蛋白質(zhì)和多肽的氨基酸序列分析

關(guān)于蛋白質(zhì)和多肽的氨基酸序列分析引言氨基酸是一種小分子的兩性化合物，分子量在75～200Da之間，其化學(xué)通式為：在生物體內(nèi)出現(xiàn)的氨基酸都是L型，僅在少數(shù)微生物來源的多肽中出現(xiàn)D型氨基酸。第2頁,共130頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)和多肽是由20種氨基酸按照一定的順序通過肽鍵連接成一長鏈，然后通過鏈內(nèi)、鏈間的離子鍵、疏水作用等多種作用力進(jìn)行折疊卷曲形成一定的構(gòu)象并發(fā)揮其獨特作用。氨基酸的排列順序即蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定了蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)及功能。因此，分析蛋白質(zhì)的氨基酸序列是進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能研究中不可缺少的部分。引言第3頁,共130頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)測序的研究歷史1947采用部分水解的方法試圖測定蛋白質(zhì)的氨基酸序列Consden等利用色譜技術(shù)成功測定了短桿菌肽S6的氨基酸序列Sanger首次測定了牛胰島素的一級結(jié)構(gòu)（由51個氨基酸殘基組成）Spackman、Stein、Moore制造了自動化的氨基酸分析儀，使氨基酸定量分析進(jìn)入了一個嶄新的階段Edman

推出第一臺自動測序儀195819551940年前1967第4頁,共130頁，2024年2月25日，星期天引言牛胰島素的一級結(jié)構(gòu)第5頁,共130頁，2024年2月25日，星期天引言第6頁,共130頁，2024年2月25日，星期天一級結(jié)構(gòu)測定的基本流程1.拆分蛋白質(zhì)分子的多肽鏈;2.鑒定多肽鏈的N-末端和C-末端殘基;3.用兩種或幾種不同的斷裂方法將多肽鏈裂解成較小的片段;4.對各肽段的氨基酸序列進(jìn)行測序;5.重建完整多肽鏈的一級結(jié)構(gòu);6.確定半胱氨酸殘基間形成的二硫鍵的位置；7.酰胺基位置的確定。引言第7頁,共130頁，2024年2月25日，星期天測定蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)前的準(zhǔn)備工作1.樣品純度必須>97%以上；聚丙烯酰胺凝膠電泳要求一條帶2.測定蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量；SDS，凝膠過濾法，沉降系數(shù)法3.測定蛋白質(zhì)多肽鏈種類和數(shù)目；種類：SDS

數(shù)目：N末端氨基酸殘基摩爾數(shù)/蛋白質(zhì)摩爾數(shù)4.測定蛋白質(zhì)的氨基酸組成；并根據(jù)分子量計算每種氨基酸的個數(shù)；引言第8頁,共130頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)氨基酸組成分析章節(jié)第二節(jié)蛋白質(zhì)的末端測定第三節(jié)

亞基拆離、肽鏈降解和肽段的分離第四節(jié)

肽段的氨基酸順序測定第五節(jié)

蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的重建第9頁,共130頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)

氨基酸組成分析第10頁,共130頁，2024年2月25日，星期天二、特殊氨基酸的保護(hù)三、衍生方法及原理第一節(jié)氨基酸組成分析四、氨基酸定性和定量分析一、蛋白質(zhì)或多肽的水解方法五、測定氨基酸組成的實驗步驟第11頁,共130頁，2024年2月25日，星期天氨基酸組成分析的目的

現(xiàn)代分離提純技術(shù)的發(fā)展使蛋白質(zhì)操作微量化，但也給定量帶來了困難，一般很難通過常規(guī)的稱量或測蛋白溶液在280nm的光吸收值來準(zhǔn)確定量蛋白質(zhì)，所以如果在蛋白質(zhì)酶解或測序前，取蛋白質(zhì)樣品的一部分進(jìn)行氨基酸組成分析，根據(jù)結(jié)果便可以推算出蛋白量的可靠值。第12頁,共130頁，2024年2月25日，星期天另外，在蛋白質(zhì)測序中有時遇到測不出結(jié)果的情況，一種可能是蛋白質(zhì)的N端封閉，另一種可能則是樣品本身不是蛋白質(zhì)或絕大部分是非蛋白質(zhì)物質(zhì)，解決這個問題的很好途徑便是做一個氨基酸組成分析以確定樣品的成分。除了蛋白質(zhì)研究和重組蛋白需要測定氨基酸組成外，醫(yī)學(xué)上也需要測定血液或各種體液中的游離氨基酸。第13頁,共130頁，2024年2月25日，星期天1水解在一定溫度、酸度等條件下，蛋白質(zhì)或多肽的肽鍵斷裂，水解成游離氨基酸。3色譜利用高效液相色譜對這些氨基酸進(jìn)行定性和定量色譜分析。2衍生在游離氨基酸殘基上衍生一個生色基團(tuán)目前蛋白質(zhì)或多肽的氨基酸組成分析主要包括3個步驟，即：最終獲得蛋白質(zhì)或多肽中各氨基酸所占摩爾百分?jǐn)?shù)或摩爾比。氨基酸組成分析的步驟第14頁,共130頁，2024年2月25日，星期天一、蛋白質(zhì)或多肽的水解方法水解是蛋白質(zhì)氨基酸組成分析的第一步，作用是破壞蛋白質(zhì)的肽鍵，得到游離的氨基酸，用于之后的定性定量分析。這是極其重要的一步，因為水解質(zhì)量的好壞將直接影響到最終分析結(jié)果的正確與否。第15頁,共130頁，2024年2月25日，星期天

