微生物限度檢查及效價檢查技術(shù)

微生物限度檢查技術(shù)效價檢查技術(shù)成都錦華藥業(yè)質(zhì)量部1微生物限度檢查技術(shù)1微生物限度檢查技術(shù)22目錄一、總則環(huán)境、要求二、微生物限度檢查概述及限度標準三、微生物限度檢查計數(shù)方法四、計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查、供試品計數(shù)方法適用性試驗五、供試品檢查：檢驗量、供試品檢查六、控制菌檢查法

3目錄一、總則環(huán)境、要求3一、總則環(huán)境：微生物計數(shù)試驗在不低于GMP現(xiàn)行版要求的D級潔凈環(huán)境、局部潔凈度不低于B級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進行。要求：⑴全過程必須嚴格遵守?zé)o菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。⑵單向流空氣區(qū)域、工作臺面及環(huán)境應(yīng)定期進行監(jiān)測。4一、總則環(huán)境：微生物計數(shù)試驗在不低于GMP現(xiàn)行版要4⑶如供試品有抗菌活性，應(yīng)盡可能去除或中和。供試品檢查時,若使用了中和劑或滅活劑，應(yīng)確認其有效性及對微生物無毒性。⑷供試液制備時如果使用了表面活性劑，應(yīng)確認其對微生物無毒性以及及所使用中和劑或滅活劑的相容5⑶如供試品有抗菌活性，應(yīng)盡可能去除或中和。供試品檢查時,二、微生物限度檢查概述及限度標準1、微生物限度檢查的范圍（1）根據(jù)藥品使用要求，把藥品劃為兩大類：①規(guī)定滅菌藥品如注射劑、嚴重?zé)齻?、眼科用藥②非?guī)定滅菌藥物：包括一般的口服固體制劑藥物，這類藥物允許一定限量的微生物存在，但同時規(guī)定不得有致病菌存在。（2）染菌量檢查：需氧菌、霉菌酵母菌對藥品的污染程度。（3）控制菌檢查：大腸埃希菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌（膏劑）6二、微生物限度檢查概述及限度標準1、微生物限度檢查的范圍6二、微生物限度檢查概述及限度標準2、微生物限度檢查的意義⑴藥品染菌對使用者的潛在危害藥品中所含致病菌，這是造成藥源性感染疾病的直接原因。藥品染菌還可使其產(chǎn)生霉變、酸敗等理化性質(zhì)改變造成藥品失效、變質(zhì)，甚至產(chǎn)生毒素，危害使用者的健康。為保證藥品質(zhì)量，必須對微生物污染進行必要的控制和檢驗。7二、微生物限度檢查概述及限度標準2、微生物限度檢查的意義二、微生物限度檢查概述及限度標準⑵藥品染菌反映藥品生產(chǎn)工藝的科學(xué)性、合理性及質(zhì)量管理水平。微生物限度檢查的各項數(shù)據(jù)，是對藥品生產(chǎn)工藝、生產(chǎn)環(huán)境、質(zhì)量管理及人員素質(zhì)的綜合評價依據(jù)之一。只有優(yōu)良的GMP企業(yè)，才能提供優(yōu)質(zhì)的醫(yī)藥產(chǎn)品，凡工藝條件、生產(chǎn)管理水平、生產(chǎn)人員素質(zhì)差，不注意文明生產(chǎn)的單位和企業(yè)，其生產(chǎn)的藥品染菌必然嚴重，不合格率高。8二、微生物限度檢查概述及限度標準⑵藥品染菌反映藥品生產(chǎn)工藝二、微生物限度檢查概述及限度標準⑶藥品微生物限度檢查的特殊性活體細胞分布不勻多數(shù)處于受損狀態(tài)生境復(fù)雜9二、微生物限度檢查概述及限度標準⑶藥品微生物限度檢查的特二、微生物限度檢查概述及限度標準3、我國藥典，根據(jù)藥品使用的要求，將微生物限度標準分為兩大類：對于規(guī)定滅菌的藥品，包括注射劑和輸液劑，以及用于體腔、嚴重?zé)齻?、潰瘍、出血及眼科用藥等制劑。必須嚴格無菌，即在規(guī)定檢驗量的供檢樣品中不得檢出活微生物。對于非規(guī)定滅菌藥品，包括常用的口服制劑及局部外用制劑。允許在規(guī)定量的樣品中，檢出一定限量的微生物，但不得檢出某些控制菌。10二、微生物限度檢查概述及限度標準3、我國藥典，根據(jù)藥品使用二、微生物限度檢查概述及限度標準及藥品質(zhì)量密切相關(guān)的還有輔料、包裝材料以及生產(chǎn)環(huán)境的檢測和醫(yī)用材料、器械等也都制定了相應(yīng)的微生物學(xué)限度指標。11二、微生物限度檢查概述及限度標準11三、染菌量檢查計數(shù)方法供試品檢查時,應(yīng)根據(jù)供試品理化特性和微生物限度標準等因素選擇計數(shù)方法，所選的方法必須具備檢測充足樣品量的能力，以保證所獲得的試驗結(jié)果能夠判斷供試品是否符合規(guī)定。所選方法的適用性須經(jīng)確認。12三、染菌量檢查計數(shù)方法供試品檢查時,應(yīng)根據(jù)供試品理化特性和

