細(xì)菌耐藥性與臨床

關(guān)于細(xì)菌耐藥性與臨床12生命總會(huì)找到出路，只要使用抗生素，細(xì)菌遲早會(huì)出現(xiàn)耐藥。人類在不斷研究細(xì)菌，不斷研制抗生素，曾一時(shí)遏制住了病原菌，但也造蹴了大批耐藥菌株，直接危及感染患者的生命，給臨床治療帶來極大困難，這是世界一大難題。因此，既依靠臨床醫(yī)生的精湛醫(yī)術(shù)和責(zé)任心，同時(shí)也離不開細(xì)菌工作者的大量繁瑣工作，準(zhǔn)確快速地培養(yǎng)檢測(cè)出病原菌并且科學(xué)地進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果分析，及早報(bào)告以指導(dǎo)臨床正確用藥顯得十分重要。第2頁,共36頁，2024年2月25日，星期天3主要內(nèi)容：▲細(xì)菌與抗生素概況△臨床標(biāo)本送檢△細(xì)菌分類△抗生素種類

△抗生素作用機(jī)制△細(xì)菌耐藥特性及耐藥機(jī)制▲全球多重耐藥細(xì)菌現(xiàn)狀△GPC：MRS（MRSA、MRCNS）VISA（VRSA）PRPVRE、VDE△

GNB：ESBLS

AMPC

PAER

SMAL

ABA

▲多重耐藥細(xì)菌的治療原則第3頁,共36頁，2024年2月25日，星期天4一、細(xì)菌與抗生素概況：△送檢：臨床送來標(biāo)本，首先檢查合格與否，培養(yǎng)標(biāo)本必須用無菌容器或試管，無破裂，病人信息與標(biāo)本一致，呼吸道標(biāo)本應(yīng)取粘稠的深部痰液或支氣管沖洗液，不合格標(biāo)本應(yīng)退回重送。血培養(yǎng)瓶選擇：黃色蓋為厭氧瓶，藍(lán)色蓋（白）為需氧瓶，已用抗生素選擇樹脂瓶。打印條碼項(xiàng)目要分開，真菌＋細(xì)菌、抗酸菌涂片獨(dú)立，細(xì)菌培養(yǎng)、真菌培養(yǎng)或加藥敏，抗酸菌培養(yǎng)，血需氧培養(yǎng)可加真菌培養(yǎng)，血厭氧培養(yǎng)。（培養(yǎng)時(shí)間：一般細(xì)菌3－4天，血培養(yǎng)7天，抗酸菌培養(yǎng)8周。中段尿培養(yǎng)需菌落計(jì)數(shù)，大便、痰、體液、血、分泌物等不需開計(jì)數(shù)。第4頁,共36頁，2024年2月25日，星期天5△標(biāo)本接種：一般細(xì)菌培養(yǎng)采用分區(qū)劃線法，曲線劃線法，傾注平板法，穿刺培養(yǎng)法，液體培養(yǎng)基接種法，二號(hào)菌采用三板二管法，結(jié)核桿菌培養(yǎng)需特殊處理，根據(jù)不同細(xì)菌生長需要，選擇合適培養(yǎng)基、溫度、環(huán)境等。第5頁,共36頁，2024年2月25日，星期天6△細(xì)菌分類：由高到低分別為界，門、綱、目、科、屬、種，常規(guī)鑒定為科、屬、種。

革蘭氏陽性菌有：球菌：葡萄球菌、鏈球菌、微球菌；桿菌：白喉?xiàng)U菌、芽胞桿菌、李斯特菌等；其它：白色念珠菌、副禿發(fā)念珠菌、熱帶念株菌、隱球菌等。革蘭氏陰性菌有：球菌：淋球菌、腦膜炎球菌、卡他莫拉菌；

桿菌：發(fā)酵菌和非發(fā)酵菌。臨床分離的細(xì)菌分布：陰性桿菌約占70％，陽性球菌約占25％，真菌約占5％，分離率前幾位有大腸、銅綠、肺克、不動(dòng)桿菌屬、腸桿菌屬、葡萄球菌屬。第6頁,共36頁，2024年2月25日，星期天7△細(xì)菌耐藥特性：

