3.1重組DNA技術(shù)的基本工具課件-高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

第三章

基因工程第一節(jié)

重組DNA技術(shù)的基本工具基因工程是指按照人們的愿望，并通過(guò)體外___________等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫做__________技術(shù)。

轉(zhuǎn)基因DNA重組1.基因工程的概念對(duì)基因工程概念的理解基因工程的別名：操作環(huán)境：操作對(duì)象：操作水平：

原理：

結(jié)果：重組DNA技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)生物體外基因分子水平基因重組創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品定向改造生物性狀，徹底打破了生殖隔離

特點(diǎn)：

轉(zhuǎn)基因技術(shù)生產(chǎn)胰島素

基因工程實(shí)例

轉(zhuǎn)基因木瓜

轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉辣椒香蕉培育抗番木瓜環(huán)斑病毒的木瓜抗番木瓜環(huán)斑病毒基因提取抗番木瓜環(huán)斑病毒基因與載體DNA連接抗番木瓜環(huán)斑病毒基因?qū)胧荏w細(xì)胞“分子手術(shù)刀”“分子縫合針”“分子運(yùn)輸車(chē)”準(zhǔn)確切割DNA分子將DNA片段連接起來(lái)將體外重組好的DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞重組DNA技術(shù)的基本工具2.基因工程的過(guò)程

首先要在______對(duì)含有_________的DNA分子進(jìn)行_______、改造和________，然后將________________導(dǎo)入受體細(xì)胞體內(nèi)，并使其在細(xì)胞中表達(dá)體外切割重組DNA分子拼接所需基因基因工程的過(guò)程：剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)蘇云金芽孢桿菌（抗蟲(chóng)基因）棉花細(xì)胞分子手術(shù)刀分子縫合針?lè)肿舆\(yùn)輸車(chē)限制性內(nèi)切核酸酶DNA連接酶載體重組DNA分子技術(shù)的基本工具：1.DNA都是四種脫氧核苷酸組成的；都是規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)；都遵循堿基互補(bǔ)原則2.基因是控制生物性狀的結(jié)構(gòu)與功能單位3.遺傳信息傳遞都遵循中心法則4.生物界幾乎共用一套遺傳密碼3.基因工程的理論基礎(chǔ)拼接的基礎(chǔ)表達(dá)的基礎(chǔ)下列對(duì)基因工程的理解，正確的是()①它是一種按照人們的愿望，定向改造生物遺傳特性的工程②對(duì)DNA進(jìn)行人為刪減或增添某些堿基③是體外進(jìn)行的人為的基因重組④基因工程又叫重組DNA技術(shù)⑤在DNA分子水平上進(jìn)行操作A.①②③④⑤B.①③④⑤C.①③⑤D.①②③⑤及時(shí)練：B一.限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”

1.來(lái)源：主要從原核生物中分離純化來(lái)的

3.種類：數(shù)千種注意：限制酶不是一種酶，而是一類酶。

2.簡(jiǎn)稱：限制酶4.功能:能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開(kāi)。“兩個(gè)特定”：說(shuō)明限制酶具有專一性ATGC腺嘌呤胸腺嘧啶胞嘧啶鳥(niǎo)嘌呤4種脫氧核苷酸種類：【回顧】DNA的基本單位：脫氧（核糖）核苷酸DNA中文全稱：脫氧核糖核酸一條脫氧核苷酸鏈…（3’、5’）磷酸二酯鍵5′5′3′3′AP脫氧核糖GP脫氧核糖TP脫氧核糖CP脫氧核糖脫氧核糖GPAPCPTP脫氧核糖脫氧核糖脫氧核糖氫鍵DNA的平面結(jié)構(gòu)一端有一個(gè)游離的磷酸基團(tuán)另一端有一個(gè)羥基（—OH）5.作用部位磷酸二酯鍵（詳細(xì)：識(shí)別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開(kāi)）ATCGTAGC5’3’5’3’磷酸二酯鍵*限制酶只切割兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開(kāi)部位磷酸二酯鍵的形成過(guò)程——脫水縮合6.識(shí)別序列

