并購(gòu)重組-6DNA重組-

2024/4/312024/4/21DNA重組（recombination）是指發(fā)生在DNA分子內(nèi)或DNA分子之間核苷酸序列的交換、重排和轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，是已有遺傳物質(zhì)的重新組合過(guò)程。它主要有同源重組、位點(diǎn)特異性重組和轉(zhuǎn)座重組三種形式。作用：生物體通過(guò)重組，既可以產(chǎn)生新的基因或等位基因的組合，還可能創(chuàng)造出新的基因，使種群內(nèi)遺傳物質(zhì)的多樣性提高；此外，重組還被用于DNA損傷的修復(fù)，而某些病毒利用重組將自身的DNA整合到宿主細(xì)胞的DNA上。2024/4/32DNA重組（recombination）是指發(fā)生在DNA分子

2024/4/332024/4/23由文特爾召集、諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)得主漢米爾頓.史密斯領(lǐng)導(dǎo)的二十人精英小組首次制出了合成染色體，染色體含有三百八十一個(gè)基因、五十八萬(wàn)個(gè)basepair的基因密碼。2024/4/34由文特爾召集、諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)得主漢米爾頓.史密斯領(lǐng)導(dǎo)的二十人精新生命體擁有人工DNA這組染色體的DNA序列基本上參照一種名為生殖支原體(MycoplasmaGenitalium)的細(xì)菌。研究員把它的DNA序列簡(jiǎn)化了五分之一，只剩下足以維持生命的基本部分。2024/4/35新生命體擁有人工DNA20研究小組已把這組染色體植入一個(gè)活菌細(xì)胞中，成為一個(gè)近乎全新的生命體。2024/4/36研究小組已把這組染色體植入一個(gè)活菌細(xì)胞中，成為一個(gè)近乎全新的這個(gè)新生命體的細(xì)胞自我復(fù)制和新陳代謝的能力，和接受移植的細(xì)胞相關(guān)。

文特爾強(qiáng)調(diào)：“我們將從讀取基因序列階段躍升到有能力編寫，這將賦予我們做一些從前從未想過(guò)的事情的能力?！?/p>

2024/4/37這個(gè)新生命體的細(xì)胞自我復(fù)制和新陳代謝的能力，和接受移植的細(xì)胞制造設(shè)計(jì)基因組的技術(shù)未來(lái)可能會(huì)帶來(lái)非?？捎^的裨益：用來(lái)制造人們目前意想不到的替代能源，像純粹用蔗糖分解的丁烷和丙烷；或者創(chuàng)造出能吸收二氧化碳的細(xì)菌，以紓緩全球暖化。2024/4/38制造設(shè)計(jì)基因組的技術(shù)未來(lái)可能會(huì)帶來(lái)非?？捎^的裨益：2024/同源重組（homologousrecombination）也稱為一般性重組（generalrecombination），它是一種在兩個(gè)DNA分子的同源序列之間直接進(jìn)行交換的重組形式。同源重組不依賴于序列，但依賴于序列同源性。2024/4/39同源重組（homologousrecombination）同源重組的發(fā)生必須滿足以下幾個(gè)條件：（1）在進(jìn)行重組的交叉區(qū)域含有完全相同或幾乎相同的核苷酸序列；（2）兩個(gè)雙鏈DNA分子之間發(fā)生互補(bǔ)配對(duì)；（3）需要特定的重組酶的催化；（4）形成異源的雙鏈；（5）發(fā)生聯(lián)會(huì)（synapsis）。2024/4/310同源重組的發(fā)生必須滿足以下幾個(gè)條件：（1）在進(jìn)行重組的交叉區(qū)圖6-1同源重組的Holliday模型

一、同源重組的分子機(jī)制2024/4/311圖6-1同源重組的Holliday模型一、同源重組的分圖6-2電鏡下的Holliday連接

2024/4/312圖6-2電鏡下的Holliday連接2024/4/21圖6-3同源重組的雙鏈斷裂模型

2024/4/313圖6-3同源重組的雙鏈斷裂模型2024/4/213以E.coli為例：（一）RecA蛋白R(shí)ecA蛋白是同源重組中最重要的蛋白質(zhì)，參與E.coli所有的同源重組途徑。2024/4/314以E.coli為例：2024/4/214RecA的主要功能包括：（1）促進(jìn)2個(gè)DNA分子之間的鏈交換；（2）參與SOS反應(yīng)—作為共蛋白酶（co-protease）促進(jìn)LexA蛋白的自水解。2024/4/315RecA的主要功能包括：2024/4/215圖6-4RecA蛋白促進(jìn)2個(gè)雙鏈DNA分子鏈之間的交換