1、只要使用抗生素，細(xì)菌遲早會(huì)耐藥，敏感菌株通過變異或基因轉(zhuǎn)移而獲得耐藥性。

2、細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性總是經(jīng)歷敏感中介低耐高耐這樣過程。

3、當(dāng)細(xì)菌對(duì)一種抗生素產(chǎn)生耐藥后容易變?yōu)槎嘀啬退帯?/p>

第7頁,共36頁，2024年2月25日，星期天84、細(xì)菌一旦形成耐藥性，則很難回復(fù)敏感狀態(tài)（需周期性替換用藥）。5、人畜共患病原菌耐藥性的增加和蔓延，進(jìn)而通過食物鏈傳播給人?！髂退帣C(jī)制：a、各種酶的產(chǎn)生；b、抗生素滲透障礙；c、靶位的改變（PBP）；d、主動(dòng)外排作用；e、生物膜的產(chǎn)生等。

第8頁,共36頁，2024年2月25日，星期天9△

抗生素種類

β-內(nèi)酰胺類：碳青霉烯類：亞胺培南、美羅培南頭孢菌素類：第一代：頭孢拉啶、頭孢唑啉第二代：頭孢丙烯、頭孢克羅、頭孢呋辛第三代：頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢噻肟第四代：頭孢吡肟（馬斯平）第9頁,共36頁，2024年2月25日，星期天10

青霉素類：甲氧西林、苯唑西林、氨芐西林、哌拉西林氨基糖苷類：阿米卡星、慶大霉素、鏈霉素大環(huán)內(nèi)酯類：阿奇霉素、紅霉素喹諾酮類：環(huán)丙沙星、氟諾沙星糖肽類：萬古霉素、替考拉寧鏈陽菌素（奎努普汀

/達(dá)福普汀）第10頁,共36頁，2024年2月25日，星期天11

△抗生素作用機(jī)制：1、干擾細(xì)菌細(xì)胞壁的合成：β-內(nèi)酰胺類、萬古霉素2、損傷細(xì)菌細(xì)胞膜，破壞其屏障作用：多粘菌素B、兩性霉素B3、影響細(xì)菌細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成：四環(huán)素、氯霉素、大環(huán)內(nèi)脂類、氨基糖苷類4、影響核酸合成代謝：喹諾酮類、利福平、新生霉素5、抑制細(xì)菌葉酸合成：磺胺類、甲氧芐啶6、抑制結(jié)核環(huán)脂酸的合成：異煙肼等第11頁,共36頁，2024年2月25日，星期天12二、全球多重耐藥細(xì)菌現(xiàn)狀：

MRS：耐甲氧西林葡萄球菌，包括MRSA：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌。

MRCNS：耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌。

1959年甲氧西林問世，1961年英國首例報(bào)道了MRSA，隨后幾十年中，MRS感染遍及全球，很多地區(qū)已達(dá)90%以上，已成為醫(yī)院內(nèi)感染的重要病源菌之一，因此開展MRS的檢測(cè)，對(duì)指導(dǎo)臨床治療具有重大意義。MRS耐藥機(jī)制：質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥是產(chǎn)β--內(nèi)酰胺酶所至，染色體介導(dǎo)耐藥是PBP的改變。第12頁,共36頁，2024年2月25日，星期天13△MRS耐藥特點(diǎn)：

1、大部分為不均一耐藥，二個(gè)亞群，多數(shù)敏感株，少數(shù)耐藥株；

2、耐藥株一般生長緩慢，在30℃，PH7.0及高滲條件下可提高生長速度；

3、多重耐藥性，除對(duì)甲氧西林耐藥外，還對(duì)其他β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、氯霉素、大環(huán)內(nèi)脂類耐藥。

