病毒的細胞培養(yǎng)

關(guān)于病毒的細胞培養(yǎng)一基本原理二細胞培養(yǎng)的基本概念三主要優(yōu)點四培養(yǎng)實驗用品的前期處理五培養(yǎng)細胞的生長方式及類型六細胞培養(yǎng)的實驗步驟七病毒的細胞培養(yǎng)第2頁,共43頁，2024年2月25日，星期天一基本原理通過機械解離或消化等方法將組織或細胞從機體取出，分散成單個細胞，給與必要的生長條件。模擬體內(nèi)生長環(huán)境，使其在體外能繼續(xù)生長與增值。在長成致密單層細胞后，將病毒接種在細胞上，置于適當環(huán)境中進行培養(yǎng)，逐日觀察細胞病變（CPE）待75%的細胞出現(xiàn)CPE后收獲細胞，反復凍融3次，置-70℃保存?zhèn)溆?。?頁,共43頁，2024年2月25日，星期天細胞培養(yǎng)的基本概念傳代：細胞在培養(yǎng)器皿中生長一定時間后，被分開接種到新的培養(yǎng)器皿中。原代培養(yǎng)：取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長的細胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。第4頁,共43頁，2024年2月25日，星期天二主要優(yōu)點㈠研究的對象是活的細胞。㈡研究的條件可以人為的控制。㈢研究的樣本，可以達到比較均一性。㈣研究的內(nèi)容便于觀察、檢測和記錄。㈤研究的范圍比較廣泛。㈥研究的費用相對較經(jīng)濟。第5頁,共43頁，2024年2月25日，星期天三分類原代細胞培養(yǎng)傳代細胞培養(yǎng)第6頁,共43頁，2024年2月25日，星期天原代細胞培養(yǎng)概念：從供體獲取組織細胞后在體外進行的首次培養(yǎng)。優(yōu)點：生物學特性未發(fā)生很大變化，細胞染色體仍為二倍體，接近和反映體內(nèi)生長特性，適合做藥物測試、細胞分化及病毒學方面的實驗缺點：傳代次數(shù)較多細胞就會衰亡。第7頁,共43頁，2024年2月25日，星期天傳代細胞培養(yǎng)概念：原代細胞經(jīng)過一系列傳代，產(chǎn)生變異，轉(zhuǎn)化為能夠連續(xù)傳代的細胞。傳代細胞可以直接從腫瘤組織獲得，又可以通過人工馴化獲得。常用的傳代細胞：PK-15、IBRS-2、Vero、Marc-145、CHO、MDCK、CRFK、Hela等

第8頁,共43頁，2024年2月25日，星期天四培養(yǎng)實驗用品的前期處理1.清洗和浸泡:

(1)玻璃器皿

(2)塑料器皿2.包裝3.消毒：在組織細胞培養(yǎng)技術(shù)中，務必保證組織細胞在無微生物的條件下生長。第9頁,共43頁，2024年2月25日，星期天4.細胞培養(yǎng)用液及培養(yǎng)基（液）:

（1）水：蒸餾水、雙蒸水，可高壓除菌。（2）平衡鹽溶液（PBS)：PH為7.2－7.4，不含鈣鎂離子，可高壓除菌。（3）消化液:

