孫長(zhǎng)勝-免疫與生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室

免疫與生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室09級(jí)-孫長(zhǎng)勝生物化學(xué)與分子生物學(xué)專業(yè)蛋白質(zhì)，酶學(xué)酶工程方向20092030312011年12月免疫與生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室09級(jí)-孫長(zhǎng)勝碩士期間主要研究的內(nèi)容總結(jié)按時(shí)間順序進(jìn)行如實(shí)記錄，其中有一些時(shí)間段幾項(xiàng)研究同時(shí)進(jìn)行記錄主要包括如下內(nèi)容：（參考本人實(shí)驗(yàn)記錄5本，每個(gè)研究項(xiàng)目的PPT，及實(shí)驗(yàn)圖片結(jié)果）時(shí)間內(nèi)容結(jié)果用途展望碩士期間主要研究的內(nèi)容總結(jié)按時(shí)間順序進(jìn)行2實(shí)驗(yàn)1：lipB基因的克隆與表達(dá)時(shí)間：2009年9月4日-2009年12月4日（三個(gè)月）載體：pET30a-tev-rou-LipB，酶切位點(diǎn)BamHⅠ，HindⅢ菌株：DH5α和BL21菌株保存于-70℃冰箱結(jié)果：成功純化獲得10mL高純度LipB蛋白保存于-70℃冰箱（未使用）用途：幫助師姐（高緒娜）用于研究LipB與LipD蛋白之間關(guān)系（未做）實(shí)驗(yàn)1：lipB基因的克隆與表達(dá)時(shí)間：2009年9月4日-23實(shí)驗(yàn)1：lipB基因的克隆與表達(dá)核心技術(shù)：全面學(xué)習(xí)分子生物學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作PCR（三輪），提取質(zhì)粒，瓊脂糖電泳，切膠回收，酶切連接，轉(zhuǎn)化，菌落PCR，搖菌，保種，送樣測(cè)序蛋白表達(dá)，測(cè)OD值提取周質(zhì)，超聲波破碎，Ni柱純化，SDS檢測(cè)分子篩G-25脫鹽，TEV蛋白酶切，離子交換柱DEAE純化，G250測(cè)蛋白含量，分光光度計(jì)測(cè)蛋白含量透析袋透析樣品，自動(dòng)部分收集裝置，冷凍干燥裝置配置培養(yǎng)基及各種常用試劑實(shí)驗(yàn)1：lipB基因的克隆與表達(dá)核心技術(shù)：全面學(xué)習(xí)分子生物學(xué)4實(shí)驗(yàn)2：飼養(yǎng)果蠅時(shí)間：2009年12月5日-2011年6月（一年半）內(nèi)容：向師姐（狄廷娣）學(xué)習(xí)果蠅的基本知識(shí)及管理果蠅核心技術(shù)：配制果蠅培養(yǎng)基果蠅保種更換培養(yǎng)基（每月一次）清洗果蠅保種指管成功將所有轉(zhuǎn)基因果蠅分類整理果蠅受螨蟲(chóng)污染一次，轉(zhuǎn)基因品系86死亡一次，成功解決。實(shí)驗(yàn)2：飼養(yǎng)果蠅時(shí)間：2009年12月5日-2011年6月（5實(shí)驗(yàn)3：構(gòu)建載體時(shí)間：2009年12月7日-2009年12月17日載體：pET28b-sp-hisYeb-ACP/P→A，酶切位點(diǎn)NcoⅠ，HindⅢ,構(gòu)建pBAD24-sp-hisYeb-ACP/P→A,檢測(cè)pBAD24-sp-hisYeb-BCCP,檢測(cè)pBAD24-sp-hisYeb-ACP-4A/6A/8A,4S/6S/8S菌株：DH5α菌株保存于-70℃冰箱結(jié)果：均成功用途：幫助師姐（高緒娜）做實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)3：構(gòu)建載體時(shí)間：2009年12月7日-2009年12月6實(shí)驗(yàn)4：突變groEL基因的克隆與表達(dá)1時(shí)間：2009年12月22日-2010年1月21日（放假前）載體：pET30a-tev-mutGroEL，酶切位點(diǎn)EcoRⅠ，HindⅢ結(jié)果：PCR擴(kuò)增出groEL后，利用定點(diǎn)突變技術(shù)突變第87號(hào)氨基酸。