4、目前尚不能可靠地推測(cè)出對(duì)耐酶青霉素和頭孢菌素的葡萄球菌，故檢出MRS時(shí)即使體外敏感亦報(bào)耐藥。第13頁,共36頁，2024年2月25日，星期天14△MRS檢測(cè)：

由于MRS對(duì)其他耐酶半合成青霉素也耐藥，且苯唑西林在貯存過程中藥效不易降低，對(duì)不均一耐藥性檢測(cè)效果更好，因此，美國臨床醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS）推薦用苯唑西林代替甲氧西林。第14頁,共36頁，2024年2月25日，星期天151、紙片擴(kuò)散法（K-B法）苯唑西林含量1ug/片,MRSA：35℃24h抑菌圈直徑≤10mm為耐藥，≥13mm為敏感，11－12mm為中介；MRCNS：35℃,48h，直徑≤17mm為耐藥，≥18mm為敏感。其優(yōu)點(diǎn)是快速、簡(jiǎn)便和價(jià)格便宜。2、肉湯釋釋MIC法：肉湯培養(yǎng)基加濃度為20%的Nacl,，同時(shí)加鈣、鎂陽離子，將苯唑西林進(jìn)行倍比稀釋，從0.125－16ug/ml菌液濃度為0.5麥?zhǔn)蠁挝?，MRSA：35℃，24h，MIC≤2ug/ml為敏感，≥4ug/ml為耐藥；MRCNS：35℃，48h,MIC≤0.25ug/ml為敏感，≥0.5ug/ml為耐藥。該法檢出率可達(dá)95%以上。儀器及E-TEST法屬此類。第15頁,共36頁，2024年2月25日，星期天163、通過對(duì)慶大霉素的敏感性判斷MRS，實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)99%的MRS菌株對(duì)慶大是耐藥的，因此，如果葡萄球菌對(duì)慶大霉素耐藥而對(duì)苯唑西林敏感，則應(yīng)重新檢測(cè)苯唑西林的敏感性。

△VRSA：耐萬古霉素金黃色葡萄球菌，由于MRSA感染問題日趨嚴(yán)重，腸球菌感染不斷增多，導(dǎo)致萬古用量大增，在抗生素壓力下，葡萄球菌對(duì)萬古的敏感性減低，因此出現(xiàn)了VISA。1997年日本首先報(bào)道，隨后美國也報(bào)道了2例。VISA檢測(cè)法有：MIC肉湯稀釋法、E-TEST法等。NCCLS判定標(biāo)準(zhǔn)：35℃,24-48h,MIC≤4ug/ml為敏感（VSSA），MIC＝8-16ug/ml為中介（VISA），MIC≥32ug/ml為耐藥（VRSA）。

治療可用新型喹諾酮＋β內(nèi)酰胺類聯(lián)合用藥。第16頁,共36頁，2024年2月25日，星期天17△PRP：耐青霉素的肺炎鏈球菌，肺炎鏈球菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥機(jī)制是PBP的改變而致，至今尚未發(fā)現(xiàn)β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生。

PRP的耐藥特點(diǎn)：

1、青霉素MIC≥1ug/ml的肺炎鏈球菌常伴有多重耐藥，如氯霉素、磺胺類、紅霉素、四環(huán)素，氨基糖苷類等；

2、兒童分離的肺炎鏈球菌耐藥率及耐藥水平均高于成年人。

第17頁,共36頁，2024年2月25日，星期天18

PRP的檢測(cè)：用苯唑西林1ug/片，篩選試驗(yàn)檢測(cè)青霉素的敏感性，抑菌圈直徑≥20mm則為敏感，≤19mm為耐藥，但必須用MIC法進(jìn)一步測(cè)定，不可草率報(bào)告。MIC0.1－1ug/ml為低耐青霉素株，MIC≥2ug/ml為高耐株。氨芐西林、阿莫西林、頭孢噻肟、頭孢曲松、亞胺培南至今尚無可靠的紙片法判定標(biāo)準(zhǔn)，需用MIC法測(cè)定其活性。第18頁,共36頁，2024年2月25日，星期天19△VRE：耐萬古霉素腸球菌，