大多數(shù)限制酶的識(shí)別序列由___個(gè)核苷酸組成，也有少數(shù)限制酶的識(shí)別序列由___個(gè)、___個(gè)或

的核苷酸組成648其他數(shù)量EcoRⅠ5’…G-A-A-T-T-C…3’3’…C-T-T-A-A-G…5’SmaⅠ5’…C-C-C-G-G-G…3’3’…G-G-G-C-C-C…5’BamHⅠ5’…G-G-A-T-C-C…3’3’…C-C-T-A-G-G…5’TaqⅠ5’……T-C-G-A……3’3’……A-G-C-T……5’限制酶所識(shí)別的序列的特點(diǎn)是：即：一條鏈正向讀與另一條鏈反向讀的堿基順序完全一致①都可以找到一條中心軸線②中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的，稱為回文序列5’…T-C-G-A…3’3’…A-G-C-T…5’1.下面哪項(xiàng)不具有限制酶識(shí)別序列的特征（）A.

B.C.

D.5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-

5’

5’-GGGGCCCC-3’

3’-CCCCGGGG-

5’5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-

5’5’-CTAAATC-3’3’-GATTTAG-

5’D現(xiàn)學(xué)現(xiàn)用：一.限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”7.

結(jié)果：產(chǎn)生黏性末端或平末端黏性末端平末端實(shí)例2——SmaⅠ限制酶切割平末端實(shí)例1——EcoRⅠ限制酶切割黏性末端黏性末端在它識(shí)別序列的中心軸線兩側(cè)將DNA分子的兩條鏈分別切開(kāi)在它識(shí)別序列的中心軸線處切開(kāi)EcoRⅠ2個(gè)相同（互補(bǔ)）黏性末端識(shí)別序列：GAATTC切割部位：GA之間的磷酸二酯鍵形成黏性末端（從5’往3’讀）：AATT

實(shí)例1—EcoRⅠ限制酶：EcoRⅠSmaⅠ沿中軸線兩側(cè)切2個(gè)相同（互補(bǔ)）黏性末端識(shí)別序列：GAATTC筆記回文序列若一個(gè)限制酶切割一次可斷開(kāi)

個(gè)磷酸二酯鍵

①形成

個(gè)相同（互補(bǔ)）的黏性末端消耗

分子水

②形成___個(gè)游離的磷酸基團(tuán)2222黏性末端特點(diǎn)③產(chǎn)生___個(gè)切口1SmaⅠ2個(gè)相同平末端

實(shí)例2—SmaⅠ限制酶：識(shí)別序列:CCCGGG切割部位:CG之間的磷酸二酯鍵。中軸線EcoRⅠSmaⅠ2個(gè)相同平末端識(shí)別序列:CCCGGG沿中軸線切筆記若一個(gè)限制酶切割一次可斷開(kāi)

個(gè)磷酸二酯鍵

①形成

個(gè)相同平末端消耗

分子水

②形成___個(gè)游離的磷酸基團(tuán)2222平末端特點(diǎn)③產(chǎn)生___個(gè)切口1EcoRⅠSmaⅠ筆記①斷開(kāi)2個(gè)磷酸二酯鍵②產(chǎn)生2個(gè)游離的磷酸基團(tuán)③消耗2分子水切一次④產(chǎn)生1個(gè)切口1.要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？

