實驗二-微生物培養(yǎng)基的配制和滅菌

實驗二微生物培養(yǎng)基的配制和滅菌實驗二微生物培養(yǎng)基的配制和滅菌1一、實驗?zāi)康牧私馀囵B(yǎng)基的配制原理和方法，掌握其配制過程。掌握加壓蒸汽滅菌法的原理及其使用方法。（一）培養(yǎng)基的配制一、實驗?zāi)康牧私馀囵B(yǎng)基的配制原理和方法，掌握其配制過2二.實驗原理1.培養(yǎng)基是供微生物生長、繁殖、代謝的混合養(yǎng)料。不同微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的要求各不相同，加之實驗和研究的目的不同，所以培養(yǎng)基的種類很多，使用的原料也各有差異，但從營養(yǎng)角度分析，培養(yǎng)基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、無機鹽、生長素以及水分等。另外，培養(yǎng)基還應(yīng)具有適宜的pH值、一定的緩沖能力、一定的氧化還原電位及合適的滲透壓。二.實驗原理1.培養(yǎng)基是供微生物生長、繁殖、代謝的混3培養(yǎng)基按成分可分為天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基和半合成培養(yǎng)基；按物理狀態(tài)可分為固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基（0.2%～0.5%的瓊脂）和液體培養(yǎng)基；按用途可分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基、營養(yǎng)培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基等。培養(yǎng)基按成分可分為天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基和半合成培養(yǎng)基；按物4培養(yǎng)基是指由人工配制的、適合微生物生長繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物用的混合營養(yǎng)料。培養(yǎng)基簡介碳源、氮源、無機鹽、能源、生長因子、水營養(yǎng)物質(zhì)的濃度要適宜營養(yǎng)物質(zhì)之間的配比要適宜培養(yǎng)基的pH值、滲透壓、水活度和氧化還原電勢等物理化學(xué)條件要適宜。培養(yǎng)基培養(yǎng)基簡介碳源、氮源、無機鹽、能源、生長因子、水營養(yǎng)物5細(xì)菌：pH7.0~8.0放線菌：pH7.5~8.5酵母菌：pH3.8~6.0霉菌：pH4.0~5.8藻類：pH6.0~7.0原生動物：pH6.0~8.0初始pH通常培養(yǎng)條件：細(xì)菌：pH7.0~8.0初始pH通常培養(yǎng)條件：6培養(yǎng)基的種類按照培養(yǎng)基的物理狀態(tài)可分為1.液體培養(yǎng)基：不加凝固劑的液體狀態(tài)培養(yǎng)基。2.固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入2%左右的凝固劑的固體狀態(tài)的培養(yǎng)基。3.半固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入0.2—0.5%凝固劑而成的半固體狀培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的種類按照培養(yǎng)基的物理狀態(tài)可分為7

瓊脂是最優(yōu)良的凝固劑，自1880年開始用于配制微生物培養(yǎng)基以來，至今經(jīng)久不衰。瓊脂是最優(yōu)良的凝固劑，自1880年開始用于配制微生物8實驗室的常用培養(yǎng)基：細(xì)菌：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；放線菌：高氏1號合成培養(yǎng)基培養(yǎng)；酵母菌：麥芽汁培養(yǎng)基；霉菌：查氏合成培養(yǎng)基；實驗室的常用培養(yǎng)基：9稱量--配置--調(diào)節(jié)pH值--過濾--分裝--滅菌

1.稱量

按照培養(yǎng)基配方，準(zhǔn)確稱量各成份放于燒杯中。對于不是粉狀（如肉膏），應(yīng)用燒杯稱量。

培養(yǎng)基配制的基本步驟稱量--配置--調(diào)節(jié)pH值--過濾--分裝--滅菌

培養(yǎng)基配102.配調(diào)