VDE：萬古霉素依賴性腸球菌。

腸球菌為條件致病菌，可致多種嚴(yán)重感染，其耐藥現(xiàn)象比較復(fù)雜，一是天然耐藥；二是獲得性耐藥。在臨床分離的腸球菌中許多呈多重耐藥，更為嚴(yán)重的是氨基糖苷類高水平耐藥的腸球菌（HLAR）和耐萬古霉素腸球菌（VRE）逐年增多。VRE有四種基因型：VanA對(duì)萬古霉素及替考拉寧均高水平耐藥；VanB對(duì)萬古低水平耐藥，對(duì)替考拉寧敏感；VanD對(duì)萬古中等耐藥，對(duì)替考拉寧敏感，VanC天然對(duì)萬古耐藥。第19頁,共36頁，2024年2月25日，星期天20

VRE檢測(cè)：紙片擴(kuò)散法（K-B法）：萬古霉素30ug/片，35。C，24h判斷結(jié)果，抑菌圈直徑≤14mm為耐藥，15-16mm為中介，≥17mm為敏感。MIC法：35。C,24h,萬古霉素MIC≤4ug/ml為敏感，8-16ug/ml為中個(gè)，≥32ug/ml耐藥；替考拉寧MIC≤8ug/ml為敏感，16ug/ml為中介，≥32為耐藥（替考拉寧為側(cè)鏈大分子結(jié)構(gòu)，K-B法影響因素較多，準(zhǔn)確性欠佳，應(yīng)采用MIC法檢測(cè)）。HLAR判斷標(biāo)準(zhǔn)：慶大中度耐藥，MIC64-500ug/ml，K-B法10ug/片耐藥而120ug/片敏感；慶大高水平耐藥，MIC≥500ug/ml，K-B法120ug/片耐藥。萬古及慶大高水平耐藥雙耐菌株約占1%，藥敏試驗(yàn)：氨基糖苷（高水平除外）、頭孢菌素、克林霉素、復(fù)方新諾明在體外可能有活性，但臨床無效，不能報(bào)敏感。第20頁,共36頁，2024年2月25日，星期天21HLAR篩選的意義：耐藥時(shí)表示對(duì)作用于細(xì)胞壁的抗生素（氨芐西林、青、萬古）無協(xié)同作用，敏感時(shí)表示對(duì)其有協(xié)同作用。據(jù)報(bào)道，所有β-內(nèi)酰胺類、高濃度糖苷類及萬古耐藥的腸球菌對(duì)脂肽類（達(dá)托霉素）敏感，但目前尚處在早期臨床研究階段。第21頁,共36頁，2024年2月25日，星期天22▲

GNB方面：

PBP的改變是GP菌耐β-內(nèi)酰胺類抗生素的主要機(jī)制，而在GN菌中最普遍和最主要的是產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶。目前全球報(bào)道的β-內(nèi)酰胺酶已達(dá)200多種，主要有青霉素酶、頭孢菌素酶、超廣譜酶、金屬酶等。第22頁,共36頁，2024年2月25日，星期天23

ESBLS（超廣譜酶）：自1983年德國首例發(fā)現(xiàn)ESBLS以來已在全球急速傳播，特別是臨床標(biāo)本分離的肺炎克雷伯菌和大腸埃希氏菌發(fā)生率最高達(dá)30-40%。其特點(diǎn)是可以水解青霉素、第三代頭孢菌素和氨曲南，頭霉菌素和碳青霉烯類不受影響；多數(shù)可被克拉維酸抑制；質(zhì)粒介導(dǎo)，由普通β－內(nèi)酰胺酶基因突變而來；體內(nèi)體外藥敏不一致性。ESBLS的檢測(cè)方法是根據(jù)其可水解第三代頭孢菌素和氨曲南，并可被克拉維酸所抑制的特點(diǎn)來設(shè)計(jì)的，由于ESBLS對(duì)各種三代頭孢菌素和氨曲南的水解率因酶的類別不同而異，故一般最少要選擇兩種以上的抗生素底物來進(jìn)行試驗(yàn)。第23頁,共36頁，2024年2月25日，星期天24檢測(cè)方法：