2024/4/316圖6-4RecA蛋白促進(jìn)2個(gè)雙鏈DNA分子鏈之間的交換（二）RecBCD蛋白又稱為RecBCD酶，由RecB、RecC和RecD三個(gè)亞基組成，具有5種酶的活性，即外切核酸酶V、解鏈酶、核酸內(nèi)切酶、ATP酶和單鏈DNA外切酶。2024/4/317（二）RecBCD蛋白2024/4/217圖6-5RecBCD酶的在同源重組中的作用

產(chǎn)生單鏈DNA，為RecA發(fā)揮作用創(chuàng)造條件，由此最終起動(dòng)了鏈交換和重組反應(yīng)2024/4/318圖6-5RecBCD酶的在同源重組中的作用產(chǎn)生單鏈DNχ序列是一段特殊的堿基序列，其一致序列是5′-GCTGGTGG-3′，它的存在能顯著提高重組的頻率。在重組中的作用是調(diào)節(jié)RecBCD的酶活性，刺激RecBCD重組途徑。據(jù)估計(jì)，E.coli整個(gè)基因組含有1000個(gè)以上的χ序列。2024/4/319χ序列是一段特殊的堿基序列，其一致序列是5′-GCTGGT（三）RuvA、RuvB和RuvC蛋白2024/4/320RuvA、RuvB和RuvC在同源重組中的作用

（三）RuvA、RuvB和RuvC蛋白2024/4/220R圖6-6RuvC的作用模型

2024/4/321圖6-6RuvC的作用模型2024/4/2214.其它同源重組蛋白在E.coli中大概有30種蛋白質(zhì)與同源重組有關(guān)，除了上面詳細(xì)介紹的幾種以外，還有：RecE，RecJ，RecQ，RecF，RecR，RecT，RecG，Rus，RecN，SbcA，SbcB，SbcC，SbcD，DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I；DNA旋轉(zhuǎn)酶；連接酶；聚合酶I；DNA解鏈酶II；DNA解鏈酶IV；SSB。2024/4/3224.其它同源重組蛋白2024/4/222E.coli主要有三條同源重組途徑，其中的許多成分是SOS-誘導(dǎo)的，這意味著它們?cè)诩?xì)胞中正常的功能可能是重組介導(dǎo)的DNA修復(fù)。用于基因工程的某些菌株其參與重組的基因幾乎都無(wú)活性，這有利于防止大的質(zhì)粒之間和質(zhì)粒與染色體之間發(fā)生不必要的重組。2024/4/323E.coli主要有三條同源重組途徑，其中的許多成分是SOS三、E.coli幾種重要的同源重組途徑

（一）RecBCD途徑這是E.coli最主要的重組途徑。除了RecBCD蛋白以外，還需要RecA、SSB、RuvA、RuvB、RuvC、DNA聚合酶I、連接酶和旋轉(zhuǎn)酶。此外，還需要χ序列.2024/4/324三、E.coli幾種重要的同源重組途徑

（一）RecBCD圖6-8RecBCD同源重組途徑

2024/4/325圖6-8RecBCD同源重組途徑2024/4/225（二）RecF途徑和RecE途徑RecF途徑主要是質(zhì)粒之間進(jìn)行重組的途徑。2024/4/326（二）RecF途徑和RecE途徑2024/4/226四、真核生物的同源重組主要發(fā)生在細(xì)胞減數(shù)分裂前期I的兩個(gè)配對(duì)的同源染色體之間（非姊妹染色單體），先在細(xì)線期和合線期形成聯(lián)會(huì)復(fù)合體，再在粗線期進(jìn)行交換。也會(huì)發(fā)生在DNA損傷修復(fù)之中，主要用以修復(fù)DNA雙鏈斷裂、單鏈斷裂和鏈間交聯(lián)等損傷。2024/4/327四、真核生物的同源重組2024/4/2272024/4/328如果不發(fā)生交換，則減數(shù)分裂受阻，以確保在交換發(fā)生之前細(xì)胞不能分裂。2024/4/228如果不發(fā)生交換，則減數(shù)分裂受阻，以確保在圖6-9真核細(xì)胞DNA雙鏈斷裂的重組修復(fù)