向燒杯中加入適量的水，攪拌，使其溶解（可加熱助溶）。如是配制固體培養(yǎng)基，在瓊脂的熔化時，需不斷攪拌，并控制火力不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦。待完全熔化后，補足所失水分。如果配方中含有淀粉，先將淀粉用少量冷水調(diào)成糊狀并在火上加熱攪拌，然后加足水分及其他藥品，待完全熔化后補足所失水分。2.配調(diào)

向燒杯中加入適量的水，攪拌，使其溶解（可加113.調(diào)節(jié)pH值

培養(yǎng)基溶解均勻并冷卻至室溫時用pH試紙測pH，然后根據(jù)要求加酸或堿（一般用1molHcl和1molNaOH），要緩慢少量且多加攪拌。培養(yǎng)基配方為自然pH時，不用調(diào)節(jié)。

4.過濾

用濾紙或多層紗布過濾，一般無特殊要求可省去。

3.調(diào)節(jié)pH值

培養(yǎng)基溶解均勻并冷卻至室溫時用pH125.分裝

將制好的培養(yǎng)基分裝入試管內(nèi)或三角瓶內(nèi)，管（瓶）口塞上棉塞。固體培養(yǎng)基要趁熱裝。分裝時要避免培養(yǎng)基粘染管（瓶）口，引起污染。分裝量可分為下面幾方面：

（1）斜面：裝量為管長的1/4-1/5。

（2）液體培養(yǎng)基、高層培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基：裝載量不超過管長的1/3。

（3）三角瓶：裝量不超過容積1/2。5.分裝

將制好的培養(yǎng)基分裝入試管內(nèi)或三角瓶內(nèi)，管（136.滅菌

塞棉塞，包扎，滅菌。

高壓蒸汽滅菌法：是在密閉的加壓容器內(nèi)進行，加熱使器內(nèi)的水產(chǎn)生蒸汽，由于密閉，增加了器內(nèi)的壓力，使水的沸點升高，從而獲得高于100度的蒸汽溫度。6.滅菌

塞棉塞，包扎，滅菌。

高壓蒸汽滅菌14牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基配方：牛肉膏0.3g蛋白胨1g氯化鈉0.5g瓊脂2g水100mLpH7.2~7.4滅菌121℃，20min牛肉膏蛋白胨半固體培養(yǎng)基配方：

瓊脂0.3g牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基配方：

瓊脂0g牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基配方：牛肉膏蛋白胨半固體培養(yǎng)基配方：牛15牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制1、固體培養(yǎng)基（平板制作）2、固體培養(yǎng)基（斜面制作）2、半固體培養(yǎng)基3、液體培養(yǎng)基三.操作步驟及本次實驗具體安排牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制1、固體培養(yǎng)基（平板制作）三.操作步16（一）平板固體培養(yǎng)基制作1.按配方稱取各組分(按100ml計算)到的三角瓶中.2.加入100mL水.3.在酒精燈上完全融化，取部分制作斜面培養(yǎng)基3.其余部分塞上硅膠塞,用牛皮紙包扎好;4.高壓蒸汽滅菌5.滅菌后,當(dāng)培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時,傾注平皿(每100ml可制備5-6個平皿)6.凝固后放冰箱備用

（一）平板固體培養(yǎng)基制作17（二）斜面培養(yǎng)基制作

1.在空試管內(nèi)倒入2～3mL上述已經(jīng)溶解好的培養(yǎng)基，【注意盡量不要讓培養(yǎng)基沾到試管口】塞好硅膠塞.2.放入燒杯中,高壓蒸汽滅菌.3.擺斜面,凝固后放冰箱備用.（二）斜面培養(yǎng)基制作

1.在空試管內(nèi)倒入2～3mL上述已經(jīng)18用于活化菌種，或培養(yǎng)菌種的斜面用于保存菌種的斜面用于活化菌種，用于保存菌種的斜面19擱置斜面當(dāng)培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時，將試管帶棉塞的一端擱在一根木棒上。擱置的長度要合適，使培養(yǎng)基形成的斜面的長度不超過試管總長的一半。擱置斜面20（三）液體培養(yǎng)基制作