可產(chǎn)生幾個(gè)黏性末端？切兩個(gè)切口，產(chǎn)生四個(gè)黏性末端。2.如果把兩種來(lái)源不同的DNA用同一種限制酶來(lái)切割，會(huì)怎樣呢？會(huì)產(chǎn)生相同的黏性末端或平末端3.限制酶能切開(kāi)RNA分子的磷酸二酯鍵嗎？不能。限制酶只能識(shí)別并切割特定的雙鏈DNA分子。相關(guān)思考【探究】：寫(xiě)出下列限制酶切割形成的黏性末端GATCAATTAGCTGATC【思考】同種限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端是否一定不同？相同可能會(huì)相同限制酶總結(jié)：1.限制酶：是一類酶，不是一種，主要來(lái)源于原核生物，作用于磷酸二酯鍵。2.限制酶具有專一性：3.限制酶切割結(jié)果：4.黏性末端：不同的限制酶可能產(chǎn)生相同的黏性末端識(shí)別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列切割每條鏈特定部位的磷酸二酯鍵產(chǎn)生黏性末端（中軸線兩側(cè)切開(kāi)）產(chǎn)生平末端（中軸線處切開(kāi)）5’…G3’…C-C-T-A-G5’…T-C-G-A…3’①②③3’…A-G-C-T…5’

-G-A-T-C-C…3’-G…5’-C-GTTAA-再來(lái)一個(gè)：寫(xiě)出限制酶切割后的片段補(bǔ)充完整旁欄思考題：1.根據(jù)來(lái)源推測(cè)限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？（P71）2.試推測(cè)限制酶為什么不會(huì)切割細(xì)菌自身的DNA*？（P74）

原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，故其在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了一套完善的防御機(jī)制。限制酶是一種防御性工具，用于切割外源DNA、使之失效，以保證自身安全

含某種限制酶的細(xì)菌的DNA分子不存在該限制酶的識(shí)別序列或者識(shí)別序列被修飾（如：甲基化），使限制酶不能將其切開(kāi)。資料卡——限制酶名字的由來(lái)

用生物屬名的頭一個(gè)字母與種加詞的頭兩個(gè)字母，組成了3個(gè)字母的略語(yǔ)，以此來(lái)表示這個(gè)酶是從哪種生物中分離出來(lái)的。

例如一種限制酶是從大腸桿菌（Escherichiacoli）的R型菌株分離來(lái)的，就用字母EcoR表示；

如果它是從大腸桿菌R型菌株中分離出來(lái)的第一種限制酶，則進(jìn)一步表示成EcoRⅠ。小練習(xí)：粘質(zhì)沙雷氏桿菌（Serratiamarcesens）中分離的第一種限制酶即_______SmaⅠ思考.討論：重組DNA分子…TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATG

AATTCGGCATAC…

GCCGTATG……TCCTAG…AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGAATTCCATAC…GGTATG…GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG5′3′5′3′5′3′5′3′

產(chǎn)生缺口怎么辦？DNA連接酶二.DNA鏈接酶——“分子縫合針”

1.作用：

將雙鏈DNA片段“縫合”起來(lái)，恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵。

2.作用部位：磷酸二酯鍵①種類②來(lái)源③功能特性④相同點(diǎn)E·coli

DNA連接酶T4DNA連接酶大腸桿菌T4噬菌體只能連接具有互補(bǔ)黏性末端的DNA片段既可以連接互補(bǔ)的黏性末端，又可以連接平末端（連接平末端的效率相對(duì)較低）恢復(fù)的被限制酶切開(kāi)的磷酸二酯鍵二.DNA連接酶——“分子縫合針”3.E·coliDNA連接酶的縫合作用兩個(gè)雙鏈DNA片段要具有互補(bǔ)黏性末端才能連接起來(lái)把兩個(gè)雙鏈DNA片段黏性末端間的縫隙“縫合”起來(lái)，注意：DNA連接酶可連接兩個(gè)雙鏈DNA片段中的DNA單鏈缺口，但不能直接連接兩條單鏈的DNA?、佗赥4

