的越來(lái)越多，有超過(guò)磷酸鹽緩沖液的趨勢(shì)，如在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中已都使用Tris緩沖液，而很少再用磷酸鹽。Tris緩沖液的常用有效pH范圍是在“中性”范圍，例如：Tris-HCl緩沖液：pH＝7.5-8.5Tris-磷酸鹽緩沖液：pH＝5.0-9.02020/12/1737ppt課件⑵Tris（三羥甲基氨基甲烷）緩沖液：2020/12/17Tris-HCl緩沖液的優(yōu)點(diǎn)是：

①因?yàn)門ris的堿性較強(qiáng)，所以可以只用這一種緩沖體系配制pH范圍由酸性到堿性的大范圍pH值的緩沖液；②對(duì)生物化學(xué)過(guò)程干擾很小，不與鈣、鎂離子及重金屬離子發(fā)生沉淀。其缺點(diǎn)是：①緩沖液的pH值受溶液濃度影響較大，緩沖液稀釋十倍，pH值的變化大于0.1；②溫度效應(yīng)大，溫度變化對(duì)緩沖液pH值的影響很大，例如：4℃時(shí)緩沖液的pH＝8.4，而37℃時(shí)的pH＝7.4，所以一定要在使用溫度下進(jìn)行配制，室溫下配制的Tris-HCl緩沖液不能用于0℃-4℃。③易吸收空氣中的CO2，所以配制的緩沖液要蓋嚴(yán)密封。④此緩沖液對(duì)某些pH電極發(fā)生一定的干擾作用，所以要使用與Tris溶液具有兼容性的電極。

2020/12/1738ppt課件Tris-HCl緩沖液的優(yōu)點(diǎn)是：2020/12/1738p⑶有機(jī)酸緩沖液：這一類緩沖液多數(shù)是用羧酸與它們的鹽配制而成，pH范圍為酸性，即pH＝3.0-6.0，最常用的是甲酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸等。有機(jī)酸緩沖液的缺點(diǎn)是：①所有這些羧酸都是天然的代謝產(chǎn)物，因而對(duì)生化反應(yīng)過(guò)程可能發(fā)生干擾作用；②檸檬酸鹽和琥珀酸鹽可以和過(guò)渡金屬離子（Fe3+、Zn++、Mg++等）結(jié)合而使緩沖液受到干擾；③這類緩沖液易與Ca++離子結(jié)合，所以樣品中有Ca++離子時(shí)，不能用這類緩沖液。2020/12/1739ppt課件⑶有機(jī)酸緩沖液：2020/12/1739ppt課件⑷硼酸鹽緩沖液：常用的有效pH范圍是：pH＝8.5-10.0，因而它是堿性范圍內(nèi)最常用的緩沖液，其優(yōu)點(diǎn)是配制方便，只使用一種試劑，缺點(diǎn)是能與很多代謝產(chǎn)物形成絡(luò)合物，尤其是能與糖類的羥基反應(yīng)生成穩(wěn)定的復(fù)合物而使緩沖液受到干擾。2020/12/1740ppt課件⑷硼酸鹽緩沖液：2020/12/1740ppt課件⑸氨基酸緩沖液：此緩沖液使用的范圍寬，可用于pH=2.0-11.0，例如最常用的有：甘氨酸-HCl緩沖液：pH=2.0-5.0，甘氨酸-NaOH緩沖液：pH=8.0-11.0，甘氨酸-Tris緩沖液：pH=8.0-11.0，（廣泛使用的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的電極緩沖液），組氨酸緩沖液：pH=5.5-6.5，

此類緩沖體系的優(yōu)點(diǎn)是：為細(xì)胞組份和各種提取液提供更接近的天然環(huán)境。

其缺點(diǎn)是：①與羧酸鹽和磷酸鹽緩沖體系相似，也會(huì)干擾某些生物化學(xué)反應(yīng)過(guò)程，如代謝過(guò)程等。②試劑的價(jià)格較高。