三、染菌量檢查計數(shù)方法

平皿法、薄膜過濾法、最可能數(shù)法（MPN法）MPN法用于微生物計數(shù)時精確度較差，但對于某些微生物污染量很小的供試品，MPN法可能是更適合的方法。供試品檢查時,應(yīng)根據(jù)供試品理化特性和微生物限度標準等因素選擇計數(shù)方法所選方法的適用性須經(jīng)確認。13

三、染菌量檢查計數(shù)方法

平皿法、13四、計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查、供試品計數(shù)方法適用性試驗供試品微生物計數(shù)中所使用的培養(yǎng)基應(yīng)進行適用性檢查。供試品的微生物計數(shù)方法應(yīng)進行方法適用性試驗若檢驗程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗結(jié)果時，計數(shù)方法應(yīng)重新進行適用性試驗。14四、計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查、供試品計數(shù)方法適用性試驗供試四、計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查、供試品計數(shù)方法適用性試驗1、計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和供試品計數(shù)方法適用性試驗⑴菌液制備及使用菌種

試驗用菌株的傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進行保存，以保證試驗菌株的生物學(xué)特性。15四、計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查、供試品計數(shù)方法適用性試驗1、計數(shù)培四、計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查、供試品計數(shù)方法適用性試驗試驗菌株試驗菌液的制備金黃色葡萄球菌〔CMCC(B)26003)〕胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基30～35℃，18～24小時銅綠假單胞菌〔CMCC（B)10104〕枯草芽孢桿菌〔CMCC(B)63501〕白色念珠菌〔CMCC(F)98001〕沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，20～25℃，2～3

天黑曲霉〔CMCC(F)98003〕沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，20～25℃，5～7天，或直接獲得豐富孢子16四、計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查、供試品計數(shù)方法適用性試驗試驗菌株試四、計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查、供試品計數(shù)方法適用性⑵計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查需氧菌總數(shù)計數(shù)金黃色葡萄球菌胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基30~35℃不超過3天銅綠假單胞菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基30~35℃不超過5天黑曲霉霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)白色念珠菌沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基20~25℃不超過5天黑曲霉1717四、計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查、供試品計數(shù)方法適用性⑵計數(shù)培養(yǎng)基適四、計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查、供試品計數(shù)方法適用性計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查每一試驗菌株平行制備2管或2個平皿；接種量不大于100cfu同時，用相應(yīng)的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進行上述試結(jié)果判定：被檢固體培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)及對照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的比值應(yīng)在0.5~2范圍內(nèi)，且菌落形態(tài)大小應(yīng)及對照培養(yǎng)基上的菌落一致；被檢液體培養(yǎng)基管及對照培養(yǎng)基管比較，試驗菌應(yīng)生長良好。18四、計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查、供試品計數(shù)方法適用性計數(shù)培養(yǎng)基適用四、計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查、供試品計數(shù)方法適用性2、計數(shù)方法適用性試驗供試液制備接種和稀釋抗菌活性的去除及滅活供試品中微生物的回收平皿法薄膜過濾法最可能數(shù)法（MPN法）19四、計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查、供試品計數(shù)方法適用性2、計數(shù)方法適五、供試品檢查：檢驗量、供試品檢查檢驗量檢驗量即一次試驗所用的供試品量（g、ml或cm2）。除另有規(guī)定外,一般供試品的檢驗量為10g或10ml；膜劑為100cm2；貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗量可以酌減。檢驗時,應(yīng)從2個以上最小包裝單位中抽取供試品,大蜜丸還不得少于4丸,膜劑還不得少于4片。一般應(yīng)隨機抽取供試品，取規(guī)定容器數(shù)，混合，取規(guī)定量供試品進行檢驗。20五、供試品檢查：檢驗量、供試品檢查檢驗量20五、供試品檢查：檢驗量、供試品檢查供試品檢查按計數(shù)方法適用性試驗確認的計數(shù)方法進行供試品中需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的測定。胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基用于測定需氧菌總數(shù)；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于測定霉菌和酵母菌總數(shù)。陰性對照試驗