1、紙片擴(kuò)散法篩選試驗(yàn)：按常規(guī)K-B法在MH平板上涂布好受試菌，選擇頭孢泊肟10ug/片，頭孢他啶10ug/片，頭孢噻肟30ug/片，頭孢曲松30ug/片或氨曲南30ug/片，兩種或以上進(jìn)行試驗(yàn)，各紙片之間的間距不少于24mm，35。C，18-20h觀察結(jié)果，抑菌圈直徑相應(yīng)地≤22mm,≤22mm,≤22mm,≤27mm,≤25,≤27mm,則可疑產(chǎn)ESBLS株。確證試驗(yàn)：按上述方法分別貼頭孢他啶（30ug/片）和頭孢他啶/克拉維酸（30/10ug/片），頭孢噻肟（30ug/片）和頭孢噻肟/克拉維酸（30/10ug/片），當(dāng)任何一種藥物在加入克拉維酸后抑菌圈直徑增大超過5mm時(shí)判定為產(chǎn)ESBLS。第24頁,共36頁，2024年2月25日，星期天25

2、MIC法篩選試驗(yàn)：選擇兩種或以上抗生素進(jìn)行試驗(yàn)，按標(biāo)準(zhǔn)肉湯稀釋法操作，35。C，18-20h，只要有菌生長則疑為產(chǎn)ESBLS。確證試驗(yàn)：選頭孢他啶和頭孢他啶/克維酸，頭孢噻肟和頭孢噻肟/克拉維酸按標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作，其MIC比值≥8倍則確證為產(chǎn)ESBLS。第25頁,共36頁，2024年2月25日，星期天26

ESBLS引起感染的臨床診斷與治療仍然是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一，該菌對(duì)青霉素、頭孢菌素、氨曲南等體外藥敏試驗(yàn)敏感，而臨床治療無效；呈多重耐藥性，給治療帶來很大困難；該菌耐藥基因由質(zhì)粒介導(dǎo)，可在同種或異種菌之間轉(zhuǎn)移，使敏感菌變?yōu)槟退幘饑?yán)重院內(nèi)交叉感染和院外耐藥菌播散。第26頁,共36頁，2024年2月25日，星期天27△AMPC酶屬β-內(nèi)酰胺酶功能分類（BUSH）中1型酶，其特點(diǎn)有：

1、常在抗生素治療過程中誘導(dǎo)產(chǎn)生，并可能選擇出持續(xù)高產(chǎn)AMPC突變株；

2、所有β-內(nèi)酰胺酶抑制劑均不能解決AMPC酶，相反克拉維酸是強(qiáng)誘導(dǎo)劑；

3、碳青霉烯類是潛在的AMPC酶誘導(dǎo)劑，但對(duì)AMPC酶高度穩(wěn)定，因此沒有選擇去阻遏突變株的作用，AMPC酶主要由腸桿菌屬、弗勞地枸椽酸菌、摩根氏菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、銅綠假單胞菌、變形桿菌等細(xì)菌產(chǎn)生，屬染色體型。第27頁,共36頁，2024年2月25日，星期天28

近年來發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒介導(dǎo)的AMPC酶，其來源是染色體上的AMPC誘導(dǎo)酶基因轉(zhuǎn)移至質(zhì)粒，使大腸桿菌和肺炎克雷伯菌的臨床分離株獲得質(zhì)粒介導(dǎo)的AMPC酶。怎樣鑒別ESBLS與AMPC呢？從臨床分離GNB進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)，從中篩選產(chǎn)酶株（頭孢他啶MIC≥2ug/ml,β-內(nèi)酰胺酶陽性），若頭孢西丁MIC≤16ug/ml，可被克拉維酸抑制為ESBLS，頭孢西丁MIC≥16ug/ml不被克拉維酸抑制為AMPC。近來亦有報(bào)道陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、不動(dòng)桿菌等同時(shí)存在ESBLS與AMPC。第28頁,共36頁，2024年2月25日，星期天29