2020/12/1741ppt課件⑸氨基酸緩沖液：2020/12/1741ppt課件六、pH值的測(cè)定測(cè)定溶液pH值通常有兩種方法，最簡(jiǎn)便但較粗略的方法是用pH試紙，分為廣泛和精密pH試紙兩種。廣泛pH試紙的變色范圍是pH=1-14、9-14等，只能粗略確定溶液的pH值。精密pH試紙，可以較精確地測(cè)定溶液的pH值，其變色范圍是2-3個(gè)pH單位，例如有pH=1.4-3.0、5.4-7.0、9.5-13.0等許多種，可根據(jù)待測(cè)溶液的酸、堿性選用某一范圍的試紙。測(cè)定的方法是將試紙條剪成小塊，用鑷子夾一小塊試紙，用玻璃棒蘸少許溶液與試紙接觸，試紙變色后與色階板對(duì)照，估讀出所測(cè)pH值。切不可將試紙直接放入溶液中，以免污染樣品溶液。2020/12/1742ppt課件六、pH值的測(cè)定測(cè)定溶液pH值通常有兩種方法，最簡(jiǎn)第二節(jié)紫外可見(jiàn)分光光度法2020/12/1743ppt課件第二節(jié)紫外可見(jiàn)分光光度法2020/12/1743ppt課件一、基本原理（一）Beer-Lambert定律當(dāng)一束單色光通過(guò)溶液時(shí)，由于溶液吸收了一部分光能，光的強(qiáng)度就會(huì)減弱。設(shè)入射光的強(qiáng)度為I0，透過(guò)濃度為c，液層厚度為b的溶液后，透射光的強(qiáng)度I必定小于I0，隨濃度和厚度的增加，光被吸收的程度亦增加，透射光的強(qiáng)度則減小。透射光強(qiáng)度與入射光強(qiáng)度的比值，稱為透光度(transmittance)，以T表示。實(shí)驗(yàn)證明，當(dāng)液層厚度b和溶液濃度c按算術(shù)級(jí)數(shù)增加時(shí)，透光度T按幾何級(jí)數(shù)減小，數(shù)學(xué)式為：

A＝-lgT＝abc

A：吸光度，又稱光密度“O.D”；T：透光度，T＝I/I。；a：吸光系數(shù)（L·mol－1·cm－1）；b：樣品光程（cm），通常使用1.0cm的吸收池，則b=1cm；c：樣品濃度（mol/L）。當(dāng)a、c一定時(shí)，吸光度A與液層厚度b成正比，稱為朗伯定律(Lambert′slaw)。當(dāng)a、b一定時(shí)，吸光度A與溶液濃度c成正比，稱為比爾定律(Beer′slaw)。吸光度與液層厚度和溶液濃度的乘積成正比，稱為朗伯—比爾定律，簡(jiǎn)稱比爾定律，即光的吸收定律。其數(shù)學(xué)表達(dá)式為：A=abc

2020/12/1744ppt課件一、基本原理（一）Beer-Lambert定律2020/1式中的a為比例常數(shù)，稱吸光系數(shù)，有兩種表示方式：1.摩爾吸光系數(shù),是指在一定波長(zhǎng)時(shí)，溶液濃度為1mol/L，厚度為1cm的吸光度，用ε或EM表示。2.百分吸光系數(shù)或稱比吸光系數(shù),是指在一定波長(zhǎng)時(shí)，溶液濃度為1%(W/V)，厚度為1cm的吸光度，用E1%1cm表示。吸光系數(shù)兩種表示方式之間的關(guān)系是：ε=Mr/10×E1%1cm摩爾吸光系數(shù)是物質(zhì)對(duì)某波長(zhǎng)的光的吸收能力的量度。ε越大，吸收光的能力越強(qiáng)，相應(yīng)的分光度法測(cè)定的靈敏度就越高。ε值越大，說(shuō)明電子躍遷的幾率大，通常ε＝10-105：一般認(rèn)為ε＞104為強(qiáng)吸收；ε＝103-104為較強(qiáng)吸收；ε＜102為弱吸收，此時(shí)分光光度法不靈敏。因?yàn)橥ǔＪ褂梅止夤舛扔?jì)可檢測(cè)出的最小吸光度A＝0.001,所以，當(dāng)b＝1cm,ε＝105時(shí)，可檢測(cè)的溶液最小濃度是C＝10-8mol/L。ε的值很難直接測(cè)定，通常要先測(cè)出E1%1cm再按公式計(jì)算求得。2020/12/1745ppt課件式中的a為比例常數(shù)，稱吸光系數(shù)，有兩種表示方式：202吸光度“A”有一個(gè)重要性質(zhì)是其具有加和性：即混合物的總吸光度等于溶液中的各組份各自在該波長(zhǎng)下吸光度的算術(shù)和。這是多元混合物分光光度法定量分析的基礎(chǔ)。若溶液中各溶質(zhì)的吸光系數(shù)ε相同，則各溶質(zhì)吸光度的大小與溶質(zhì)濃度成比例。例：尿嘧啶核苷酸溶液用1cm石英吸收池測(cè)定260nm的吸光度為0.650，用同一吸收池測(cè)定純?nèi)軇┑奈舛葹?.070，已知其摩爾吸光系數(shù)=8.2×103M-1cm，計(jì)算其摩爾濃度。L）?！逜＝εbC∵A＝（溶劑加樣品的吸光度）－（溶劑的吸光度）∴A＝0.650－0.070＝0.580