：以稀釋劑代替供試液進行陰性對照試驗，陰性對照試驗應(yīng)無菌生長。如果陰性對照有菌生長，應(yīng)進行偏差調(diào)查。21五、供試品檢查：檢驗量、供試品檢查供試品檢查21五、供試品檢查：檢驗量、供試品檢查供試液制備根據(jù)供試品的理化特性及生物學(xué)特性,采取適宜的方法制備供試液。供試液制備若需加溫時,應(yīng)均勻加熱,且溫度不應(yīng)超過45℃。供試液從制備至加入檢驗用培養(yǎng)基,不得超過1小時。制備方法：勻漿儀法利用勻漿儀高速旋轉(zhuǎn)可將固體供試品快速研細，將油性基質(zhì)的軟膏或易吸水的膠囊劑制備成均勻的供試液。該法快捷、高效、均質(zhì)、效果好，不易造成污染，為藥典優(yōu)選的方法。22五、供試品檢查：檢驗量、供試品檢查供試液制備22五、供試品檢查：檢驗量、供試品檢查研磨法：利用研缽將固體供試品研細，將油性基質(zhì)的軟膏劑制備成均勻的供試液。本法勞動強度大，費時，開放式研磨，暴露時間長易造成污染振蕩法：將供試品及稀釋劑置入滅菌錐形瓶內(nèi)，置于振蕩器上震蕩，使固體供試品分散、均質(zhì)。本法簡便，但對水丸劑等堅硬的供試品效果欠佳，分散期長。

23五、供試品檢查：檢驗量、供試品檢查研磨法：利用研缽將固體供五、供試品檢查：檢驗量、供試品檢查供試液制備常用的供試液制備方法如下，如果下列供試液制備方法經(jīng)確認均不適用，應(yīng)建立其他適宜的方法。⑴水溶性供試品取供試品，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或pH7.2磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基溶解或稀釋制成1:10供試液。若需要，調(diào)節(jié)供試液pH值至6～8。必要時，用同一稀釋液將供試液進一步10倍系列稀釋。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。24五、供試品檢查：檢驗量、供試品檢查供試液制備常用五、供試品檢查：檢驗量、供試品檢查⑵水不溶性非油脂類供試品取供試品，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或pH7.2磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基制備成1:10供試液。分散力較差的供試品，可在稀釋液中加入表面活性劑如0.1%的聚山梨酯80，使供試品分散均勻。若需要，調(diào)節(jié)供試液pH值至6～8。必要時，用同一稀釋液將供試液進一步10倍系列稀釋。25五、供試品檢查：檢驗量、供試品檢查⑵水不溶性非油脂類供五、供試品檢查：檢驗量、供試品檢查⑶油脂類供試品取供試品，加入無菌十四烷酸異丙酯使溶解，或及最少量并能使供試品乳化的無菌聚山梨酯80或其他無抑菌性的無菌表面活性劑充分混勻。表面活性劑的溫度一般不超過40℃（特殊情況下，最多不超過45℃），小心混合，若需要可在水浴中進行，然后加入預(yù)熱的稀釋液使成1∶10供試液，保溫，混合，并在最短時間內(nèi)形成乳狀液。必要時，用稀釋液或含上述表面活性劑的稀釋液進一步10倍系列稀釋。26五、供試品檢查：檢驗量、供試品檢查⑶油脂類供試品取五、供試品檢查：檢驗量、供試品檢查供試品檢查

平皿法包括傾注法和涂布法。每稀釋級每種培養(yǎng)基至少制備2個平皿。胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板在30～35℃培養(yǎng)3天，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板在20～25℃培養(yǎng)5天，觀察菌落生長情況,點計平板上生長的所有菌落數(shù)。菌落蔓延生長成片的平皿不宜計數(shù)。點計菌落數(shù)后，計算各稀釋級供試液的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報告規(guī)則報告菌數(shù)。27五、供試品檢查：檢驗量、供試品檢查供試品檢查27五、供試品檢查：檢驗量、供試品檢查菌數(shù)報告規(guī)則需氧菌總數(shù)測定宜選取平均菌落數(shù)小于300cfu的稀釋級、霉菌和酵母菌總數(shù)測定宜選取平均菌落數(shù)小于100cfu的稀釋級，作為菌數(shù)報告（取兩位有效數(shù)字）的依據(jù)。取最高的平均菌落數(shù)，計算1g、1ml或10cm2