由于操作技術(shù)的不熟練及搖種管清洗不干凈（后購(gòu)買(mǎi)超聲波清洗儀），及培養(yǎng)基染菌，感受態(tài)有問(wèn)題等多方面原因?qū)е缕陂g沒(méi)有完成到測(cè)序正確這一實(shí)驗(yàn)步驟。實(shí)驗(yàn)4：突變groEL基因的克隆與表達(dá)1時(shí)間：2009年127實(shí)驗(yàn)4：突變groEL基因的克隆與表達(dá)2時(shí)間：2010年2月27日-2010年5月19日（3個(gè)月）載體：成功構(gòu)建pET30a-tev-mutGroEL，酶切位點(diǎn)EcoRⅠ，HindⅢ菌株：DH5α和BL21相應(yīng)菌株保存于-70℃冰箱結(jié)果：成功獲得上述菌株，成功進(jìn)行融合蛋白表達(dá)純化，成功進(jìn)行TEV蛋白酶酶切，最后獲得目的蛋白失敗。該融合蛋白表達(dá)量很大，Ni純化效果好，TEV蛋白酶能酶切，但分子篩和離子交換柱純化導(dǎo)致降解，原因不明。之后Ni柱，分子篩，離子交換柱再生后，多次重復(fù)試驗(yàn)后結(jié)果相同。至此純化該目的蛋白實(shí)驗(yàn)失敗！實(shí)驗(yàn)4：突變groEL基因的克隆與表達(dá)2時(shí)間：2010年2月8實(shí)驗(yàn)5：birA基因的克隆與表達(dá)時(shí)間：2010年3月15日-2010年4月17日（一個(gè)月）載體：pET28b-His6-BirA，酶切位點(diǎn)NcoⅠ，HindⅢ菌株：DH5α和BL21相應(yīng)菌株保存于-70℃冰箱結(jié)果：成功純化獲得8mL高純度BirA蛋白保存于-70℃冰箱（未使用）用途：幫助師兄（陳南）用于BirA的表達(dá)情況研究及pBAD34-hisbirA與含有BCCP的質(zhì)粒共表達(dá)情況的研究核心技術(shù)：常規(guī)構(gòu)建質(zhì)粒，常規(guī)表達(dá)純化（表達(dá)量大，易純化），分子篩脫鹽后保存實(shí)驗(yàn)5：birA基因的克隆與表達(dá)時(shí)間：2010年3月15日-9實(shí)驗(yàn)6：構(gòu)建載體時(shí)間：2010年4月11日-2010年5月17日（1個(gè)月）菌株：DH5α及JM109相關(guān)菌株保存于-70℃冰箱結(jié)果：成功獲得含pBAD24-sp-hisMBP-ACP，pBAD24-sp-hisYeb-ACP的菌并制備相應(yīng)感受態(tài)，成功獲得菌pBAD34-ACPS質(zhì)粒,成功轉(zhuǎn)化獲得上述兩種雙質(zhì)粒菌株，成功構(gòu)建pBAD24-sp-hisMBP-ACP（突變），pBAD24-sp-hisYeb-ACP（突變）質(zhì)粒，成功表達(dá)，提周質(zhì)，SDS檢測(cè)三種JM109菌株的pQE-sp-hisYeb-sulf原始菌及基因敲除菌。用途：幫助師姐（高緒娜）師兄（陳南）用于大腸桿菌分泌表達(dá)的研究實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)6：構(gòu)建載體時(shí)間：2010年4月11日-2010年5月110實(shí)驗(yàn)7：果蠅理論學(xué)習(xí)時(shí)間：2010年6月-2010年12月（6個(gè)月）內(nèi)容：觀察并學(xué)習(xí)果蠅基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)詳細(xì)查看果蠅相關(guān)文獻(xiàn)（100篇左右）重點(diǎn)了解果蠅局部免疫相關(guān)知識(shí)背景，并制定研究果蠅氣管局部免疫實(shí)驗(yàn)方案。廣州天河區(qū)政府農(nóng)業(yè)局農(nóng)業(yè)局實(shí)習(xí)-農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留檢測(cè)員實(shí)驗(yàn)7：果蠅理論學(xué)習(xí)時(shí)間：2010年6月-2010年12月（11實(shí)驗(yàn)8：蛋白表達(dá)時(shí)間：2010年8月27日-2010年9月17日內(nèi)容：pBAD24-sp-hisMBP-ACP，pBAD24-sp-hisYeb-ACP與pBAD34-ACPS的共表達(dá)DH5a菌株pBAD24-sp-hisMBP-ACP，pBAD24-sp-hisYeb-ACP與pBAD34-ACPS的共表達(dá)BL21菌株pET28b-sp-hisMBP-ACP，pET28b-sp-hisYeb-ACP的表達(dá)，加疊氮化鈉大量表達(dá)，提周質(zhì)，用超濾柱濃縮，過(guò)Ni柱等用途：幫助師兄（陳南）用于大腸桿菌分泌表達(dá)的研究實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)8：蛋白表達(dá)時(shí)間：2010年8月27日-2010年9月112實(shí)驗(yàn)9：果蠅氣管熒光觀察研究實(shí)驗(yàn)時(shí)間：2010年9月13日-2010年11月23日（2個(gè)月）內(nèi)容：采用不同的誘導(dǎo)方式，及不同的菌探索，處理果蠅，進(jìn)行多次觀察果蠅氣管及全身用含有pET30-GFP的大腸桿菌飼喂果蠅，進(jìn)行熒光觀察合成引物，提取果蠅基因組進(jìn)行品系確認(rèn)結(jié)果及核心技術(shù)：成功掌握果蠅的誘導(dǎo)處理方法成功掌握三個(gè)實(shí)驗(yàn)室的不同熒光顯微鏡使用方法成功得到一系列果蠅氣管熒光照片，并確定一些結(jié)論遺憾的是由于師姐（郝芬）畢業(yè)論文中的引物錯(cuò)誤（2011年4月馬皖燕發(fā)現(xiàn)），導(dǎo)致PCR確定果蠅品系失敗，至此實(shí)驗(yàn)失敗終結(jié)！實(shí)驗(yàn)9：果蠅氣管熒光觀察研究實(shí)驗(yàn)時(shí)間：2010年9月13日-13實(shí)驗(yàn)10：重新表達(dá)純化GroEL蛋白時(shí)間：2010年11月11日-2011年8月27日（9個(gè)月）載體：pET30a-tev-mutGroEL，BL21菌株（3月7日保存）結(jié)果：此次按照常規(guī)表達(dá)純化方法很容易的就得到目的蛋白，未出現(xiàn)之前的講解現(xiàn)象至此終于成功純化獲得4mL高純度mutGroEL蛋白保存于-70℃冰箱用途：純化的mutGroEL蛋白用于本人關(guān)于SecA蛋白功能的體外研究實(shí)驗(yàn)用融合蛋白用于本人關(guān)于重組His6-TEV，ACP-TEV蛋白酶特性的研究，作為底物蛋白實(shí)驗(yàn)10：重新表達(dá)純化GroEL蛋白時(shí)間：2010年11月114實(shí)驗(yàn)11：SecB表達(dá)與純化時(shí)間：2010年11月22日-2011年8月27日（9個(gè)月）載體：pET30a-His6-tev-SecB，酶切位點(diǎn)BamHⅠ，HindIII菌株：DH5α和BL21菌株保存于-70℃冰箱結(jié)果：多次表達(dá)純化結(jié)果表明，產(chǎn)量大，易純化，現(xiàn)成功純化獲得10mL高純度SecB蛋白保存于-70℃冰箱用途：純化的SecB蛋白用于本人關(guān)于SecA蛋白功能的體外研究實(shí)驗(yàn)用實(shí)驗(yàn)11：SecB表達(dá)與純化時(shí)間：2010年11月22日-215實(shí)驗(yàn)12：sp-GFP融合蛋白的獲得時(shí)間：2010年12月1日-2011年7月18日（8個(gè)月）載體：成功構(gòu)建如下載體pET30a-his-tev-SP-Yeb-GFPpET30a-his-tev-SP-MBP-GFPpET28b-sp-hisMBP-tev-sp-GFPpET30a-his-tev-sp-GFPpET30a-hisMBP-tev-sp-GFPpET28b-sp-hisYeb-GFP-6HispET28b-sp-hisMBP-GFP-6His菌株：DH5α和BL21對(duì)應(yīng)菌株保存于-70℃冰箱實(shí)驗(yàn)12：sp-GFP融合蛋白的獲得時(shí)間：2010年12月116實(shí)驗(yàn)12：sp-GFP融合蛋白的獲得結(jié)果：成功構(gòu)建一系列載體，成功表達(dá)一系列融合蛋白，但部分菌體分泌表達(dá)量少，或胞內(nèi)表達(dá)量大但形成包涵體，可溶性目的蛋白少，不易純化。含有TEV酶切位點(diǎn)的融合蛋白不能很好酶切開(kāi)。選擇pET28b-sp-hisMBP-GFP-6His進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。表達(dá)純化方法采用：NaN3抑制后，先提周質(zhì)，對(duì)剩余沉淀進(jìn)行破碎，過(guò)Ni柱純化，效果不錯(cuò)！