2024/4/329圖6-9真核細(xì)胞DNA雙鏈斷裂的重組修復(fù)2024/4/是指發(fā)生在DNA特異性位點(diǎn)上的重組。參與重組的特異性位點(diǎn)需要專門的蛋白質(zhì)識(shí)別和結(jié)合。2024/4/330是指發(fā)生在DNA特異性位點(diǎn)上的重組。2024/4/230位點(diǎn)特異性重組的功能包括：（1）調(diào)節(jié)噬菌體DNA與宿主菌染色體DNA的整合；（2）調(diào)節(jié)特定的基因表達(dá)；（3）調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育期間程序性的DNA重排。2024/4/331位點(diǎn)特異性重組的功能包括：2024/4/231第一例位點(diǎn)特異性重組發(fā)現(xiàn)在E.coli染色體DNA和λ噬菌體DNA之間。λ噬菌體感染E.coli以后，其DNA通過(guò)兩端的粘性位點(diǎn)（cos位點(diǎn)）自我環(huán)化，并在DNA連接酶的催化下實(shí)現(xiàn)共價(jià)閉環(huán)。隨后，噬菌體必須在裂解途徑和溶源途徑做出選擇。2024/4/332第一例位點(diǎn)特異性重組發(fā)現(xiàn)在E.coli染色體DNA和λ噬菌如果選擇裂解途徑，噬菌體會(huì)在較短的時(shí)間內(nèi)通過(guò)滾環(huán)復(fù)制大量增值，并導(dǎo)致宿主菌裂解；如果是溶源途徑，噬菌體DNA就以位點(diǎn)特異性的重組整合到宿主染色體DNA上，進(jìn)入到原噬菌體狀態(tài)。在這期間，噬菌體幾乎所有的基因都不表達(dá)。如果選擇裂解途徑，噬菌體會(huì)在較短的時(shí)間內(nèi)通過(guò)滾環(huán)復(fù)制大量增值圖6-11λ噬菌體的位點(diǎn)特異性整合

2024/4/334圖6-11λ噬菌體的位點(diǎn)特異性整合2024/4/234圖6-12λ噬菌體重組整合或切除時(shí)切點(diǎn)的序列

2024/4/335圖6-12λ噬菌體重組整合或切除時(shí)切點(diǎn)的序列2024/轉(zhuǎn)座重組（transpositionrecombination）是指DNA上的核苷酸序列從一個(gè)位置轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)位置的現(xiàn)象。發(fā)生轉(zhuǎn)位的DNA片段被稱為轉(zhuǎn)座子（transposons）或可移位的遺傳元件，有時(shí)還被稱為跳躍基因（jumpgene）。2024/4/336轉(zhuǎn)座重組（transpositionrecombinati與前兩種重組不同的是，轉(zhuǎn)座子的靶點(diǎn)與轉(zhuǎn)座子之間不需要序列的同源性。接受轉(zhuǎn)座子的靶位點(diǎn)絕大多數(shù)是隨機(jī)的，但也可能具有一定的傾向性（如存在一致序列或熱點(diǎn)），具體是哪一種與轉(zhuǎn)座子本身的性質(zhì)有關(guān)。2024/4/337與前兩種重組不同的是，轉(zhuǎn)座子的靶點(diǎn)與轉(zhuǎn)座子之間不需要序列的同轉(zhuǎn)座重組可以導(dǎo)致突變，如果插入到一個(gè)基因的內(nèi)部，很可能導(dǎo)致基因的失活；如果插入到一個(gè)基因的上游，又可能導(dǎo)致基因的激活。2024/4/338轉(zhuǎn)座重組可以導(dǎo)致突變，如果插入到一個(gè)基因的內(nèi)部，很可能導(dǎo)致基圖6-14轉(zhuǎn)座子對(duì)基因X的可能影響