∵b＝1cm∴C==7.1×10-5mol/L2020/12/1746ppt課件吸光度“A”有一個(gè)重要性質(zhì)是其具有加和性：2020/3.影響吸光系數(shù)的因素吸光系數(shù)的大小，取決于物質(zhì)(溶質(zhì)、溶劑)的本性和光的波長(zhǎng)。1.物質(zhì)不同，則吸光系數(shù)不同。以吸光系數(shù)可作為物質(zhì)的特性常數(shù)。在分光光度法中，常用摩爾吸光系數(shù)ε來(lái)衡量顯色反應(yīng)的靈敏度，ε值越大，靈敏度越高。2.溶劑不同，其吸光系數(shù)亦不同。所以在說(shuō)明某一物質(zhì)的吸光系數(shù)時(shí)，應(yīng)注明溶劑。3.光的波長(zhǎng)不同，其吸光系數(shù)亦不同。如將不同波長(zhǎng)的單色光依次通過(guò)被分析物質(zhì)，分別測(cè)得吸光度，然后繪制吸光度—波長(zhǎng)曲線，稱為吸收曲線(absorptioncurve)，又稱吸收光譜(absorptionspectrum)。由吸收曲線可以看出物質(zhì)的吸收特征。吸收曲線上有極大值的部分，稱為吸收峰。吸收峰所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)，稱為最大吸收波長(zhǎng)，以符號(hào)λmax表示，這是物質(zhì)定性的依據(jù)之一。物質(zhì)的定量也常選擇在λmax處測(cè)定其吸光度，因?yàn)樵诖颂帨y(cè)定的靈敏度最高。4.單色光的純度也影響吸光系數(shù)。單色光越純，即經(jīng)單色器分光后的波長(zhǎng)范圍越窄，其吸光系數(shù)越大。嚴(yán)格說(shuō)來(lái)，朗伯—比爾定律只有當(dāng)入射光是單色光時(shí)才完全適用，但實(shí)際上不管儀器中光學(xué)系統(tǒng)的質(zhì)量怎樣高，單色化以后的光還是具有一定的寬度，這取決于儀器的精確程度。濾光片的分光本領(lǐng)較差，故一般測(cè)得的吸光系數(shù)要比真值小得多。2020/12/1747ppt課件3.影響吸光系數(shù)的因素吸光系數(shù)的大小，取決于物質(zhì)(溶質(zhì)吸收池使用注意事項(xiàng)：①要徹底清洗，尤其是盛過(guò)蛋白質(zhì)等溶液，干后形成一層膜，不易洗去，通常杯子不用時(shí)可放在1％洗潔凈液中浸泡，去污效果好，使用時(shí)用水沖洗干凈，要求杯壁不掛水珠，還可以用綢布絲線或軟塑料制作一個(gè)小刷子清洗杯子。②嚴(yán)禁用手指觸摸透光面，因指紋不易洗凈。嚴(yán)禁用硬紙和布擦拭透光面，只能使用鏡頭紙和綢布。③嚴(yán)禁加熱烘烤。急用干的杯子時(shí)，可用酒精蕩洗后用冷風(fēng)吹干。決不可用超聲波清洗器清洗。2020/12/1748ppt課件吸收池使用注意事項(xiàng)：2020/12/1748ppt課件4.檢測(cè)器:檢測(cè)器是一種光電轉(zhuǎn)換設(shè)備，即把光強(qiáng)度以電訊號(hào)顯示出來(lái)，常用的檢測(cè)器有光電管，光電倍增管和光電二極管等三種。①光電管：光電管可檢測(cè)10微微安（10-11A）的光電流，管內(nèi)抽真空充入惰性氣體.②光電倍增管：它是檢測(cè)弱光的最靈敏最常用的光電元件，其靈敏度比光電管高200多倍，光電子由陰極到陽(yáng)極重復(fù)發(fā)射9次以上，每一個(gè)光電子最后可產(chǎn)生106-107個(gè)電子，因此總放大倍數(shù)可達(dá)106-107倍，光電倍增管的響應(yīng)時(shí)間極短，能檢測(cè)10-8-10-9秒級(jí)的脈沖光。其靈敏度與光電管一樣受到暗電流的限制，暗電流主要來(lái)自陰極發(fā)射的熱電子和電極間的漏電。③光電二極管：其原理是這種硅二極管受紫外-近紅外輻射照射時(shí)，其導(dǎo)電性增強(qiáng)的大小與光強(qiáng)或正比。近年來(lái)分光光度計(jì)使用光電二極管作檢測(cè)器在增加，雖然其靈敏度還趕不上光電倍增管，但它的穩(wěn)定性更好，使用壽命更長(zhǎng)，價(jià)格便宜，因而許多著名品牌的高檔分光光度計(jì)都在使用它作檢測(cè)器。