用途：純化的SP...GFP蛋白用于本人關(guān)于SecA蛋白功能的體外研究實(shí)驗(yàn)用核心技術(shù)：設(shè)計(jì)引物，序列比對(duì)分析，蛋白表達(dá)純化實(shí)驗(yàn)12：sp-GFP融合蛋白的獲得結(jié)果：成功構(gòu)建一系列載體17實(shí)驗(yàn)13：SecA的表達(dá)及功能的研究時(shí)間：2010年11月22日-2011年8月27日（9個(gè)月）載體：pET30a-hisMBP-tev-SecApET30a-His-SecApET30a-HisMBP-tev-rou-SecA菌株：DH5α和BL21相關(guān)菌株保存于-70℃冰箱結(jié)果：第一個(gè)融合蛋白無(wú)法切開(kāi)，單純表達(dá)SecA降解，第三個(gè)表達(dá)量大，易純化，能完全酶切，故選擇第三個(gè)表達(dá)純化?，F(xiàn)成功純化獲得4mL高純度SecA蛋白保存于-70℃冰箱實(shí)驗(yàn)13：SecA的表達(dá)及功能的研究時(shí)間：2010年11月218實(shí)驗(yàn)13：SecA的表達(dá)及功能的研究用途：研究SecA的功能用之前純化得到的SP-GFP先用不同濃度的尿素變性處理之后加入SceB結(jié)合反應(yīng)，熒光分光度計(jì)測(cè)量。之后加入SecA及GroEL，測(cè)值后，再次加入ATP，測(cè)值分析多次探索及重復(fù)實(shí)驗(yàn)后，未得到預(yù)期結(jié)果，原因復(fù)雜核心技術(shù)引物設(shè)計(jì)，T栽連接，蛋白表達(dá)純化，濃縮脫鹽柱四種蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)體系確定，各組分含量確定熒光分光光度計(jì)使用非變性SDS，westrenblot實(shí)驗(yàn)13：SecA的表達(dá)及功能的研究用途：19實(shí)驗(yàn)14：純化系統(tǒng)及MBP柱摸索時(shí)間：2010年12月29日-2011年3月25日（3個(gè)月）內(nèi)容：新購(gòu)買(mǎi)的電腦層析采集儀以及MBP親和層預(yù)裝柱探索使用熟悉整套蛋白純化分析系統(tǒng)（分子篩S-100，離子交換柱DEAE，Ni柱，MBP柱，恒流泵，凝膠蛋白檢測(cè)儀，電腦層析采集儀，自動(dòng)部分收集器，梯度混合儀）利用上述裝置對(duì)所需要的目的蛋白進(jìn)行純化分析，結(jié)果證明MBP預(yù)裝柱有問(wèn)題實(shí)驗(yàn)14：純化系統(tǒng)及MBP柱摸索時(shí)間：2010年12月29日20實(shí)驗(yàn)15：轉(zhuǎn)基因果蠅時(shí)間：2010年12月-2011年4月（5個(gè)月）內(nèi)容：幫助師姐（馬婉燕）進(jìn)行轉(zhuǎn)基因果蠅，同時(shí)自己也親自進(jìn)行一次轉(zhuǎn)基因果蠅操作，但失敗。學(xué)習(xí)激光共聚焦操作，成功！核心技術(shù)：轉(zhuǎn)基因果蠅相關(guān)操作激光共聚焦儀器使用轉(zhuǎn)基因果蠅雜交及形態(tài)學(xué)區(qū)分誘導(dǎo)處理熒光顯微觀察，激光共聚焦觀察果蠅總蛋白提取westernblot實(shí)驗(yàn)15：轉(zhuǎn)基因果蠅時(shí)間：2010年12月-2011年4月（21實(shí)驗(yàn)16：重組TEV蛋白酶的表達(dá)及特性研究時(shí)間：2011年1月17日-2011年5月3日（4個(gè)月）載體：pET30a-MBP-His6-TEV,師兄構(gòu)建（梁炯球）菌株：DH5α和BL21菌株保存于-70℃冰箱結(jié)果：經(jīng)過(guò)大量表達(dá)純化，兩次成功獲得共計(jì)約40mL的高純度重組His6-TEV蛋白酶存于-70℃冰箱。之后進(jìn)行的一系列TEV蛋白酶切活性分析都成功。用途：由于之前TEV蛋白酶切不開(kāi)一些融合蛋白，本人懷疑之前的TEV蛋白酶失活，即開(kāi)始進(jìn)行表達(dá)純化TEV蛋白酶實(shí)驗(yàn)。同時(shí)由于本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期使用該酶，發(fā)現(xiàn)有一些性質(zhì)，即研究探索用于發(fā)表論文。