2024/4/339圖6-14轉(zhuǎn)座子對(duì)基因X的可能影響2024/4/239一、原核生物的轉(zhuǎn)座子人們最早在E.coli內(nèi)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座現(xiàn)象，首先被發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)座子是插入序列（insertionsequences，IS）。迄今為止，在細(xì)菌內(nèi)已發(fā)現(xiàn)四類轉(zhuǎn)座子。2024/4/340一、原核生物的轉(zhuǎn)座子2024/4/240（一）第一類轉(zhuǎn)座子

即IS，它們是最簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)座元件，具有以下特征：（1）長(zhǎng)度較小，通常在700bp~1800bp之間；（2）兩端通常含有10bp~40bp長(zhǎng)的IR(invertedrepeats)序列；（3）內(nèi)部一般只有一個(gè)基因，其表達(dá)產(chǎn)物只與插入事件有關(guān)，是專門催化轉(zhuǎn)位反應(yīng)的轉(zhuǎn)座酶（tnpA），缺乏抗生素或其它毒性抗性基因；2024/4/341（一）第一類轉(zhuǎn)座子2024/4/241圖6-15第一類轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)

2024/4/342圖6-15第一類轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)2024/4/242（4）通過(guò)“剪切”和“粘貼”的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)座，轉(zhuǎn)座結(jié)束后可導(dǎo)致靶位點(diǎn)序列重復(fù)（參看圖6-16）。（5）有少數(shù)（如IS91）沒有明顯的IR序列，通過(guò)滾環(huán)復(fù)制和粘貼的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)座。

2024/4/343（4）通過(guò)“剪切”和“粘貼”的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)座，轉(zhuǎn)座結(jié)束后可導(dǎo)致圖6-16第一類轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座機(jī)制

2024/4/344圖6-16第一類轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座機(jī)制2024/4/244（二）第二類轉(zhuǎn)座子又稱為復(fù)雜型轉(zhuǎn)座子，具有以下特征：（1）較長(zhǎng)，長(zhǎng)度在2.5Kb~20Kb之間；（2）兩側(cè)含有35bp~40bp長(zhǎng)的IR序列；（3）內(nèi)部通常含有不止一個(gè)結(jié)構(gòu)基因。常見的結(jié)構(gòu)基因包括：tnpA—編碼轉(zhuǎn)座酶，tnpR—編碼解離酶，一個(gè)或幾個(gè)特定的抗生素抗性基因；（4）轉(zhuǎn)座以后導(dǎo)致約5bp長(zhǎng)的靶位點(diǎn)序列發(fā)生重復(fù)，結(jié)果導(dǎo)致在轉(zhuǎn)座子兩側(cè)產(chǎn)生直接重復(fù)序列。2024/4/345（二）第二類轉(zhuǎn)座子2024/4/245圖6-17第二類轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)

2024/4/346圖6-17第二類轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)2024/4/246表6-2幾種第二類轉(zhuǎn)座子的特征2024/4/347表6-2幾種第二類轉(zhuǎn)座子的特征2024/4/247（三）第三類轉(zhuǎn)座子又名復(fù)合型轉(zhuǎn)座子（compositetransposon）2024/4/348圖6-18第三類轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)

（三）第三類轉(zhuǎn)座子2024/4/248圖6-18第三類轉(zhuǎn)（四）第四類轉(zhuǎn)座子這一類轉(zhuǎn)座子最為典型的是Mu噬菌體，它是E.coli的一種溫和性噬菌體，具有裂解和溶源循環(huán)生長(zhǎng)周期。在其復(fù)制的時(shí)候，它通過(guò)復(fù)制型轉(zhuǎn)位隨機(jī)插入到宿主DNA的其它區(qū)域，很容易誘發(fā)宿主細(xì)胞的各種突變，因此它有時(shí)被稱為誘變子（mutator）。2024/4/349（四）第四類轉(zhuǎn)座子2024/4/249二、真核生物的轉(zhuǎn)座子一般可以根據(jù)轉(zhuǎn)座的機(jī)理將真核轉(zhuǎn)座子分為二類：第一類是需要RNA中間體的反轉(zhuǎn)座子（retrotransposons）或逆轉(zhuǎn)座子，其轉(zhuǎn)座過(guò)程是DNA→RNA→DNA，中間有一環(huán)節(jié)是反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；第二類是無(wú)RNA中間體的DNA轉(zhuǎn)座子，其轉(zhuǎn)座過(guò)程是DNA→DNA。2024/4/350二、真核生物的轉(zhuǎn)座子2024/4/250DNA轉(zhuǎn)座子還可以進(jìn)一步分為復(fù)制型DNA轉(zhuǎn)座子保留型DNA轉(zhuǎn)座子2024/4/351DNA轉(zhuǎn)座子還可以進(jìn)一步分為2024/4/251例：玉米的Ac-Ds系統(tǒng)2024/4/352例：2024/4/252圖6-23逆轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座機(jī)制