DNA連接酶還可以把平末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，但效率相對(duì)較低。4.T4DNA連接酶的縫合作用DNA連接酶具有特異性嗎？DNA連接酶無(wú)識(shí)別特異性GATCAATTAGCTGATCCAATTGAGTATCDNA聚合酶以DNA的一條鏈為模板，將單個(gè)脫氧核苷酸加到已有脫氧核苷酸片段上形成單鏈DNA連接酶和DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？DNA連接酶DNA聚合酶相同作用實(shí)質(zhì)化學(xué)本質(zhì)不同點(diǎn)模板作用作用結(jié)果用途催化形成磷酸二酯鍵蛋白質(zhì)

不需要需要DNA的一條鏈作模板形成完整的重組DNA分子形成DNA的一條鏈基因工程DNA復(fù)制催化單個(gè)核苷酸加到已有核苷酸片段上，形成磷酸二酯鍵催化兩個(gè)雙鏈DNA片段之間形成磷酸二酯鍵DNA連接酶與DNA聚合酶的比較：DNA連接酶和DNA聚合酶有區(qū)別嗎？區(qū)別：1.DNA聚合酶：催化單個(gè)脫氧核苷酸加到已有脫氧核苷酸片段上，形成磷酸二酯鍵，需要模板2.DNA連接酶：催化兩個(gè)雙鏈DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。相同點(diǎn)：1.化學(xué)本質(zhì)都是蛋白質(zhì)2.都催化形成磷酸二酯鍵思考.討論：重組DNA分子1.剪刀和透明膠條分別代表哪種“分子工具”？剪刀代表限制酶；透明膠條代表DNA連接酶。2.你制作的黏性末端的堿基能不能互補(bǔ)配對(duì)?如果不能，可能是什么原因造成的？

可能是剪切位點(diǎn)或連接位點(diǎn)選得不對(duì)，也可能是其他原因。3.你插入的DNA片段能稱得上一個(gè)基因嗎？不能因?yàn)榛虻拈L(zhǎng)度一般在100個(gè)堿基對(duì)以上。復(fù)習(xí)那些年學(xué)過(guò)的與DNA相關(guān)的幾種酶種類作用底物作用部位形成產(chǎn)物DNA連接酶DNA聚合酶限制酶解旋酶DNA分子片段游離脫氧核苷酸DNA分子DNA分子磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵氫鍵重組DNA分子形成DNA的一條鏈含黏性末端或平末端的DNA片段單鏈DNA注意：DNA（水解）酶：水解DNA的酶。包括徹底水解和不完全水解限制酶DNA連接酶解旋酶DNA聚合酶試判斷以上過(guò)程起作用的酶的名稱及時(shí)練（1）通過(guò)基因工程產(chǎn)生的變異是不定向的

（

）（2）限制性內(nèi)切核酸酶均能特異性地識(shí)別6個(gè)核苷酸序列（

）（3）DNA連接酶能將兩堿基間通過(guò)氫鍵連接起來(lái)

（

）（4）E.coliDNA連接酶既可連接平末端，又可連接黏性末端

（

）（5）限制酶和解旋酶的作用部位相同

（

）判斷?？颊Z(yǔ)句，澄清易混易錯(cuò)1.載體的作用是什么？載體是否就是質(zhì)粒？若不是，載體有哪些種類？2.外源基因要插入載體，載體需要具備什么條件?3.要使攜帶的外源基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并大量擴(kuò)增，載體需要具備什么條件?4.肉眼看不到載體是否進(jìn)入受體細(xì)胞，為了便于篩選重組DNA分子，載體需要具備什么條件?閱讀課本P72思考下列問(wèn)題：三.基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體

——“分子運(yùn)輸車(chē)”

1.作用：①將外源基因轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。②使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并表達(dá)

2.種類：通常是用質(zhì)粒。噬菌體、動(dòng)、植物病毒也可以?；蚬こ讨械妮d體和載體蛋白是一回事嗎？基因工程的載體載體蛋白化學(xué)本質(zhì)作用DNA分子蛋白質(zhì)將外源基因送入受體細(xì)胞運(yùn)載需進(jìn)出細(xì)胞的特定物質(zhì)種類用途不同點(diǎn)質(zhì)粒、噬菌體植物病毒動(dòng)物病毒將外源基因?qū)氪竽c桿菌等受體細(xì)胞將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞將外源基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞①來(lái)源不同②在大小、結(jié)構(gòu)、復(fù)制方式有差別③可插入外源DNA片段的大小有很大差別不同載體的比較：病毒能作為載體的原因：病毒能感染細(xì)胞，并具有傳送其基因組至靶細(xì)胞的能力。三.基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體