胰蛋白酶液：常用胰蛋白酶的濃度為0．25％，pH值7.2左右。需過濾除菌。

EDTA液：常用濃度為0．02％，配制時采用無Ca2+、Mg2+平衡鹽液溶解，高壓滅菌后即可使用。

第10頁,共43頁，2024年2月25日，星期天(4)培養(yǎng)基培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細胞生存和生長的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點：來源受限。成分復雜，影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗結(jié)果的分析，易發(fā)生支原體污染第11頁,共43頁，2024年2月25日，星期天合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基是根據(jù)細胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設計出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質(zhì)。優(yōu)點：標準化生產(chǎn)，組分和含量相對固定。成本低缺點：缺少某些成分，不能完全滿足體外細胞生長需要。第12頁,共43頁，2024年2月25日，星期天人工合成培養(yǎng)基只能維持細胞生存，要想使細胞生長和繁殖，還需補充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。第13頁,共43頁，2024年2月25日，星期天血清中含有：①多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）②多種金屬離子③激素④促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。⑤各種生長因子⑥轉(zhuǎn)移蛋白⑦不明成分第14頁,共43頁，2024年2月25日，星期天一般說來．含5％小牛血清的培養(yǎng)基對大多數(shù)細胞可以維持細胞不死．但支持細胞生長一般需加10％血清．對于血清支持細胞生長的生物學效應已得到證明，但對血清中的復雜成分至今尚未完全清楚．血清質(zhì)量好壞是實驗成敗的關(guān)鍵。常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血情、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清的標準：透明，淡黃色，無沉淀物，無細菌、支原體、病毒污染。血清的滅活（消除補體活性）：56℃，30分鐘第15頁,共43頁，2024年2月25日，星期天（5）丙酮酸鈉、葡萄糖：是屬碳水化合物的成分，是細胞生命的能量來源。（6）抗生素：最終濃度為青霉素100U／ml，鏈霉素100U／ml（青霉素為80萬U／瓶，將其溶解于4ml三蒸水中，每升培養(yǎng)液中加人0.5ml；鏈霉素為100萬U／瓶，將其溶解在5ml三蒸水中，每升培養(yǎng)液加0.5ml）。（7）凍存液：二甲基亞砜（8）細胞生長液：是用以維持細胞生長增殖的液體。其是配方：基礎培養(yǎng)基80％－90％血清10%

雙抗100u/ml（9）細胞維持液：用以維持細胞緩慢生長或不死的培養(yǎng)液。其是配方：基礎培養(yǎng)基95％血清2％－5％雙抗100u/ml第16頁,共43頁，2024年2月25日，星期天五培養(yǎng)細胞的生長方式及類型㈠貼附生長型細胞必須貼附于底物才能生長的細胞。從形態(tài)上大體分為上皮細胞型及成纖維細胞型，還有一些難以確定其穩(wěn)定形態(tài)的細胞。㈡懸浮生長型細胞不需要附著于底物而于懸浮狀態(tài)下即可生長。第17頁,共43頁，2024年2月25日，星期天每代貼附生長細胞的生長過程游離期貼壁期潛伏期對數(shù)生長期停止期（平臺期）第18頁,共43頁，2024年2月25日，星期天貼附生長型細胞細胞培養(yǎng)常用的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、6孔板、96孔板第19頁,共43頁，2024年2月25日，星期天懸浮生長型細胞第20頁,共43頁，2024年2月25日，星期天六細胞培養(yǎng)的實驗步驟1原代細胞的培養(yǎng)以雞胚成纖維細胞為例（1）取胚（2）組織處理（3）消化（4）分裝、培養(yǎng)第21頁,共43頁，2024年2月25日，星期天（1）取胚選取9-11日齡SPF雞胚，大頭朝上直立于蛋架上，用碘酒、酒精消毒氣室外殼。用鑷子從氣室端打開蛋殼，撕開殼膜，用無菌鑷子輕輕取出雞胚，放入滅菌平皿中。第22頁,共43頁，2024年2月25日，星期天（2）組織處理用PBS液沖洗胚體2-3次，再將雞胚的頭、爪、內(nèi)臟去除，剩下的胚體在用PBS液沖洗胚體2-3次，然后再放入平皿中，用剪刀將雞胚剪成碎塊。第23頁,共43頁，2024年2月25日，星期天（3）消化用PBS液充分沖洗組織碎塊2-3次，加入3-5倍量的胰蛋白酶消化液，置37℃消化10分鐘，每隔2-3分鐘輕輕搖動一次。待組織碎塊聚合成團，邊緣毛樣模糊時取出，輕輕吸取上層消化液，加適量DMEM培養(yǎng)液，用吸管反復吹打，使細胞分散。第24頁,共43頁，2024年2月25日，星期天（4）分裝、培養(yǎng)將細胞懸液移入細胞培養(yǎng)瓶中，在細胞培養(yǎng)瓶中加入到10mlDMEM，充分混勻，讓細胞呈單個形式存在，最后將其放入恒溫箱中培養(yǎng)。第25頁,共43頁，2024年2月25日，星期天2傳代細胞的培養(yǎng)（1）細胞的復蘇（2）細胞的傳代（3）細胞的換液（4）細胞生長狀況的觀察（5）細胞的凍存第26頁,共43頁，2024年2月25日，星期天（1）細胞的復蘇概述