AMPC經(jīng)典藥敏譜：青霉素、舒普深、三代頭孢、氨曲南耐藥，亞胺培南、四代頭孢敏感。近年來，非發(fā)酵細(xì)菌包括銅綠假單胞菌，嗜麥芽窄食單胞菌，鮑曼不動(dòng)桿菌等已成為醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌，這些菌由于細(xì)胞膜通透障礙而天然耐多種抗生素，加上其獲得性耐藥及耐藥機(jī)制復(fù)雜，給臨床治療帶來相當(dāng)難度，經(jīng)驗(yàn)性用藥必須了解本地區(qū)耐藥細(xì)菌的流行動(dòng)態(tài)。第29頁,共36頁，2024年2月25日，星期天30三、多重耐藥細(xì)菌的治療原則：

MRS：頭孢類、β-內(nèi)酰胺類、碳青霉烯類可在體外顯示活性，但臨床無效，應(yīng)選用敏感的大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類、再則用萬古或替考拉寧。

VRE：氨芐或阿莫西林+慶大或鏈霉素

HLAR：替考拉寧+環(huán)丙沙星、鏈陽霉素

PRP：頭孢噻肟或頭孢曲松、萬古、替考拉寧

ESBLS：亞胺培南、舒普深、頭孢西丁、阿米卡星

AMPC：亞胺培南、頭孢吡肟、阿米卡星

PAER：阿米卡星、環(huán)丙沙星、頭孢他啶、亞胺培南、舒普深、多粘菌素BSMAL：舒普深、特治星、頭孢他啶、復(fù)方新諾明+環(huán)丙沙星

ABA：亞胺培南、舒普深、多粘菌素B。第30頁,共36頁，2024年2月25日，星期天31預(yù)測(cè)藥物：盡管目前臨床上使用的抗菌藥物數(shù)目很多，但其中很多藥物具有相同或相似的體外活性，其差別主要在藥理、毒性及價(jià)格方面,因此在很多情況下一種抗菌藥可作為其它密切相關(guān)的抗菌藥物的代表進(jìn)行常規(guī)試驗(yàn)，這種做法在國際上得到普遍認(rèn)可。第31頁,共36頁，2024年2月25日，星期天32苯唑西林葡萄球菌屬青霉素、頭孢菌素、β－內(nèi)酰胺酶抑制劑、碳靑霉烯四環(huán)素所有菌（葡及不動(dòng)桿菌外）多西霉素、米諾環(huán)素、金霉素、地美環(huán)素、土霉素紅霉素陽性球菌羅紅霉素、克拉霉素、阿奇霉素、地紅霉素克林霉素所有菌林可霉素氨芐西林所有菌阿莫西林、巴氨西林、海他西林頭孢噻吩腸桿菌科頭孢匹林、頭孢拉啶、頭孢氨芐、頭孢克羅磺胺異噁唑所有菌所有磺胺類萘啶酸腸桿菌科所有喹諾酮類萬古所有菌替考拉寧第32頁,共36頁，2024年2月25日，星期天33藥敏試驗(yàn)報(bào)告及選藥建議藥敏：(略)報(bào)告方式：解釋性分類：S、I、R。“S”表明所測(cè)試的藥物對(duì)病人進(jìn)行治療將有很大可能是有效的；“I”意味著需高于正常劑量才會(huì)有效，也代表試驗(yàn)緩沖區(qū)；“R”意味治療很可能失敗。選藥建議：

1.一、二代頭孢菌素，氨基糖苷類在體外可能表現(xiàn)對(duì)沙門氏、志賀氏菌屬有活性，但臨床無效。2.對(duì)于沙門氏、志賀氏菌屬，常規(guī)僅測(cè)試和報(bào)告氨芐西林、一種喹諾酮和磺胺類，此外對(duì)于胃腸外分