1.按牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基配方稱取相應(yīng)成分到250ml的三角瓶中.2.加入100mL水.3.充分溶解.（取出50ml用于半固體培養(yǎng)基制作）4.在空試管內(nèi)倒入2～3mL已經(jīng)溶解好的培養(yǎng)基，【注意盡量不要讓培養(yǎng)基沾到試管口】塞好硅膠塞.5.放入燒杯中,高壓蒸汽滅菌.6.冷卻后放冰箱備用.（三）液體培養(yǎng)基制作

1.按牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基配方稱取相21牛肉膏蛋白胨

液體體培養(yǎng)基按下列配方及方法配制牛肉膏:0.3g蛋白胨:1gNaCl:0.5g水:100mlpH:

7.0-7.2放入水浴鍋內(nèi)溶解后,分裝到試管中,滅菌備用.牛肉膏蛋白胨

液體體培養(yǎng)基按下列配方及方法配制牛肉膏:022（三）半固體培養(yǎng)基制作

1.在25ml液體培養(yǎng)基中加入0.3%的瓊脂粉3.完全溶解.4.在空試管內(nèi)倒入2～3mL已經(jīng)溶解好的培養(yǎng)基，【注意盡量不要讓培養(yǎng)基沾到試管口】塞好硅膠塞.5.放入燒杯中,高壓蒸汽滅菌.6.凝固后放冰箱備用.（三）半固體培養(yǎng)基制作

1.在25ml液體培養(yǎng)基中加入0.23牛肉膏蛋白胨

半固體培養(yǎng)基按下列配方及方法配制牛肉膏:0.3g蛋白胨:1gNaCl:0.5g瓊脂:0.3g水:100mlpH:

7.0-7.2放入水浴鍋內(nèi)溶解后,分裝到試管中,滅菌備用.牛肉膏蛋白胨

半固體培養(yǎng)基按下列配方及方法配制牛肉膏:024注：試管加棉塞(最好)培養(yǎng)基分裝完畢以后，在管口上加一個棉塞。棉塞能防止雜菌污染，保證通氣良好。加棉塞時，應(yīng)使棉塞長度的2/3在試管口內(nèi)，如下圖所示。注：試管加棉塞(最好)培養(yǎng)基分裝完畢以后，在管口上加一個25配制好后，寫好培養(yǎng)基名稱、班級、組別，再滅菌每組留部分同學(xué)等滅菌結(jié)束之后，倒固體平板和擺斜面配制好后，寫好培養(yǎng)基名稱、班級、組別，再滅菌26任何一種培養(yǎng)基一經(jīng)制成就應(yīng)及時徹底滅菌，以備純培養(yǎng)用。一般培養(yǎng)基的滅菌采用高壓蒸汽滅菌。常用的滅菌的方法有：干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌、常壓蒸汽滅菌、常壓間歇式滅菌超高溫滅菌、過濾除菌、輻射滅菌、化學(xué)藥品滅菌等方法。本實驗培養(yǎng)基的滅菌常使用的是高壓蒸汽滅菌，它是利用高溫濕熱空氣使菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達到滅菌的。（二）培養(yǎng)基的滅菌任何一種培養(yǎng)基一經(jīng)制成就應(yīng)及時徹底滅菌，以備純培養(yǎng)用。一般培27高壓蒸氣滅菌一般培養(yǎng)基:1.05Kg/cm2,121.3℃,15-30min含糖培養(yǎng)基:0.56Kg/cm2,112.6℃,15-30min

培養(yǎng)基的滅菌高壓蒸氣滅菌培養(yǎng)基的滅菌28器皿的滅菌：

干熱空氣：160℃，2小時無菌室的消毒：

紫外光化學(xué)藥物熏蒸（苯酚；高錳酸鉀+甲醛）器皿的滅菌：29滅菌鍋濕熱滅菌使用的設(shè)備滅菌鍋濕熱滅菌使用的設(shè)備30操作過程

加水