2020/12/1749ppt課件4.檢測(cè)器:2020/12/1749ppt課件5.顯示裝置:低檔分光光度計(jì)現(xiàn)在已都使用數(shù)字顯示，有的還連有打印機(jī)?，F(xiàn)代高性能分光光度計(jì)均可以連接微機(jī)，而且有的主機(jī)還使用帶液晶或CRT熒屏顯示的微處理機(jī)和打印繪圖機(jī)，有的還帶有標(biāo)準(zhǔn)軟驅(qū)，存取數(shù)據(jù)更加方便。2020/12/1750ppt課件5.顯示裝置:2020/12/1750ppt課件三、分光光度法的定性與定量方法（一）定性方法：

一系列不同波長(zhǎng)的單色光照射待測(cè)溶液，可測(cè)的一系列相應(yīng)的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)作圖，可以得到待測(cè)物質(zhì)的吸收曲線。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品比較而定性。實(shí)際工作中常用λmax和ε來(lái)定性，λmax可以從吸收曲線中吸收峰所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)直接找出；ε通常需配置待測(cè)物質(zhì)三種不同濃度的溶液，在1cm的吸收池中，在λmax處分別測(cè)定其吸光度，根據(jù)A=εbc,即ε=A/bc，計(jì)算出ε，將三次結(jié)果平均，即是該物質(zhì)的摩爾吸光系數(shù)。2020/12/1751ppt課件三、分光光度法的定性與定量方法2020/12/1751ppt從吸受光譜中初步推斷官能團(tuán)：一個(gè)化合物在220-800nm范圍內(nèi)無(wú)吸收（ε<1），它可能是脂肪族飽和碳?xì)浠衔?、醇、醚、羧酸、胺等，不含直鏈或環(huán)狀共軛體，沒(méi)有醛、酮等基團(tuán)。在210-250nm有吸收帶，可能含量2個(gè)共軛單位250-300nm有弱吸收帶，表示有羰基存在。異構(gòu)體的推定：許多異構(gòu)體可以利用雙鍵位置不同，通過(guò)紫外吸收光譜推斷異構(gòu)體結(jié)構(gòu)?；衔锕羌艿耐贫ǎ何粗衔锱c已知化合物的紫外吸收光譜一致時(shí)，可以認(rèn)定兩者具有同樣的發(fā)色團(tuán)。通過(guò)這個(gè)原理可以推定未知化合物的骨架。2020/12/1752ppt課件從吸受光譜中初步推斷官能團(tuán)：2020/12/1752ppt課（二）定量方法：根據(jù)比爾定律，物質(zhì)在一定波長(zhǎng)處的吸光度與濃度之間有線性關(guān)系。因此，只要選擇一定的波長(zhǎng)測(cè)定溶液的吸光度，即可求出濃度。1.吸光系數(shù)法（絕對(duì)法）：根據(jù)比爾定律A=εcl，若l和吸光系數(shù)ε或E1%1cm已知，即可根據(jù)測(cè)得的A，求出被測(cè)物的濃度。