用于本實(shí)驗(yàn)酶切融合蛋白和本人研究TEV蛋白酶性質(zhì)用實(shí)驗(yàn)16：重組TEV蛋白酶的表達(dá)及特性研究時(shí)間：2011年122實(shí)驗(yàn)17：MBP-BCCP/BCCP87的表達(dá)時(shí)間：2011年3月28日-2011年11月27日（8個(gè)月）載體：pET28b-sp-hisMBP-tev-BCCPpET28b-sp-hisMBP-tev-BCCP87pET30a-hisMBP-tev-BCCPpET30a-hisMBP-tev-BCCP87菌株：DH5α和BL21相關(guān)菌株保存于-70℃冰箱結(jié)果：成功純化獲得5mL高純度融合蛋白MBP-BCCP及MBP-BCCP87保存于-70℃冰箱用途：MBP-BCCP用于重組TEV蛋白酶切底物MBP-BCCP87用于SecA體外實(shí)驗(yàn)研究，替代sp-GFP，與SecA，SecB，GroEL相互作用，通過(guò)二次過(guò)Ni柱，膜胞透析，非變性SDS檢測(cè)與之前的表達(dá)的BirA蛋白做進(jìn)一步研究實(shí)驗(yàn)17：MBP-BCCP/BCCP87的表達(dá)時(shí)間：201123實(shí)驗(yàn)18：指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)時(shí)間：2011年4月-2011年5月（2個(gè)月）內(nèi)容：指導(dǎo)師弟（張哲民），師妹（何秋麗）實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建載體，DH5α和BL21菌株保存于-70℃冰箱pET28b-sp-hisYeb-PGRP（SA）pET30a-His-PGRP（SA）pET30a-his-MBP-Tev-PGRP（SA）pET30a--SecA-GFPpBAD34-SecA-GFPpBAD24-sp-His-Yeb-LacZpBAD24-sp-His-Yeb-ACP成功表達(dá)純化實(shí)驗(yàn)18：指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)時(shí)間：2011年4月-2011年5月（2個(gè)24實(shí)驗(yàn)19：整理實(shí)驗(yàn)室時(shí)間：2011年5月-2011年8月（3個(gè)月）內(nèi)容：對(duì)本實(shí)驗(yàn)室儀器進(jìn)行維護(hù)，并分類制定Word版記錄對(duì)本實(shí)驗(yàn)試劑，耗材進(jìn)行分類整理，并分類制定Word版記錄整理4℃冰箱，-20℃冰箱，-70℃冰箱涉及物品復(fù)雜未進(jìn)行整理整理藥品試劑柜實(shí)驗(yàn)19：整理實(shí)驗(yàn)室時(shí)間：2011年5月-2011年8月（325實(shí)驗(yàn)20：ACP-TEV的克隆與表達(dá)時(shí)間：2011年8月1日-2011年11月20日（3個(gè)月）載體：pET28-MBP--TEVpET28-MBP-His6-ACP-TEV原始（2C）與pBAD34-ACPs（共表達(dá)）pET28-MBP-His6-ACP-mTEV（1G）pET28-MBP-His6-ACP-mTEV（2G）突變（2G）與pBAD34-ACPs（共表達(dá)）pET28-MBP-His6-ACP-mTEV（2S）突變（2S）與pBAD34-ACPs（共表達(dá)）菌株：DH5α和BL21菌株保存于-70℃冰箱實(shí)驗(yàn)20：ACP-TEV的克隆與表達(dá)時(shí)間：2011年8月1日26實(shí)驗(yàn)20：ACP-TEV的克隆與表達(dá)結(jié)果：成功表達(dá)上述不同類型的TEV蛋白酶，其中hisACP-TEV蛋白酶有3mL高濃度的存于-70℃冰箱各種蛋白酶均具有活性，原始的ACP-TEV表達(dá)量高，可溶性好，活性強(qiáng)，突變后性質(zhì)有所變化用途：用于本人酶切融合蛋白和進(jìn)行固定化實(shí)驗(yàn)核心技術(shù)：定點(diǎn)突變，單表達(dá)，共表達(dá)，Ni柱，純化，脫鹽濃縮柱，分子篩S-100，蛋白濃度定量，蛋白酶活性檢測(cè)，TEV酶切體系，SDS實(shí)驗(yàn)20：ACP-TEV的克隆與表達(dá)結(jié)果：成功表達(dá)上述不同類27實(shí)驗(yàn)21：重組TEV蛋白酶的固定化