雖然多肽的氨基酸組成分析已向更靈敏、更精確、更快速以及自動化方向發(fā)展和改進(jìn)，但還沒有一種單獨適用于所有殘基的，并且能在水解液中定量回收的水解方法出現(xiàn)，很多因素如溫度、時間、水解試劑、添加劑、水解方法等對水解的完全程度均有影響。下面主要對一些常用的水解方法作簡要介紹。第16頁,共130頁，2024年2月25日，星期天1、酸性水解酸性水解是采用較多的一種水解方法，其中HCl是最通用的水解劑。條件：6mol/LHCI、真空、110℃，水解時間為20～24h。即可用于液相水解模式也可用于氣相水解模式。損失：在該條件下，得到的氨基酸不消旋，但天冬酰胺和谷氨酰胺分別被完全水解為天冬氨酸和谷氨酸，色氨酸則被完全破壞，半胱氨酸不能從樣品中直接測定，酪氨酸部分被水解液中痕量雜質(zhì)所破壞，絲氨酸和蘇氨酸被部分水解，損失分別為10%和5%。第17頁,共130頁，2024年2月25日，星期天相關(guān)措施：對某些氨基酸的破壞率，需要用不同水解時間測定這些氨基酸的含量，然后外推到水解時間為0時，算得的氨基酸含量，即代表了真正數(shù)值。有些脂肪族氨基酸殘基間的肽鍵，如Ile-Ile、Val-Val、Ile-Val等之間的肽鍵難于裂解，可以通過延長水解時間如水解92h甚至120h來解決。但是長時間的水解，會使較敏感的氨基酸殘基的損失更大。半胱氨酸和甲硫氨酸往往先將蛋白質(zhì)用過甲酸氧化后再水解，相應(yīng)得到磺基丙氨酸和甲硫氨酸。