——“分子運(yùn)輸車(chē)”

3.常用載體——質(zhì)粒

質(zhì)粒:是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、獨(dú)立于真核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。2.外源基因要插入載體，載體需要具備什么條件?有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)3.要使外源基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并大量擴(kuò)增，載體需要具備什么條件?目的基因標(biāo)記基因復(fù)制原點(diǎn)重組DNA分子整合導(dǎo)入受體細(xì)胞4.肉眼看不到攜帶外源基因的載體是否導(dǎo)入受體細(xì)胞，為了便于篩選重組DNA分子，載體需要具備什么條件?具有特殊的標(biāo)記基因標(biāo)記基因篩選原理標(biāo)記基因通常有:①抗生素的抗性基因，如:抗氨芐青霉素基因(ampr)、抗四環(huán)素基因(tetr)②熒光蛋白基因，如:綠色熒光蛋白基因(GFP)、紅色熒光蛋白基因(RFP)標(biāo)記基因篩選原理

載體上的標(biāo)記基因一般是某種抗生素的抗性基因，而受體細(xì)胞沒(méi)有抵抗該抗生素的能力。將含有某抗生素抗性基因的載體攜帶目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，抗性基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，受體細(xì)胞對(duì)該抗生素產(chǎn)生抗性。

在含有該抗生素的培養(yǎng)基上，能夠生存的是被導(dǎo)入了載體的受體細(xì)胞。現(xiàn)學(xué)現(xiàn)用：選用下圖載體將目的基因?qū)爰?xì)菌中并將含有目的基因的細(xì)菌篩選出來(lái)1.在培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)基中添加抗生素B，則應(yīng)選擇的限制酶為_(kāi)_____2.在培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)基中添加抗生素A，則應(yīng)選擇的限制酶為_(kāi)_____①或②①*酶③也會(huì)切割酶②識(shí)別的序列，因此不能選擇酶③3.載體需具備的條件供外源基因插入使外源基因穩(wěn)定存在且數(shù)量可以擴(kuò)增便于重組DNA分子的篩選目的基因插入位點(diǎn)復(fù)制原點(diǎn)標(biāo)記基因

真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過(guò)人工改造的。培育抗番木瓜環(huán)斑病毒的木瓜抗番木瓜環(huán)斑病毒基因提取抗番木瓜環(huán)斑病毒基因與載體DNA連接抗番木瓜環(huán)斑病毒基因?qū)胧荏w細(xì)胞“分子手術(shù)刀”“分子縫合針”“分子運(yùn)輸車(chē)”準(zhǔn)確切割DNA分子將DNA片段連接起來(lái)將體外重組好的DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞重組DNA技術(shù)的基本工具基因工程的工具限制酶主要存在于原核生物中具有專一性(特異性識(shí)別并切割DNA分子)斷開(kāi)DNA分子的磷酸二酯鍵DNA連接酶連接磷酸二酯鍵主要種類E.coliDNA連接酶：只縫合黏性末端T4DNA連接酶：縫合黏性末端和平末端載體具備的條件載體類型：質(zhì)粒（常用)、噬菌體、動(dòng)植物病毒（1）作為載體的質(zhì)粒通常采用抗生素合成基因作為篩選標(biāo)記基因