供試品中所含的微生物數(shù)。28五、供試品檢查：檢驗量、供試品檢查菌數(shù)報告規(guī)則28五、供試品檢查：檢驗量、供試品檢查菌數(shù)報告規(guī)則如各稀釋級的平皿均無菌落生長，或僅最低稀釋級的平板有菌落生長，但平均菌落數(shù)小于1時，以﹤1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。29五、供試品檢查：檢驗量、供試品檢查29五、供試品檢查：檢驗量、供試品檢查供試品檢查

薄膜過濾法取相當(dāng)于1g、1ml或10cm2供試品的供試液，若供試品所含的菌數(shù)較多時，可取適宜稀釋級的供試液，照方法適用性試驗確認的方法加至適量稀釋液中，立即過濾，沖洗，沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)和計數(shù)培養(yǎng)條件和計數(shù)方法同平皿計數(shù)法，每張濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不超過100cfu。30五、供試品檢查：檢驗量、供試品檢查供試品檢查30五、供試品檢查：檢驗量、供試品檢查菌數(shù)報告規(guī)則以相當(dāng)于1g、1ml或10cm2

供試品的菌落數(shù)報告菌數(shù)；若濾膜上無菌落生長，以﹤1報告菌數(shù)（每張濾膜過濾1g、1ml或10cm2

供試品）,或﹤1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。31五、供試品檢查：檢驗量、供試品檢查菌數(shù)報告規(guī)則31五、供試品檢查：檢驗量、供試品檢查MPN法（三步五管法）0.10.010.001每組5管32五、供試品檢查：檢驗量、供試品檢查MPN法（三步五五、供試品檢查：檢驗量、供試品檢查結(jié)果判斷各品種項下規(guī)定的微生物限度標準解釋如下：101cfu：可接受的最大菌數(shù)為20；102cfu：可接受的最大菌數(shù)為200103cfu：可接受的最大菌數(shù)為2000：依此類推。若供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的檢查結(jié)果均符合該品種項下的規(guī)定，判供試品符合規(guī)定；若其中任何一項不符合該品種項下的規(guī)定，判供試品不符合規(guī)定。33五、供試品檢查：檢驗量、供試品檢查結(jié)果判斷33六、控制菌檢查法控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查，檢查項目包括促生長能力抑制能力指示能力34六、控制菌檢查法控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查34六、控制菌檢查法控制菌檢查用培養(yǎng)基的促生長能力、抑制能力及指示特性控制菌檢查培養(yǎng)基特性試驗菌株耐膽鹽革蘭氏陰性菌【15版：新增】腸道菌增菌液體培養(yǎng)基促生長能力大腸埃希菌銅綠假單胞菌抑制能力金黃色葡萄球菌紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基促生長能力+指示特性大腸埃希菌大腸埃希菌麥康凱液體培養(yǎng)基促生長能力大腸埃希菌抑制能力金黃色葡萄球菌麥康凱瓊脂培養(yǎng)基促生長能力+指示特性大腸埃希菌35六、控制菌檢查法控制菌檢查用培養(yǎng)基的促生長能力、抑制能力及指六、控制菌檢查法液體培養(yǎng)基促生長能力檢查

分別接種不大于100cfu的試驗菌于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不長于規(guī)定的最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng)，及對照培養(yǎng)基管比較，被檢培養(yǎng)基管試驗菌應(yīng)生長良好。36六、控制菌檢查法液體培養(yǎng)基促生長能力檢查

36六、控制菌檢查法培養(yǎng)基抑制能力檢查

接種不少于100cfu的試驗菌于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不短于規(guī)定的最長培養(yǎng)時間下培養(yǎng)，試驗菌應(yīng)不得生長。37六、控制菌檢查法培養(yǎng)基抑制能力檢查