第18頁,共130頁，2024年2月25日，星期天2、堿性水解堿性水解一般選用NaOH和KOH作為水解劑。例如將水解樣品加入5mol/LNaOH中，充氮氣后填充管，110℃水解22h。該水解方法是HCl水解的互補(bǔ)法。因為堿水解時，多數(shù)氨基酸如絲氨酸、蘇氨酸、精氨酸以及半胱氨酸遭到破壞，其它的氨基酸外消旋化，僅色氨酸是穩(wěn)定的。所以此法僅限于測定色氨酸的含量。第19頁,共130頁，2024年2月25日，星期天3、酶水解用一組蛋白酶水解肽鏈，特別適用于對化學(xué)水解敏感的氨基酸如天冬酰胺和谷氨酰胺的測定。優(yōu)點是水解過程中氨基酸不發(fā)生消旋化，幾乎可以保持所有的組成氨基酸不被破壞。因為酶水解條件溫和，對天冬酰胺、谷氨酰胺等皆無破壞作用。缺點是反應(yīng)需要較長的時間，水解的產(chǎn)物為較小的肽段，水解不完全。另外，因為酶本身也是蛋白質(zhì)，對樣品的測定結(jié)果可能會有干擾。第20頁,共130頁，2024年2月25日，星期天常見蛋白水解酶及其作用位點第21頁,共130頁，2024年2月25日，星期天4、微波輻射能水解微波是一種高頻電磁波，其能量傳遞是通過分子的極化，而水分子的極化作用是非常高的，微波能量的快速吸收能導(dǎo)致完全水解的時間大大縮短。在微波輔助酸水解和微波輔助酶水解中，水解時間可從過去的幾十小時縮短到幾十分鐘。因此，微波輔助蛋白質(zhì)水解技術(shù)的出現(xiàn)大大提高了氨基酸組成分析的效率。第22頁,共130頁，2024年2月25日，星期天5、膜上蛋白質(zhì)印跡樣品的水解（原位分析）如果蛋白質(zhì)樣品采用電泳法(如SDS)分離，很難從凝膠中洗脫下來，可采用電印跡法把樣品轉(zhuǎn)移到PVDF(聚偏氟乙烯)膜上，然后在PVDF膜上直接進(jìn)行鹽酸水解和氨基酸分析，稱之為原位(insitu)分析。可將水解指管放入水解反應(yīng)器中，在反應(yīng)器底部加入200ul含7％巰基乙酸的6mol/L鹽酸，110℃真空水解24h，水解結(jié)束后用200ul含30％甲醇的0.1mol/L鹽酸反復(fù)三次將氨基酸從PVDF膜中抽提出來，以便進(jìn)行下一步的分析。第23頁,共130頁，2024年2月25日，星期天總之，蛋白質(zhì)水解階段所采用的方法不同，會對氨基酸組成分析產(chǎn)生重要影響。對于不同的蛋白質(zhì)、不同的研究目的、以及樣品量的多少，應(yīng)采取不同的水解方法。第24頁,共130頁，2024年2月25日，星期天二、特殊氨基酸的保護(hù)不同水解條件下，各種氨基酸的回收有所不同。一些敏感氨基酸如色氨酸和半胱氨酸可能遭水解破壞，導(dǎo)致無法正確測定其含量。因此水解過程中，需要考慮對特殊氨基酸的保護(hù)。第25頁,共130頁，2024年2月25日，星期天色氨酸的保護(hù)水解酸中加添加劑：例如加入巰基乙酸和β-巰基乙醇，可使色氨酸的回收可達(dá)80％。有機(jī)酸：3mol／L疏基乙磺酸或4mol/L甲磺酸在水解時對色氨酸有一定的保護(hù)作用。酶：利用蛋白酶作為水解劑，條件溫和，對天冬酰胺和谷氨酰胺及色氨酸均無破壞作用。堿：用氫氧化鈉和氫氧化鋇代替酸水解，可保護(hù)色氨酸不被破壞。第26頁,共130頁，2024年2月25日，星期天光譜法：分光光度法：應(yīng)用較早，在蛋白質(zhì)分子中，如不含胱氨酸和其他有干擾的發(fā)色基團(tuán)的氨基酸，根據(jù)其在6mol/L鹽酸胍的中性溶液中的紫外吸收，測定色氨酸和酪氨酸的含量，此經(jīng)驗公式只適用于色氨酸對酪氨酸的比值為0.2~1時的情況。二階微分光譜法：常被用來確定蛋白質(zhì)中芳香族氨基酸的含量，計算公式復(fù)雜，HewlettPackard公司推出的DAD檢測器配合其化學(xué)工作站軟件，能較方便地在線檢測并定量肽段中的色氨酸。第27頁,共130頁，2024年2月25日，星期天半胱氨酸的保護(hù)：還原烷化法：產(chǎn)生能抗水解的半胱氨酸衍生物。烷化試劑包括4-乙烯吡啶和碘代乙酸。缺點：為了確保試劑接近巰基，還原和氧化通常在變性劑存在下進(jìn)行，多余試劑和變性劑要用HPLC、沉淀法或透析去除，每一步都可能造成樣品的損失。第28頁,共130頁，2024年2月25日，星期天氧化反應(yīng)：過甲酸氧化反應(yīng)被用來轉(zhuǎn)化半胱氨酸和胱氨酸成為半胱磺酸再進(jìn)行測定。缺點：會影響其他氨基酸特別是甲硫氨酸會轉(zhuǎn)變成甲硫氨酸砜，酪氨酸會降解。必須準(zhǔn)備能分析兩次的樣品量．一次提供半胱氨酸數(shù)據(jù)，另一次則提供其他氨基酸的組成數(shù)據(jù)。第29頁,共130頁，2024年2月25日，星期天三、衍生方法及原理衍生是將氨基酸衍生為有利于測定或分離的化合物。大多數(shù)氨基酸不含有芳香環(huán)等生色團(tuán)，無法直接用紫外法檢測，需要先將氨基酸衍生為具有較強(qiáng)紫外或熒光吸收的衍生物。從衍生角度看，氨基酸分析可以分為柱后反應(yīng)法和柱前衍生法兩大類。第30頁,共130頁，2024年2月25日，星期天柱后反應(yīng)法將游離氨基酸經(jīng)過色譜柱分離后，各種氨基酸再與顯色劑(茚三酮、熒光胺、鄰苯二甲醛)作用。優(yōu)點：比較穩(wěn)定，對樣品預(yù)處理要求低，容易定量和自動化操作。缺點：檢測靈敏度不高，分析時間長(蛋白質(zhì)水解液需1h而某些生理樣品則需4h以上)。第31頁,共130頁，2024年2月25日，星期天柱前衍生法將氨基酸和化學(xué)偶聯(lián)試劑先反應(yīng)生成氨基酸的衍生物，然后再用色譜柱將各種衍生物分離，直接檢測衍生物的光吸收或熒光發(fā)射。優(yōu)點：此法可檢測OPA-（鄰苯二甲醛），PTC-，PTH-，DABS-，Dansyl-和DABTH-氨基酸，分析靈敏度高，可利用HPLC進(jìn)行氨基酸分析。缺點：有的衍生物不穩(wěn)定，衍生試劑可能干擾氨基酸檢測。第32頁,共130頁，2024年2月25日，星期天柱后反應(yīng)法VS柱前衍生法第33頁,共130頁，2024年2月25日，星期天幾種常見的氨基酸分析方法：1、茚三酮反應(yīng)2、熒光胺法3、鄰苯二甲醛(OPA)法4、PTC-AA分析法5、Dansyl-Cl（DNS-Cl）法6、磺酰氯二甲胺偶氮苯（Dabsyl-Cl）法第34頁,共130頁，2024年2月25日，星期天1、茚三酮反應(yīng)α-氨基酸與水合茚三酮一起在水溶液中加熱，除脯氨酸和羥脯氨酸產(chǎn)生黃色物質(zhì)，其它氨基酸都產(chǎn)生藍(lán)紫色物質(zhì)。此反應(yīng)十分靈敏，根據(jù)反應(yīng)所生成的藍(lán)紫色的深淺，在570nm波長下進(jìn)行比色就可測定樣品中氨基酸的含量。第35頁,共130頁，2024年2月25日，星期天2、柱后熒光胺法熒光胺能在室溫下迅速和一級胺發(fā)生反應(yīng)，其熒光產(chǎn)物的激發(fā)波長390nm，發(fā)射波長475nm。熒光胺與氨反應(yīng)的靈敏度比茚三酮與氨反應(yīng)的靈敏度大約提高了3個數(shù)量級。第36頁,共130頁，2024年2月25日，星期天3、鄰苯二甲醛(OPA)法OPA最早是被作為柱后衍生試劑而引進(jìn)的，后來也逐漸應(yīng)用于柱前反應(yīng)中。OPA能在還原劑巰基乙醇存在下和一級胺產(chǎn)生具有很強(qiáng)熒光的異吲哚衍生物，該反應(yīng)在室溫下1min即可完成。第37頁,共130頁，2024年2月25日，星期天4、PTC-AA分析法屬柱前衍生法，源于Edman降解法測定蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)。異硫氰酸苯酯(PITC)能在堿性條件下和氨基酸反應(yīng)，生成苯氨基硫甲酰（PTC）-AA，能在254nm檢出。此法分析靈敏度和熒光胺、OPA的熒光法相同。第38頁,共130頁，2024年2月25日，星期天5、Dansyl-Cl（DNS-Cl）法熒光試劑二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）能與所有氨基酸柱前反應(yīng)形成高穩(wěn)定性的帶有熒光的DNS-氨基酸。但反應(yīng)耗時。第39頁,共130頁，2024年2月25日，星期天6、磺酰氯二甲胺偶氮苯（Dabsyl-Cl）法

靈敏度是Dansyl-Cl法的1/5，反應(yīng)產(chǎn)生有色衍生物，能方便地在254nm和425nm處用紫外檢測。有報道用DABITC代替Dabsyl-Cl，反應(yīng)產(chǎn)生DABTH-AA，在酸性環(huán)境中顯紅色，易在254nm，269nm，436nm檢測。第40頁,共130頁，2024年2月25日，星期天第41頁,共130頁，2024年2月25日，星期天四、氨基酸定性和定量分析