復蘇細胞與凍存的要求相反，應采用快速融化的手段。這樣可以保證細胞外結(jié)晶在很短的時間內(nèi)即融化。避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細胞造成損害。第27頁,共43頁，2024年2月25日，星期天操作步驟準備好培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)液和離心管等放于超凈工作臺內(nèi)。從保存液氮或低溫冰箱中凍存管（安瓶）的小袋或凍存盒內(nèi)取出的凍存管（安瓶）應直接投入37℃溫水中，并輕輕搖動令其內(nèi)容盡快融化。從37℃水浴中取出凍存管或安瓶，離心1000r×1min,用酒精消毒后開啟，用滴管吸出上清液，注入培養(yǎng)液1ml充分混勻，轉(zhuǎn)入刻度離心管制成細胞懸液后低速離心，除去上清液，必要時再重復用培養(yǎng)液洗一次。

用培養(yǎng)液適當稀釋后，接種培養(yǎng)瓶，放入CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)。如果復蘇時細胞密度較高要及時傳代。細胞復蘇時細胞數(shù)可以做10－20倍稀釋，接種密度以5×105

／ml為宜。第28頁,共43頁，2024年2月25日，星期天（2）細胞的傳代原理

在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，已基本上飽和（細胞增值達到一定密度后），為使細胞能繼續(xù)生長，同時也將細胞數(shù)量擴大，就必須進行傳代（再養(yǎng)）。傳代培養(yǎng)也是一種將細胞種保存下去的方法。同時也是利用培養(yǎng)細胞進行各種實驗的必經(jīng)過程。懸浮型細胞直接分瓶就可以，而貼壁細胞需經(jīng)消化后才能分瓶。第29頁,共43頁，2024年2月25日，星期天操作步驟

將長滿細胞的培養(yǎng)瓶中原來的培養(yǎng)液棄去。用1-2ml營養(yǎng)液或PBS緩沖液，清洗培養(yǎng)瓶，倒出加入1ml含有EDTA的胰酶，清洗五面，倒出在加入1ml含有EDTA的胰酶，當看到培養(yǎng)瓶上含有一兩個小空斑，也可看到有灰白色渾濁時，將胰酶倒掉加入培養(yǎng)液，用移液管吹洗貼有細胞的一面，將細胞從培養(yǎng)瓶壁上吹下來然后進行傳代第30頁,共43頁，2024年2月25日，星期天消化傳代的步驟第31頁,共43頁，2024年2月25日，星期天（3）細胞的換液原理：當細胞的量很少，未能鋪滿整個生長表面，但細胞培養(yǎng)液的pH值已經(jīng)發(fā)生很大變化；或者是細胞形態(tài)很差等情況時，需要給細胞換液。第32頁,共43頁，2024年2月25日，星期天操作步驟（1）吸棄或倒掉培養(yǎng)瓶內(nèi)的舊培養(yǎng)液（2）加入PBS溶液清洗細胞瓶五面（3）加入足量的細胞生長液，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。第33頁,共43頁，2024年2月25日，星期天（4）細胞生長狀況的觀察原理：應每日或隔日觀察一次細胞，及時了解細胞形態(tài)、數(shù)量及培養(yǎng)液pH值、污染與否等情況，以便采取相應的措施處理。

肉眼觀察顯微鏡觀察第34頁,共43頁，2024年2月25日，星期天（5）細胞的凍存?zhèn)鞔毎麘谐渥愕膬龃鎯?。一則防止細胞因污染等原因造成細胞系的絕種。二則防止細胞因傳的代次太多，造成細胞衰老或細胞發(fā)生變異。第35頁,共43頁，2024年2月25日，星期天細胞凍存方法（1）選取對數(shù)生長期的細胞，用常規(guī)傳代的方法將細胞制成懸液并計數(shù)，800-1000r/min離心5min，棄上清。（2）用細胞凍存液將沉淀重懸，調(diào)整細胞濃度至106-107個/ml，分裝于凍存管，注明細胞名稱，傳代及凍存日期。（3）冷凍保存：將凍存管于4℃放置30min，然后移入-80℃超低溫冰箱過夜，再放入液氮罐長期保存。亦可使用程序降溫劑逐漸降溫，凍存速度先為每分鐘下降速度1-2℃，當溫度達到-25℃時，可調(diào)整下降速度為每分鐘5-10℃，溫度降至-100℃時，再放入液氮罐中長期保存。第36頁,共43頁，2024年2月25日，星期天七病毒的細胞培養(yǎng)以禽流感感染雞胚成纖維細胞為例。（1）病料的處理（2）病毒分離、繁殖（3）細胞病變的觀察（4）效價測定（5）中和實驗第37頁,共43頁，2024年2月25日，星期天（1）病料的處理

采集疑是感染禽流感禽的心、腦、肺、淋巴結(jié)在含有雙抗的PBS液中研磨，4℃過夜，