37六、控制菌檢查法培養(yǎng)基指示特性檢查

用涂布法分別接種不大于100cfu的試驗菌于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基平板上，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不長于規(guī)定的最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng)，被檢培養(yǎng)基上試驗菌生長的菌落大小、形態(tài)特征、指示劑反應(yīng)情況等應(yīng)及對照培養(yǎng)基一致。38六、控制菌檢查法培養(yǎng)基指示特性檢查

38六、控制菌檢查法1、控制菌檢查方法適用性試驗試驗菌

根據(jù)各品種項下微生物限度標準中規(guī)定檢查的控制菌選擇相應(yīng)試驗菌株，確認耐膽鹽革蘭陰性菌檢查方法時,采用大腸埃希菌和銅綠假單胞菌為試驗菌。39六、控制菌檢查法1、控制菌檢查方法適用性試驗39六、控制菌檢查法結(jié)果判斷

上述試驗若檢出試驗菌，按此供試液制備法和控制菌檢查方法進行供試品檢查；若未檢出試驗菌，應(yīng)消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法適用性試驗。40六、控制菌檢查法結(jié)果判斷

40六、控制菌檢查法供試品檢查供試品的控制菌檢查應(yīng)按經(jīng)方法適用性試驗確認的方法進行。供試品檢出控制菌或其他致病菌時,按一次檢出結(jié)果為準,不再復(fù)試。41六、控制菌檢查法供試品檢查41六、控制菌檢查法控制菌檢查過程：使用無選擇性增菌培養(yǎng)基（胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基）培養(yǎng)，使受損的細菌得到修復(fù)，提高檢出率。增菌培養(yǎng)----選擇性增菌----選擇性瓊脂42六、控制菌檢查法控制菌檢查過程：42六、控制菌檢查法大腸埃希菌：糞便污染指示菌供試液制備和增菌培養(yǎng)取供試品，制成1：10供試液。取相當(dāng)于1g或1mL供試品的供試液，接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗確定的）的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，30～35℃培養(yǎng)18～24小時。43六、控制菌檢查法大腸埃希菌：糞便污染指示菌43六、控制菌檢查法

選擇和分離培養(yǎng)

取上述預(yù)培養(yǎng)物1mL接種至100mL麥康凱液體培養(yǎng)基中，42～44℃培養(yǎng)24～48小時。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35℃培養(yǎng)18～72小時。結(jié)果判斷

：若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長，應(yīng)進行分離、純化及適宜的鑒定試驗,確證是否為大腸埃希菌；若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌。44六、控制菌檢查法選擇和分離培養(yǎng)44六、控制菌檢查法沙門菌:腸菌科重要致病菌含藥材原粉化學(xué)藥和中藥制劑及臟器提取物的口服制劑【10版：含動物組織及動物類原藥材粉的口服制劑】每10g或10ml不得檢出沙門菌45六、控制菌檢查法沙門菌:腸菌科重要致病菌45六、控制菌檢查法供試液制備和增菌培養(yǎng)取10g或10mL供試品直接或處理后接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗確定的）的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，30～35℃培養(yǎng)18～24小時。選擇和分離培養(yǎng)

取上述預(yù)培養(yǎng)物0.1mL接種至10mLRV沙門增菌液體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24小時。取少量RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35℃培養(yǎng)18～48小時。46六、控制菌檢查法供試液制備和增菌培養(yǎng)46六、控制菌檢查法沙門菌在木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上生長良好，菌落為淡紅色或無色、透明或半透明、中心有或無黑色。用接種針挑選疑似菌落于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進行斜面和高層穿刺接種，培養(yǎng)18～24小時，或采用其它適宜方法進一步鑒定。47六、控制菌檢查法47六、控制菌檢查法結(jié)果判斷

若木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上有疑似菌落生長，且三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面為紅色、底層為黃色，或斜面黃色、底層黃色或黑色，應(yīng)進一步進行適宜的鑒定試驗,確證是否為沙門菌。如果平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為陰性，或三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面未見紅色、底層未見黃色；或斜面黃色、底層未見黃色黑色，判供試品未檢出沙門菌。48六、控制菌檢查法結(jié)果判斷