氨基酸的定性和定量分析一般采用紙層析、薄層層析、離子交換柱層析等方法。采用HPLC儀和氨基酸自動分析儀更好。隨著儀器的不斷改進(jìn)，一個樣品的測定僅需20min即可完成。第42頁,共130頁，2024年2月25日，星期天單向紙層析第43頁,共130頁，2024年2月25日，星期天雙向紙層析第44頁,共130頁，2024年2月25日，星期天薄層層析第45頁,共130頁，2024年2月25日，星期天離子交換層析第46頁,共130頁，2024年2月25日，星期天高效液相色譜（highperformanceliquidchromatography，HPLC）第47頁,共130頁，2024年2月25日，星期天

蛋白質(zhì)中氨基酸的組成一般用每摩爾蛋白質(zhì)中氨基酸殘基的摩爾數(shù)表示，或每100g蛋白質(zhì)中含氨基酸的克數(shù)表示。所以只有知道蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量，才能推出它的氨基酸組成。第48頁,共130頁，2024年2月25日，星期天例：血小板衍生生長因子的氨基酸組成第49頁,共130頁，2024年2月25日，星期天五、測定氨基酸組成的實驗步驟

目前各大公司如Beckman，HewlettPackard，PerkinE1mer，Waters等都有各自的自動進(jìn)樣、氨基酸分析和定量報告聯(lián)為一體的商品化氨基酸自動分析儀出售，下面介紹幾種常規(guī)實驗室測定氨基酸組成的方法。第50頁,共130頁，2024年2月25日，星期天1、鄰苯二甲醛(OPA)法實驗操作：稱取5mgOPA溶于0.1m1甲醇中，加入50ul巰基乙醇，用0.2mol／LpH9.5的硼酸緩沖液稀釋至1ml。通氮氣并避光保存，每隔兩天加入5ul巰基乙醇以維持其強(qiáng)度，此OPA反應(yīng)試劑能用2~3周。取10u1標(biāo)準(zhǔn)氨基酸混合液(50~100pmol)或樣品水解液，加10ulpH9.5的硼酸緩沖液(內(nèi)含2％SDS和100pmolα-氨基丁酸)，然后加入10u1OPA試劑，混合均勻，反應(yīng)1min后再加入20ul0.1mol/L的KH2PO4中止反應(yīng)，并立即取20ul注入RP-HPLC柱進(jìn)行分析。

第51頁,共130頁，2024年2月25日，星期天儀器為Beckman344HPLC儀，反相柱RP-18(250mm×4.6mm)，熒光檢測器。流動相：A50mmol/L乙酸緩沖液pH6.8:甲醇:THF=80:19:1B50mmol/L乙酸緩沖液pH6.8:甲醇＝80:20梯度條件是：5min，10％B;10min，15％B,20min，10％B；25min，15％B；

35min，50％B；50min，90％B;55min，100％B。

第52頁,共130頁，2024年2月25日，星期天第53頁,共130頁，2024年2月25日，星期天

用乙醇代替劇毒的乙腈或甲醇作為有機(jī)相來定量分析氨基酸，靈敏度可達(dá)10pmol。第54頁,共130頁，2024年2月25日，星期天2、PTC-AA實驗操作：氨基酸或樣品在Eppendorf管中真空干燥后溶解在50ul偶聯(lián)試劑(乙醇:三乙胺:水＝7:1:1)中。此溶液在旋轉(zhuǎn)真空干燥后再次溶解于50ul偶聯(lián)試劑中，然后加入2ulPITC(異硫氰酸苯酯)，反應(yīng)混合物在250C下保溫15min，再次旋轉(zhuǎn)真空干燥，真空度(1.3~13Pa)。如此生成的PTC-AA溶解在適量流動相A中，取一部分上柱定量分析。第55頁,共130頁，2024年2月25日，星期天儀器為BeckmanGoldSystemHPLC儀，反相柱RP-18(250mm×4.6mm)或PTH-柱，254nm檢測。流動相：

A50mmol/L乙酸鈉，pH6.8B50mmo1／L乙酸鈉，pH6.8:乙腈＝50:50HPLC柱采用水浴夾套40℃恒溫，并用5％流動相B平衡。梯度條件是：0min,5%B,5min,5％-15％B,10min,15％B；30min,15％~60％B,40min,60~5％B流速是1ml／min。第56頁,共130頁，2024年2月25日，星期天第57頁,共130頁，2024年2月25日，星期天3、茚三酮法實驗操作：水解后氨基酸樣品溶解于Na-S樣品稀釋液中100u1上樣分析，實際進(jìn)樣量50ul(100pmol~5nmol，均呈線性)。第58頁,共130頁，2024年2月25日，星期天儀器：Beckman6300氨基酸分析儀。流動相：

Na-E0.0min溫度：0.0min48℃Na-D27.80min11.8min65℃Na-F39min32.5min77℃Na-R76.00min50min48℃Na-E77.00-90min流速：緩沖液14ml/h

茚三酮7ml/h第59頁,共130頁，2024年2月25日，星期天第60頁,共130頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)

蛋白質(zhì)的末端測定第61頁,共130頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)的末端分析的目的:確定其氨基末端殘基及羧基末端殘基了解蛋白質(zhì)分子中肽鏈的組成情況。例如，牛胰島素單體有2個N-末端和2個C-末端，是由2條肽鏈通過二硫鍵相連而成；血紅蛋白分子有4個N-末端和4個C-末端，為4個亞基通過次級鍵組成的分子。第62頁,共130頁，2024年2月25日，星期天