2024/4/353圖6-23逆轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座機(jī)制2024/4/253三、轉(zhuǎn)座的分子機(jī)制2024/4/354圖6-26由DDE轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座子三種剪切方式三、轉(zhuǎn)座的分子機(jī)制2024/4/254圖6-26由DDEDNA重組是指發(fā)生在DNA分子內(nèi)或DNA分子之間核苷酸序列的交換、重排和轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，主要包括同源重組、位點(diǎn)特異性重組和轉(zhuǎn)座重組。同源重組是兩個(gè)DNA分子的同源序列直接進(jìn)行交換。細(xì)菌的接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化和真核細(xì)胞的同源染色體之間的交換等都屬于同源重組。解釋同源重組的模型有Holliday模型、Aviemore模型（單鏈斷裂模型）和雙鏈斷裂模型。三種模型在重組過(guò)程中形成χ狀的Holliday連接是一致的。同源重組的基本步驟包括：鏈斷裂與切除、鏈侵入、退火與合成、形成Holliday結(jié)構(gòu)、Holliday連接的分離和交換。2024/4/355DNA重組是指發(fā)生在DNA分子內(nèi)或DNA分子之間核苷酸序列的參與E.coli同源重組有關(guān)的蛋白質(zhì)包括：RecA蛋白、RecBCD蛋白、RuvA、RuvB和RuvC蛋白等。RecA蛋白參與E.coli所有的同源重組途徑。RecA的主要功能有促進(jìn)2個(gè)DNA分子之間鏈的交換，以及作為共蛋白酶促進(jìn)LexA阻遏蛋白的自我水解。RecBCD蛋白由RecB、RecC和RecD三個(gè)亞基組成，具有外切核酸酶V、解鏈酶、核酸內(nèi)切酶、ATP酶和單鏈DNA外切酶共五個(gè)酶活性。RuvA蛋白能識(shí)別Holliday連接，協(xié)助RuvB蛋白催化分叉的遷移。RuvB蛋白是一個(gè)解鏈酶，其功能是催化Holliday連接中分叉的遷移。RuvC蛋白是一種特殊的核酸內(nèi)切酶，催化Holliday連接的分離，因此被稱為解離酶。2024/4/356參與E.coli同源重組有關(guān)的蛋白質(zhì)包括：RecA蛋白、R發(fā)生在E.coli的同源重組途徑有RecBCD途徑、RecF途徑和RecE途徑。真核生物的同源重組主要發(fā)生在細(xì)胞的減數(shù)分裂的前期I的兩個(gè)配對(duì)的同源染色體之間。同源重組也會(huì)發(fā)生在DNA修復(fù)之中，用以修復(fù)DNA雙鏈斷裂、單鏈斷裂和鏈間交聯(lián)。適合真核生物同源重組的模型應(yīng)該是雙鏈斷裂模型，參與同源重組的主要蛋白質(zhì)有Rad50、Mre11、Nbs1、Spo11、MSH4、Dmc1、PCNA、RPA和DNA聚合酶δ/ε等。2024/4/357發(fā)生在E.coli的同源重組途徑有RecBCD途徑、Rec位點(diǎn)特異性重組是指在DNA特定位點(diǎn)上發(fā)生的重組，需要專門的蛋白質(zhì)識(shí)別發(fā)生重組的特異性位點(diǎn)并催化重組反應(yīng)。位點(diǎn)特異性重組也發(fā)生鏈交換、形成Holliday連接、分叉遷移和Holliday連接解離。位點(diǎn)特異性重組可以發(fā)生在2個(gè)DNA分子之間，導(dǎo)致2個(gè)DNA分子之間發(fā)生整合。位點(diǎn)特異性重組也可以發(fā)生在1個(gè)DNA分子內(nèi)部，可能導(dǎo)致缺失或倒位。位點(diǎn)特異性重組的功能包括：調(diào)節(jié)噬菌體的整合、