48補充知識點溫育的時候,培養(yǎng)基的水分要蒸發(fā),形成水珠,如果正放的話水珠集聚在培養(yǎng)基平面上會影響菌落的生長,所以要保證培養(yǎng)基的干燥,就得倒置培養(yǎng).還有就是便于拿取,大下小上,也防止外物掉在培養(yǎng)基上.滅菌后的pH會比滅菌前的pH降低,一般高壓滅菌前培養(yǎng)基的pH會比最終pH調(diào)高0.2左右,滅菌后基本合適.為什么要倒置培養(yǎng)？校正酸堿度（調(diào)節(jié)pH）49補充知識點溫育的時候,培養(yǎng)基的水分要蒸發(fā),形成水珠,如果正放補充知識點常用玻璃儀器及用具清潔方法1.新購玻璃儀器：流水沖洗，浸泡于1%~2%鹽酸中約2小時，除去游離堿。2.未被病原微生物污染的器皿：隨時用清水沖洗。3.被微生物污染的器皿：必須先進行高壓消毒和煮沸，以殺死菌體，否則會產(chǎn)生孢子飛揚，污染環(huán)境，給組織培養(yǎng)帶來嚴重困難。器皿洗凈后，應(yīng)烘干或晾干，放在規(guī)定的地方，便于取用。4.培養(yǎng)基使用后正確的做法是倒置在統(tǒng)一的容器中，還需要在滅菌鍋中滅菌后，確保培養(yǎng)基中的菌落死后，再倒入廢棄桶中。50補充知識點常用玻璃儀器及用具清潔方法1.新購玻璃儀器：流水沖補充知識點滅菌方法：濕熱滅菌法、干熱滅菌法輻射滅菌法干熱滅菌法：是將物品置于干熱滅菌柜、隧道滅菌器等設(shè)備中，利用干熱空氣達到殺滅微生物或消除熱原物質(zhì)的方法。驗證用的生物指示劑枯草芽孢桿菌孢子。51補充知識點滅菌方法：濕熱滅菌法、干熱滅菌法輻射滅菌法51補充知識點干熱滅菌柜