末端分析通常采用專一性化學(xué)試劑與末端氨基或羧基反應(yīng)，然后分解出被作用的末端氨基酸加以測定。由于與羧基反應(yīng)的活化能相當(dāng)高，所以用于與羧基反應(yīng)的專一性試劑比較少，而N端測定的方法較多。氨肽酶及羧肽酶等外切酶也常有應(yīng)用。下面介紹常用的N-末端和C-末端測定的方法，以及封閉N-末端的測定。第63頁,共130頁，2024年2月25日，星期天二、C-末端的測定三、封閉N-末端的測定第二節(jié)蛋白質(zhì)的末端測定一、N-末端的測定第64頁,共130頁，2024年2月25日，星期天一、N-末端的測定

N末端測定方法比C末端更加成熟、可靠和準(zhǔn)確，主要的方法有：1、二硝基氟苯法（DNFB法、Sanger法）2、二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl法）3、異硫氰酸苯酯法（PITC法）4、DABITC法5、氨肽酶法第65頁,共130頁，2024年2月25日，星期天1、二硝基氟苯法（DNFB法、Sanger法）二硝基氟苯在弱堿性條件下，與肽鏈的N端氨基作用，形成二硝基苯基肽鏈（DNP-肽），經(jīng)酸水解后，N端殘基成為二硝基苯基（DNP）-氨基酸，可用有機(jī)溶劑（如乙醚）抽提，再進(jìn)行紙層析或薄層層析后，根據(jù)層析斑點的位置作定性鑒定。第66頁,共130頁，2024年2月25日，星期天

FDNB不僅與N-末端的α-氨基起反應(yīng)，也與側(cè)鏈上的ε-氨基、巰基、酚羥基和咪唑基反應(yīng)，但水解產(chǎn)物極性較強(qiáng)，不被乙醚抽提，而不干擾末端的測定。當(dāng)N-端殘基為脯氨酸或羥脯氨酸時，因DNP-脯氨酸或DNP-羥脯氨酸在鹽酸水解條件下極不穩(wěn)定，如DNP-脯氨酸易分解成脯氨酸以及δ-氯-α-DNP-氨基戊酸和α-氯-δ-DNP氨基戊酸，所以回收率甚低，不能進(jìn)行測定。

第67頁,共130頁，2024年2月25日，星期天2、二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl法）熒光劑DNS-Cl可與肽鏈N端氨基反應(yīng)生成DNS-肽，經(jīng)酸水解，N-末端殘基形成DNS-氨基酸，用乙酸乙酯抽提，然后用層析法鑒定。DNS-氨基酸于360nm或280nm處產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光，根據(jù)熒光點位置確定N端氨基酸。第68頁,共130頁，2024年2月25日，星期天

DNS-脯氨酸經(jīng)6MHCl于110℃水解過夜有70%被破壞。色氨酸及其DNS衍生物在鹽酸水解時完全被破壞，可改用巰基乙烷磺酸在真空下水解，并用乙酸乙酯抽提非極性得DNS-氨基酸加以鑒定。第69頁,共130頁，2024年2月25日，星期天賴氨酸的ε-氨基、半胱氨酸的巰基、組氨酸的咪唑基以及酪氨酸的羥基也能與DNS-Cl進(jìn)行反應(yīng)。但半胱氨酸和組氨酸側(cè)鏈衍生物在酸水解時并不穩(wěn)定。當(dāng)N-末端為組氨酸、精氨酸或半胱氨酸（S-羧甲基半胱氨酸形式或磺酸形式）時，對其測定也受到一定限制。當(dāng)N-末端氨基酸為谷氨酸或谷氨酰胺、天冬氨酸或天冬酰胺時，因有高溫水解過程，對它們不能區(qū)別。第70頁,共130頁，2024年2月25日，星期天3、異硫氰酸苯酯法在弱堿中，異硫氰酸苯酯（PITC）與N端氨基偶聯(lián)生成苯基硫甲酰衍生物（PTC-肽）。在酸性溶液中，PTC-肽經(jīng)環(huán)化裂解生成PTC-氨基酸和N端少個氨基酸的剩余多肽。由于PTC-氨基酸不穩(wěn)定，很快轉(zhuǎn)化成苯基乙內(nèi)酰硫脲氨基酸（PTH-氨基酸）。生成PTH-氨基酸非常穩(wěn)定，在268nm處有強(qiáng)吸收峰。第71頁,共130頁，2024年2月25日，星期天

噻咪啉酮衍生物經(jīng)氯乙烯抽提后，留下的肽鏈再可作下一次的循環(huán)，分析次一個氨基酸殘基。因而此法也稱為Edman順序降解，可用于蛋白質(zhì)或多肽的N端順序測定，一般可測定末端30個左右的殘基，是制造氨基酸順序分析儀的理論基礎(chǔ)。

第72頁,共130頁，2024年2月25日，星期天4、DABITC法

DABITC（4-N,N-對甲氨基偶氮苯-4’-異硫氰酸酯）能與N端氨基反應(yīng)生成DABTH-氨基酸，經(jīng)層析分離后，用鹽酸氣熏即可出現(xiàn)紅色斑點，很容易鑒定。第73頁,共130頁，2024年2月25日，星期天5、氨肽酶法氨肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的N-端逐個的向里水解。根據(jù)不同的反應(yīng)時間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，按反應(yīng)時間和氨基酸殘基釋放量作動力學(xué)曲線，從而知道蛋白質(zhì)的N-末端殘基順序。但由于酶的特異性和對各種氨基酸水解速度不用，結(jié)果往往不易判斷，在實際應(yīng)用中容易導(dǎo)致錯誤結(jié)論。第74頁,共130頁，2024年2月25日，星期天二、C末端的測定C末端測定方法較少，而且較N末端分析誤差大。可采用的方法有：1、羧肽酶法2、硼氫化鋰法（LiBH4法，還原法）3、肼解法第75頁,共130頁，2024年2月25日，星期天1、羧肽酶法羧肽酶是一種肽鏈外切酶，能從多肽鏈的C端逐個的水解氨基酸。根據(jù)不同的反應(yīng)時間測出酶水解所釋放的氨基酸種類和數(shù)量，從而知道蛋白質(zhì)的C末端殘基順序。實際應(yīng)用時，由于羧肽酶對不同的C末端氨基酸作用的速度不同，而且反應(yīng)是連續(xù)的，不能停在某一步上，因此給正確判斷氨基酸的順序造成了一定的困難。第76頁,共130頁，2024年2月25日，星期天4種常用羧肽酶：羧肽酶來源專一性CpA胰臟能釋放除pro、Arg和Lys以外的所有C端氨基酸CpB胰臟主要水解C端為Arg或Lys的肽鍵CpC植物或微生物相當(dāng)廣泛，幾乎能釋放C端的所有氨基酸CpY面包酵母可釋放C端所有氨基酸第77頁,共130頁，2024年2月25日，星期天2、硼氫化鋰法（LiBH4法，還原法）