C=A/εl

通常ε或E1%1cm可以在手冊(cè)或文獻(xiàn)中查到。示例見(jiàn)課本P10.2020/12/1753ppt課件（二）定量方法：2020/12/1753ppt課件2.標(biāo)準(zhǔn)曲線法:在有些情況下，如單色光不純等情況，測(cè)得的吸光值隨所用儀器不同而有相當(dāng)大的變化。若此時(shí)用吸光系數(shù)換算成濃度，將產(chǎn)生很大的誤差。但如果只用一臺(tái)固定的儀器，則可認(rèn)定在固定的工作狀態(tài)和測(cè)定條件下，濃度與吸光度之間的關(guān)系在許多情況下是線性關(guān)系或接近于線性關(guān)系。

A=KC(K只為比例常數(shù)，而非物質(zhì)常數(shù)）依據(jù)上式的關(guān)系進(jìn)行定量是分光光度法中比較簡(jiǎn)便易行的方法。2020/12/1754ppt課件2.標(biāo)準(zhǔn)曲線法:2020/12/1754ppt課件標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作（1）配置一系列濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液。（2）在測(cè)定條件相同的情況下，分別測(cè)定其吸光度。（3）以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)（不必考慮顯色劑等引起的濃度變化），以相應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制A-C關(guān)系圖。（4）在相同條件下測(cè)出樣品溶液的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出濃度。AC0AxCx如Folin酚試劑法(Lowry法)測(cè)定蛋白質(zhì)含量取14只試管分成兩組，分別加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(250μg/mL)，用水補(bǔ)足到1mL，加入5mL試劑甲，混勻，于20-25℃放置10分鐘。再加入0.5mL試劑乙(Folin氏試劑)，立即振搖均勻，在20-25℃保溫30分鐘，然后于500nm處比色。取兩組測(cè)定的平均值，以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線作為定量的依據(jù)。橫坐標(biāo)的蛋白質(zhì)濃度分別為0，25，50，100，150，200，250，單位為μg/mL，不可將上述數(shù)字再除以6.5，將數(shù)字變成一個(gè)小數(shù)。2020/12/1755ppt課件標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作AC0AxCx如Folin酚試劑法(Lowr3.對(duì)照法:在同樣條件下配置標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液，在選定波長(zhǎng)處，分別測(cè)量吸光度，根據(jù)定律

A標(biāo)=EC標(biāo)lA樣=EC樣l在同種物質(zhì)、同臺(tái)儀器及同一波長(zhǎng)測(cè)定的條件下l和E均為定值，所以：

A標(biāo)/A樣=C標(biāo)/C樣C樣=C標(biāo)·（A樣/A標(biāo)）2020/12/1756ppt課件3.對(duì)照法:2020/12/1756ppt課件四、減小測(cè)定誤差的方法1.選擇合適的顯色劑，使顯色反應(yīng)的靈敏度高、選擇性好、顯色產(chǎn)物穩(wěn)定。2.通過(guò)條件試驗(yàn)，找出最佳的試劑加入量、酸度、溫度和顯色時(shí)間。并使樣品與標(biāo)準(zhǔn)品在盡可能完全相同的條件下進(jìn)行測(cè)定。3.通過(guò)加掩蔽劑和控制pH值，消除共存離子的干擾。4.盡可能在吸光度0.1-1.0范圍內(nèi)測(cè)定，以減小吸光度誤差。A<0.1的溶液，盡量用摩爾吸光系數(shù)大的顯色反應(yīng)，在最大吸收波長(zhǎng)出進(jìn)行測(cè)定，吸收池厚度大一些，溶液可通過(guò)萃取、濃縮、增大取樣量來(lái)增加吸光度