52補充知識點干熱滅菌柜52效價檢查技術(shù)53效價檢查技術(shù)5目錄1.概述2.基本原理3.菌液制備4.基本操作及注意事項5.操作要點6.檢定的影響因素54目錄1.概述541、概述抗生素微生物檢定法是國際上通用的、經(jīng)典的抗生素效價測定方法。隨著HPLC等化學(xué)分析技術(shù)的發(fā)展，一些抗生素效價的測定已被化學(xué)方法所替代，但由于以下原因，抗生素微生物檢定法，目前在各國藥典中仍占有重要地位。551、概述551.微生物檢定法可直觀、特異的反應(yīng)出抗生素藥品的抗菌活性，顯示臨床的特點。2.多組分抗生素由于不同組分生物活性的差異，化學(xué)測定結(jié)果難以準確表征組分、組成、含量和活性的關(guān)系。3.許多抗生素品種由于各種原因目前沒有適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)分析方法表征其活性。4.同時微生物法所需的儀器設(shè)備簡單，成本低。561.微生物檢定法可直觀、特異的反應(yīng)出抗生素藥品的抗菌活性，顯在中國藥典2010年版二部附錄Ⅺ抗生素微生物檢定法及2015版藥典中，詳細描述了管碟法和濁度法測定抗生素效價的方法，根據(jù)公司生產(chǎn)及檢測情況，主要是四環(huán)素片，采用抗生素管碟法測效價來計算含量，因此，此章主要介紹管碟法。57在中國藥典2010年版二部附錄Ⅺ抗生素微生物檢定法及2015抗菌活性抗菌活性是指抗菌藥物抑制或殺死病原微生物的能力?？股氐目咕钚酝ǔＳ眯r來表示。在臨床應(yīng)用中，抗生素的抗菌活性可準確地反應(yīng)抗生素的醫(yī)療價值。如：紅霉素798單位/毫克四環(huán)素58抗菌活性抗菌活性是指抗菌藥物抑制或殺死病原微生物的能力。582.基本原理2010版藥典二部附錄及2015版藥典，在適宜條件下，根據(jù)量反應(yīng)平行線原理，利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴散作用，比較標準品及供試品兩者對接種的試驗菌產(chǎn)生抑菌圈的大小，測定供試品的效價。592.基本原理593.抑菌圈的形成兩種互動作用：一種是抗生素溶液向培養(yǎng)基內(nèi)呈球面狀擴散作用；另一種是試驗菌的生長作用。當(dāng)培養(yǎng)到一定時間，瓊脂培養(yǎng)基的兩種互動作用達到動態(tài)平衡時，瓊脂培養(yǎng)基中便形成透明的抑菌圈。即：在抑菌圈中因抗生素濃度高于抑菌濃度，試驗菌生長受到抑制，此處瓊脂培養(yǎng)基成透明狀；在抑菌圈邊緣抗生素濃度恰好等于抗生素最低抑菌濃度。603.抑菌圈的形成606161量反應(yīng)平行線原理：當(dāng)抗生素濃度的對數(shù)劑量和反應(yīng)呈直線關(guān)系，且供試品和標準品的作用性質(zhì)相同時，供試品和標準品的兩條量-反應(yīng)關(guān)系曲線相互平行。（中國藥典生物檢定統(tǒng)計法）62量反應(yīng)平行線原理：當(dāng)抗生素濃度的對數(shù)劑量和反應(yīng)呈直線關(guān)系，且根據(jù)中國藥典2015年版要求，四環(huán)素片測效價，選取藤黃微球菌作為試驗菌。取藤黃微球菌CCMCC(B)28001的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于盛有營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，在35～37℃培養(yǎng)7日，用革蘭氏染色法涂片鏡檢，應(yīng)有芽孢85%以上。用滅菌水將芽孢洗下，在65℃加熱30分鐘，備用。63根據(jù)中國藥典2015年版要求，四環(huán)素片測效價，選取藤黃微球菌流程圖凍干菌粉營養(yǎng)肉湯半固體瓊脂斜面制菌懸液穿刺管（保藏及傳代用）備注：每經(jīng)過一次培養(yǎng)箱培養(yǎng)，菌的代數(shù)就增加一代。參考：《藥品微生物學(xué)檢驗技術(shù)》主編：蘇德模馬緒榮2007年出版（復(fù)活）64流程圖半固體瓊脂斜面制菌懸液穿刺管（保藏及傳代用）備注：每經(jīng)1.復(fù)活從菌種保藏機構(gòu)購回的標準菌株，是冷凍干燥粉，需經(jīng)過復(fù)活。（凍干菌種為第0代）651.復(fù)活65無菌操作，將冷凍干燥菌種安瓿用75%乙醇消毒后，用砂輪在安瓿頸部刻線，用無菌紗布掰開，或灼熱安瓿頂部，立即作滅菌濕紗布蓋住頂部，安瓿頂部便驟然裂開，小心移去玻璃碎片，用一無菌毛細管吸取0.5-1ml適宜的液體培養(yǎng)基，直插安瓿底部，擠出營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，在底部振搖使菌粉溶解，再將安瓿內(nèi)菌液吸出，接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。35-37度培養(yǎng)18-24小時。（此為第一代）66無菌操作，將冷凍干燥菌種安瓿用75%乙醇消毒后，用砂輪在安瓿制保藏菌株將營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物，用接種針沾取菌苔（菌液），沿半固體培養(yǎng)基中心向管底作直線穿刺。穿刺到保藏管中，同樣溫度35-37度，培養(yǎng)18-24h，然后，放置2-8度冰箱保存，作為保藏及傳代用的菌株。67制保藏菌株673.制工作用菌懸液試驗用菌種穿刺管1支，按無菌操作要求，接種于盛有30ml普通瓊脂培養(yǎng)基的大三角瓶中，旋轉(zhuǎn)三角瓶使全部瓊脂培養(yǎng)基表面被菌液浸潤，多余的菌液用吸管吸出棄入消毒液中。將已接種的三角瓶置35～37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～10天，用革蘭氏染色法涂片鏡檢，應(yīng)有芽孢85%以上，用滅菌水20ml洗下芽孢，制成懸液，在65℃水浴中加熱30分鐘，即得。置5℃冰箱中保存。683.制工作用菌懸液試驗用菌種穿刺管1支，按無菌操作要求，接種4.基本操作及注意事項管碟法的操作步驟預(yù)試驗試驗準備雙碟的制備供試品、標準品溶液的制備菌層的制備放置小鋼管滴加抗生素溶液雙碟的培養(yǎng)抑菌圈的測量結(jié)果的可靠性檢驗及效價測定694.基本操作及注意事項管碟法的操作步驟69預(yù)試驗確定最佳的試驗條件：調(diào)整試驗菌的濃度、使用量、抗生素濃度、培養(yǎng)基等，使抑菌圈的大小符合規(guī)定，即二劑量法高劑量濃度標準品溶液所致的抑菌圈直徑在18～22mm,三劑量法中間劑量濃度標準品溶液所致的抑菌圈直徑在15～18mm.