硼氫化鋰可與C末端氨基反應(yīng)生成相應(yīng)的α-氨基醇，水解后抽提氨基醇，可用層析法分離、鑒定。第78頁,共130頁，2024年2月25日，星期天3、肼解法當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)和無水肼在100℃反應(yīng)5～10h，肼可斷裂所有的肽鍵，使所有氨基酸殘基形成肼的衍生物——氨基酸酰肼，可與苯甲醛作用形成不溶的二亞芐基衍生物而除去，唯有C末端氨基酸以游離的形式存在于上清液中。第79頁,共130頁，2024年2月25日，星期天

肼解法不適宜于C端為胱氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺的測定。肽鏈中的丙氨酸、絲氨酸以及甘氨酸殘基形成的酰肼化合物不穩(wěn)定，在水溶液中容易轉(zhuǎn)化為原來的氨基酸而干擾結(jié)果。第80頁,共130頁，2024年2月25日，星期天三、封閉N-末端的測定

有些蛋白質(zhì)的肽鏈沒有游離的氨基端，較多的情況是氨基端因受到乙酰化或谷氨酸殘基自身環(huán)化為焦谷氨酸殘基而被封閉。此時我們可采用相應(yīng)方法對封閉N-末端進(jìn)行測定。第81頁,共130頁，2024年2月25日，星期天1．乙?；疦-末端肼解條件下，N端的乙?；纬梢阴ｋ隆Ｈ缓?，使其與DNS-Cl作用，形成N-乙酰-N’-丹磺酰肼，經(jīng)乙醚抽提出來后，可應(yīng)用薄層層析等方法鑒定。由于乙?；c氨基形成的酰胺鍵比較穩(wěn)定，在部分酸水解條件（如pH2，105℃90min）下有可能產(chǎn)生乙?；被?，與已知標(biāo)準(zhǔn)化合物對照，也可以應(yīng)用層析等方法對其加以鑒定。第82頁,共130頁，2024年2月25日，星期天2．吡咯烷酮羧酸末端

牛肝焦谷氨酸氨肽酶能水解出末端的吡咯烷酮羧酸，從而使剩下的有自由氨基端的肽鏈可以用Edman方法遞減分析。第83頁,共130頁，2024年2月25日，星期天

3．甲酰基末端

甲?；Ｒ约柞＜琢虬彼岬男问酱嬖谟谠梭w系的初生肽鏈的端部。甲酰氨鍵比起一般肽鍵要不穩(wěn)定得多，所以弱酸條件（如0.5MHCl的甲醇溶液）下在室溫處理48小時，可以使甲?；庀聛怼Ｈ缓笤倏煞抡找阴；臏y定方法加以鑒定。第84頁,共130頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)

亞基拆離、肽鏈降解和肽段的分離第85頁,共130頁，2024年2月25日，星期天

從蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定和SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果，可以知道蛋白質(zhì)是否由多亞基組成。若末端分析只有單一的結(jié)果，說明分子由相同亞基組成，無需將亞基拆開、分離。反之，分子若有兩種以上不同亞基組成，首先要將不同亞基之間的連接拆開，并進(jìn)行分離提純。提純后的亞基肽鏈一般都是相對分子質(zhì)量也比較大，需要將大的肽鏈降解成小的肽段，并將肽段提純，然后才能正式開始順序測定工作。

第86頁,共130頁，2024年2月25日，星期天二、肽鏈的部分降解三、肽段的分離提純第三節(jié)亞基拆離、肽鏈降解和肽段的分離一、亞基拆離和二硫鍵的斷裂第87頁,共130頁，2024年2月25日，星期天一、亞基拆離和二硫鍵斷裂

蛋白質(zhì)由一條以上的肽鏈組成時，肽鏈間的結(jié)合可能是靠非共價鍵結(jié)合，也可能是靠共價鍵結(jié)合。在進(jìn)行肽鏈順序分析時，首先要將它們分離開來。若多亞基間以非共價鍵連接，在溫和條件下即可以拆離亞基，如改變?nèi)芤簆H，將pH降低到3～4或升高到9～10；或者加入變性劑，如8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍等。例如，血紅蛋白經(jīng)8mol/L脲處理后，α及β鏈可以得到分離；核酮糖二磷酸羧化酶在0.2mol/L巰基乙醇及1%SDS溶液中保溫1小時，大小亞基便相互分開。拆離后的亞基可以用凝膠過濾方法進(jìn)行分離。第88頁,共130頁，2024年2月25日，星期天拆分靠共價鍵結(jié)合的因比較牢固須用特殊的化學(xué)作用使其破壞。最常見的是半胱氨酸殘基經(jīng)氧化作用而形成胱氨酸殘基，即二硫鍵結(jié)構(gòu)。第89頁,共130頁，2024年2月25日，星期天1．過甲酸氧化法優(yōu)點：能將巰基（-SH）和二硫鍵（-S-S-同時氧化成磺基，生成的磺酸基很穩(wěn)定，肽鏈不再重新形成二硫鍵，便于肽鏈分離。缺點：氧化過程中，同時將蛋磺酸的側(cè)鏈氧化成亞砜，色氨酸的側(cè)鏈也遭破壞。第90頁,共130頁，2024年2月25日，星期天2．還原法一般可使用過量巰基化合物，如β-巰基乙醇。在室溫或pH8～9條件下放置數(shù)小時，即可使二硫鍵還原成巰基。加入8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍使蛋白質(zhì)變性。在這種情況下，還原劑才能有效地作用于暴露的二硫鍵。二硫鍵還原后，需要用巰基保護(hù)試劑，如碘乙酸，以防其重新被氧化。第91頁,共130頁，2024年2月25日，星期天二、肽鏈的部分降解