（

）（2）質(zhì)粒是環(huán)狀雙鏈DNA分子，是基因工程常用的載體

（

）（3）載體（如質(zhì)粒）和細(xì)胞膜中的載體蛋白的成分相同

（

）（4）作為載體，必須要有標(biāo)記基因

（

）判斷?？颊Z(yǔ)句，澄清易混易錯(cuò)現(xiàn)學(xué)現(xiàn)用：課后題拓展應(yīng)用2

（1）哪種限制酶切割B片段產(chǎn)生的DNA片段能與限制酶SpeⅠ切割的A片段產(chǎn)生的DNA片段相連接，為什么？XbaⅠ因?yàn)閄baⅠ與SpeⅠ切割產(chǎn)生了相同的黏性末端（可互補(bǔ)）思考：課后題拓展應(yīng)用2（2）不同的限制酶切割可能產(chǎn)生相同的黏性末端，這在基因工程操作中有什么意義？

識(shí)別DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶被稱為同尾酶；同尾酶在構(gòu)建載體時(shí)，使切割位點(diǎn)的選擇范圍擴(kuò)大；問(wèn)題探討載體目的基因自身環(huán)化隨意連接目的基因自連質(zhì)粒自連目的基因與質(zhì)粒連接目的基因與目的基因連接質(zhì)粒與質(zhì)粒連接正向連接反向連接11’22’122’1’22’1’11.將同一種限制酶切割獲得的目的基因和質(zhì)粒混合后加DNA連接酶會(huì)出現(xiàn)的連接方式有：思考.討論：重組DNA分子…TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATG

AATTCGGCATAC…

GCCGTATG……TCCTAG…AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGAATTCCATAC…GGTATG…GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG5′3′5′3′5′3′5′3′2.如何防止目的基因和載體的自身環(huán)化以及目的基因的反向連接？-G-CTTAA-A-TCTAG使用兩種不同的限制酶：①防止目的基因和載體的自身環(huán)化②防止目的基因與載體的反向連接問(wèn)題探討雙酶切3.限制酶的選擇原則？問(wèn)題探討(1)不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SmaⅠ。(2)保留標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)原則：所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選擇SmaⅠ。(3)確保出現(xiàn)相同黏性末端原則：通常選擇與切割目的基因相同的限制酶切割質(zhì)粒，如圖中PstⅠ；為避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖也可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶。思考討論1.只用一種限制酶切割目的基因和質(zhì)粒的時(shí)候會(huì)出現(xiàn)什么現(xiàn)象？（1）自身環(huán)化（2）隨意連接（反向連接）2.雙酶切時(shí)是否能用EcoRⅠ和BamHⅠ？為什么？四環(huán)素抗性基因EcoRⅠHindⅢBamHⅠ不能

因?yàn)锽amHⅠ會(huì)破壞質(zhì)粒的標(biāo)記基因，無(wú)法進(jìn)行重組DNA篩選。同時(shí)BamHⅠ切割位點(diǎn)在目的基因上，也會(huì)破壞目的基因。EcoRⅠHindⅢBamHⅠ

DNA存在于細(xì)胞內(nèi)部，如果要在體外對(duì)DNA進(jìn)行操作，第一步應(yīng)該怎么做？將DNA提取出來(lái)，并進(jìn)行鑒定1.DNA粗提取的原理DNA的粗提取與鑒定

利用DNA與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異，提取DNA，去除其他成分。①DNA不溶于酒精溶液

DNA不溶于酒精溶液，但細(xì)胞中某些蛋白質(zhì)則溶于酒精。利用這一原理，可初步分離DNA與蛋白質(zhì)。②DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同

DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，DNA能溶解在2mol/L的NaCl，而使雜質(zhì)沉淀，以達(dá)到分離目的。DNA的粗提取與鑒定1.DNA粗提取的原理2.DNA的鑒定原理在沸水浴的條件下，DNA與二苯胺反應(yīng)呈現(xiàn)藍(lán)色。DNA的粗提取與鑒定1.了解DNA的物理和化學(xué)性質(zhì)，理解DNA粗提取和鑒定的原理。2.學(xué)會(huì)DNA粗提取的方法以及用二苯胺試劑對(duì)DNA進(jìn)行鑒定。3.目的要求：DNA的粗提取與鑒定1）材料：新鮮洋蔥、香蕉、菠菜、菜花或豬肝等作為實(shí)驗(yàn)材料、4.材料用具：DNA的粗提取與鑒定能否選用牛、羊、馬、豬、兔等哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)材料？