高低劑量之比為2:1.70預(yù)試驗確定最佳的試驗條件：調(diào)整試驗菌的濃度、使用量、抗生素濃實驗準備：雙碟、鋼管、滴管、吸管的清洗及滅菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培養(yǎng)基、緩沖液的準備、半無菌間的紫外消毒等.

71實驗準備：71抗生素試驗中，玻璃雙碟、小鋼管往往會連續(xù)使用。由于清洗方面的原因，它們還是容易殘留上次試驗中的抗生素或者被清洗用的殺菌劑（如新潔而滅、洗潔精、去污粉等）污染，以至于在下次試驗中造成抑菌圈不正常的現(xiàn)象。因此，在清洗時要尤為注意多用流水沖洗。72抗生素試驗中，玻璃雙碟、小鋼管往往會連續(xù)使用。由于清洗方面的雙碟的制備：每只雙碟加底層培養(yǎng)基約20ml,待培養(yǎng)基凝固后,將雙碟放入35～37℃培養(yǎng)箱中,待用.73雙碟的制備：73試驗中加注的培養(yǎng)基如果溫度太低，就容易在內(nèi)部結(jié)塊，或者加注到雙碟之后不能及時鋪開，使得培養(yǎng)基表面為非水平面，會給試驗帶來誤差。加注60～80℃的培養(yǎng)基底層之后，不應(yīng)立即給雙碟加蓋。因為溫度過高的培養(yǎng)基會形成大量的水蒸氣，在雙碟蓋上凝集并滴落在已經(jīng)凝固定的培養(yǎng)基底層上，會給培養(yǎng)基菌層的加注帶來影響。74試驗中加注的培養(yǎng)基如果溫度太低，就容易在內(nèi)部結(jié)塊，或者加注到供試品、標準品溶液的制備：估計供試品的效價,根據(jù)試驗要求設(shè)計供試品、標準品溶液稀釋步驟,平行制備供試品、標準品相關(guān)劑量的溶液.依公司產(chǎn)品，四環(huán)素片，采用的是二劑量法，試驗中，制成高、低濃度的溶液。75供試品、標準品溶液的制備：75菌層的制備：注意菌層培養(yǎng)基溫度；根據(jù)預(yù)試驗確定加入菌層培養(yǎng)基的菌液量,注意制備菌層的速度和平整度.

76菌層的制備：76放置小鋼管放置小鋼管時，注意管及管之間不能太靠近，否則會引起相鄰的兩個抑菌圈之間的抗生素擴散區(qū)中的濃度增大，相互影響形成卵圓形或橢圓形抑菌圈。管及雙碟邊緣同樣也不能太靠近，因為液面浸潤作用，邊緣的瓊脂培養(yǎng)基菌層為非平面，會影響抑菌圈的形狀。77放置小鋼管放置小鋼管時，注意管及管之間不能太靠近，否則會引起小鋼管放置時，要小心地從同一高度垂直放在菌層培養(yǎng)基上，不得下陷，不得傾斜，不能用懸空往下掉的方法。放置之后，不能隨意移動，要靜置5min，使之在瓊脂內(nèi)稍下沉降穩(wěn)定后，再開始滴加抗生素溶液。78小鋼管放置時，要小心地從同一高度垂直放在菌層培養(yǎng)基上，不得下滴加抗生素溶液：注意標準品、供試品高、低劑量溶液滴加順序,保證滴加速度和加量的均勻一致.滴加抗生素要按照SH→TH→SL→TL（二劑量法）的順序滴加。滴加之前，滴管至少要用被滴液體沖洗3次。79滴加抗生素溶液：79在滴加抗生素到小鋼管的時候，由于滴管內(nèi)抗生素溶液往往會有氣泡或者滴管開口端有液體殘留，繼續(xù)滴加容易造成氣泡膨脹破裂，使溶液濺落在瓊脂培養(yǎng)基表面造成破圈。因此一旦滴管中出現(xiàn)氣泡或者殘留，就重新吸取抗生素溶液進行滴加，滴管管口應(yīng)避免太細，滴加的時候離開小鋼管口距離不要太高。80在滴加抗生素到小鋼管的時候，由于滴管內(nèi)抗生素溶液往往會有氣泡SL標品的低濃度TL樣品的低濃度SH標品的高濃度TH樣品的高濃度81SL標品的低濃度TL樣品的低濃度SH標品的高濃度TH樣品的高采用抑菌圈自動測量分析儀ZY-300IV型，自動掃描出抑菌圈，測出直徑并計