由于氨基酸順序測定多數(shù)采用Edman降解法，它一次能分析肽鏈長度約10余個氨基酸殘基，所以分離得到的單鏈如果太長，須將長的肽鏈斷裂成易分析的較短肽鏈。肽鏈部分降解的方法要求選擇性強(qiáng)、裂解點少、反應(yīng)率高，一般采用化學(xué)裂解和酶解法兩種。第92頁,共130頁，2024年2月25日，星期天1．化學(xué)裂解法

溴化氰（CNBr）與肽鏈中蛋氨酸側(cè)鏈的硫醚基發(fā)生反應(yīng)，生成環(huán)化的溴化亞氨內(nèi)酯，此產(chǎn)物水解后，產(chǎn)生高絲氨酸內(nèi)酯，使蛋氨酸羧基端的肽鍵斷裂。這一方法的優(yōu)點是產(chǎn)率高（可達(dá)85%）、專一性強(qiáng)，故實際應(yīng)用較多。第93頁,共130頁，2024年2月25日，星期天2．酶解法酶解法相對化學(xué)裂解法而言，有許多優(yōu)點，如專一性強(qiáng)、裂解條件溫和、副反應(yīng)少等，再則蛋白水解酶對肽鏈的水解率也比較高，而且不同的蛋白水解酶對不同氨基酸形成的肽鍵水解專一性不同。因此，酶解法被廣泛使用。第94頁,共130頁，2024年2月25日，星期天幾種常用蛋白水解酶的作用位點第95頁,共130頁，2024年2月25日，星期天3．羥胺裂解法羥胺（NH2OH）在堿性條件下（pH9.0）能專一性裂解-Asn-Gly-間的肽鍵，也能部分裂解-Asn-Leu-或-Asn-Ala-間的肽鍵；在酸性條件可以斷裂-Asp-Pro-間的肽鍵，產(chǎn)率可達(dá)80%。

第96頁,共130頁，2024年2月25日，星期天4．部分酸水解一般認(rèn)為酸水解沒有什么專一性而被忽視，后來發(fā)現(xiàn)部分酸水解還是有一定的專一性。在稀酸的條件下，也即在高濃度胍的甲酸中（pH2.5），可裂解-Asp-Pro-間的肽鍵，產(chǎn)率高達(dá)80%～90%。在濃酸條件下，含羥基氨基酸氨基端肽鍵容易斷裂。但是終究部分酸水解的專一性差，副反應(yīng)多，此法比較難掌握。第97頁,共130頁，2024年2月25日，星期天三、肽段的分離提純

肽鏈經(jīng)部分裂解得到肽片段必須分離提純，才能進(jìn)一步測定其氨基酸順序。先采用凝膠過濾，得到不同相對分子質(zhì)量的肽片段組分，同時也脫去了樣品中的鹽類。然后，肽片段組分可用離子交換層析進(jìn)一步提純，也可應(yīng)用雙相高壓紙電泳和層析相結(jié)合的方法，HPLC或FPLC具有更高的分辨率。第98頁,共130頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)

肽段的氨基酸順序測定第99頁,共130頁，2024年2月25日，星期天目前，進(jìn)行蛋白質(zhì)序列測定有二個關(guān)鍵步驟，即：①氨基酸殘基一個一個依次從蛋白質(zhì)和多肽的末端切割下來。可采用化學(xué)法或酶法進(jìn)行裂解?？梢詮牡鞍踪|(zhì)和多肽的N端進(jìn)行裂解，也可以從C端進(jìn)行分析。②正確鑒定每次切割下來的氨基酸殘基。利用高效液相色譜，對帶有生色基團(tuán)的氨基酸殘基進(jìn)行分離分析。第100頁,共130頁，2024年2月25日，星期天二、N端蛋白質(zhì)序列儀三、影響N端Edman反應(yīng)裂解率的因素第四節(jié)肽段的氨基酸順序測定四、N端測序前樣品處理一、N端測序原理五、C端測序原理六、C端蛋白質(zhì)序列儀七、C端測序樣品前處理八、影響C端測序反應(yīng)產(chǎn)率的因素第101頁,共130頁，2024年2月25日，星期天一、N端測序原理

至今應(yīng)用最廣的N端順序測定法大多仍以Edman降解原理為基礎(chǔ)。第102頁,共130頁，2024年2月25日，星期天

偶聯(lián)：蛋白質(zhì)和多肽的自由α-氨基經(jīng)與異硫氰酸苯酯(PITC)試劑偶聯(lián)，與其緊挨的第二個殘基的鍵合力大大減弱，很容易斷裂。

裂解：在無水條件下酸裂解，僅僅切下反應(yīng)的那個殘基，得到ATZ-氨基酸。緊挨的第二個氨基酸殘基暴露出自由的α-氨基，又可與PITC進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)。

轉(zhuǎn)化：ATZ-氨基酸不穩(wěn)定，三氟乙酸水溶液（25%）條件下可轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的PTH-氨基酸。