不能選擇哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞，因?yàn)椴溉閯?dòng)物成熟的紅細(xì)胞中沒(méi)有細(xì)胞核和線粒體，幾乎不含DNA1）試劑：研磨液（P117）、體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精、2mol/L的NaCl溶液、二苯胺試劑和蒸餾水等。4.材料用具：DNA的粗提取與鑒定1.SDS：使蛋白質(zhì)變性與DNA分離2.EDTA：一種DNA酶的抑制劑，可防止細(xì)胞破碎后DNA酶降解DNA3.Tris：穩(wěn)定溶液pH，防止DNA在pH發(fā)生變化時(shí)降解或變性。研磨液試劑缺乏時(shí)可用洗潔精和食鹽代替DNA的粗提取與鑒定

加洗滌劑（含SDS）的目的：裂解細(xì)胞膜，核膜，使蛋白質(zhì)變性；

加入食鹽的目的：使構(gòu)成染色體的核蛋白加速解聚，游離出DNA，并溶解DNA1）試劑：研磨液（P117）、體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精、2mol/L的NaCl溶液、二苯胺試劑和蒸餾水等。4.材料用具：DNA的粗提取與鑒定相關(guān)試劑析出DNA:______溶解DNA:______________________鑒定DNA:_______________;體積分?jǐn)?shù)為95%酒精2mol/L的NaCl溶液二苯胺試劑現(xiàn)配現(xiàn)用5.方法步驟取材、研磨去除濾液中的雜質(zhì)析出DNANaCl溶液溶解DNA并鑒定研磨稱取約30g洋蔥，切碎，然后放入研缽中，倒入10mL研磨液，充分研磨。DNA的粗提取與鑒定研磨的目的破碎細(xì)胞，使核物質(zhì)容易溶解在研磨液中(1)取材、研磨思考：研磨不充分會(huì)導(dǎo)致什么情況？

研磨不充分，會(huì)使DNA分子不能從細(xì)胞核中釋放出來(lái)，從而影響提取的DNA的含量②研磨時(shí)間不宜太長(zhǎng)

防止研磨時(shí)產(chǎn)生的熱量影響DNA的提取量注意：可加入纖維素酶、果膠酶（有利于充分研磨）

若利用動(dòng)物細(xì)胞提取DNA破碎細(xì)胞的方法是什么?放入蒸餾水中讓其吸水漲破過(guò)濾取上清液方法一：在漏斗中墊上紗布，將洋蔥研磨液過(guò)濾到燒杯中，在4℃冰箱中放置幾分鐘后，再取上清液。

方法二：直接將研磨液倒入塑料離心管中，在1500r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min，再取上清液放入燒杯中。DNA的粗提取與鑒定(2)去除濾液中的雜質(zhì)目的：抑制DNA酶的活性，進(jìn)而抑制DNA降解。1、此過(guò)程濾紙能否代替紗布？

不能，使用濾紙會(huì)導(dǎo)致DNA吸附在濾紙上而大量損失2、上清液中除DNA之外，可能含有哪些雜質(zhì)？

可能含有蛋白質(zhì)、RNA、多糖等雜質(zhì)析出DNA在上清液中加入體積相等的、預(yù)冷的酒精溶液（體積分?jǐn)?shù)為95%），靜置2～3min，溶液中出現(xiàn)的白色絲狀物就是粗提取的DNA。方法一：用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸去上面的水分；方法二：將溶液倒入塑料離心管中，10000r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min，棄上清液，將管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干。DNA的粗提取與鑒定(3)析出DNA2.為什么要沿一個(gè)方向攪拌？

減少DNA斷