PTH-氨基酸的鑒定：可以通過薄層層析、氣相色譜、高效液相色譜及質(zhì)譜等各種手段進(jìn)行分析。第103頁,共130頁，2024年2月25日，星期天二、N端蛋白質(zhì)序列儀自70年代初自動序列儀誕生以來，經(jīng)過了一系列更新?lián)Q代，儀器日趨靈敏、快速，下面就其中幾種代表性的儀器作一簡單介紹。第104頁,共130頁，2024年2月25日，星期天1．液相旋轉(zhuǎn)杯序列儀這是最初的自動化儀器。整個儀器的“核心”部分是一個反應(yīng)杯，它由一個馬達(dá)帶動并有調(diào)速控制。蛋白質(zhì)或多肽樣品經(jīng)溶解后，通過一根導(dǎo)管注入反應(yīng)杯中，樣品隨著旋轉(zhuǎn)的離心力被均勻地涂在杯壁上，形成一層薄膜，其厚薄可由轉(zhuǎn)速控制。反應(yīng)的試劑和溶劑分別通過導(dǎo)管進(jìn)入反應(yīng)杯，與杯內(nèi)薄層上的樣品的N端自由氨基進(jìn)行Edman反應(yīng)；降解下來的ATZ氨基酸衍生物通過另一導(dǎo)管引出并收集，再將ATZ氨基酸轉(zhuǎn)換成PTH氨基酸后進(jìn)行鑒定，依次循環(huán)分析。此儀器由于消耗的樣品量多，目前在蛋白質(zhì)化學(xué)實驗室已很少作用。第105頁,共130頁，2024年2月25日，星期天2．固相序列分析儀由于一些小肽或疏水性多肽，不易吸附在一般支持物上(如旋轉(zhuǎn)杯)，只得將它們共價固定在惰性載體后進(jìn)行Edman化學(xué)降解反應(yīng)。固相測序的優(yōu)點是樣品共價結(jié)合后，不會在有機(jī)溶劑洗滌，抽提等過程中丟失，因而可以增加循環(huán)次數(shù)。其缺點是共價結(jié)合不外乎通過氨基或羧基與載體上的活性基團(tuán)作用，蛋白質(zhì)和多肽中的谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸等含有除α-氨基或α-羧基以外氨基或羧基的氨基酸殘基將結(jié)合在載體上，不能正確確定。第106頁,共130頁，2024年2月25日，星期天3．氣相序列儀

用彈筒型玻璃反應(yīng)室(內(nèi)部體積約0.05ml）代替了液相序列儀中的旋轉(zhuǎn)玻璃杯，用一種四級銨鹽聚合物“polybrene”固定樣品，Edamn降解反應(yīng)中有的試劑如三甲胺以氣體方式輸送，其它試劑以流動或液相脈沖方式輸送。

優(yōu)點：靈敏度高，耗費(fèi)樣品量少，通常僅需10~100pmol；試劑和溶劑消耗少，大約是液相序列儀的1／10，降低了費(fèi)用；縮短了每步降解循環(huán)時間，提高了分析效率。第107頁,共130頁，2024年2月25日，星期天三、影響N端Edman反應(yīng)裂解率的因素

在測序中往往可以發(fā)現(xiàn)，即使N端很均一的蛋白質(zhì)(第一個循環(huán)出現(xiàn)單個氨基酸殘基)，經(jīng)過十幾個循環(huán)后背景明顯不及第一個殘基清晰。這是由于Edman反應(yīng)是一個化學(xué)過程，在其偶聯(lián)、裂解、轉(zhuǎn)化等步驟都有可能發(fā)生一些副反應(yīng)，從而影響最終裂解效率。第108頁,共130頁，2024年2月25日，星期天例如三氟乙酸除起裂解作用外，可能與絲氨酸Ser和蘇氨酸Thr上的羥基反應(yīng)，繼而部分封閉Ser和Thr的N端α-氨基，導(dǎo)致Ser和Thr時產(chǎn)率突然降低。絲氨酸和蘇氨酸的PTH-衍生物也會部分轉(zhuǎn)化成其他產(chǎn)物，造成產(chǎn)率的降低。偶聯(lián)試劑PITC本身也將發(fā)生副反應(yīng)，形成一些“雜質(zhì)”。第109頁,共130頁，2024年2月25日，星期天四、N端測序前樣品處理1.純度鑒定宜采用多種互補(bǔ)有效的手段鑒定樣品的純度，如SDS、反相HPLC、毛細(xì)管電泳、陰離子或陽離子的FPLC等。

2.脫鹽可采用多種有效的脫鹽方法如反相HPLC、凝膠過濾、透析、超濾等，但需注意在進(jìn)行脫鹽過程中除需考慮是否除鹽完全外，所用試劑、儀器乃至操作規(guī)范也必須是測序級的，應(yīng)盡量避免引入新的雜質(zhì)。3.疏基修飾4.去除N端封閉的基團(tuán)第110頁,共130頁，2024年2月25日，星期天五、C端測序原理

雖然建立在Edman化學(xué)法上的自動化N端測序技術(shù)日趨成熟，但仍有不少問題需借助C端序列分析來解決。C端測序尤其適合于基因重組蛋白是否正確表達(dá)的鑒定和大規(guī)模生產(chǎn)時的質(zhì)量控制、N端封閉蛋白的分析以及DNA探針的設(shè)計。第111頁,共130頁，2024年2月25日，星期天

原理

基于與N端Edman降解類似的原理，C端分析采用化學(xué)試劑與蛋白質(zhì)和多肽的α-羧基反應(yīng)，反應(yīng)后的C末端衍生物被切割下來，通過HPLC系統(tǒng)進(jìn)行分離分析。一個完整的C端序列分析包括以下幾個步驟。第112頁,共130頁，2024年2月25日，星期天(1)活化蛋白質(zhì)和多肽C端的自由羧基與乙酸酐反應(yīng)生成混合酸酐，并進(jìn)一步環(huán)化成聚噁唑酮，而側(cè)鏈上的羧基形成的混合酸酐則難以成環(huán)。C末端的聚噁唑酮在四丁基銨硫氰酸鹽的作用下，轉(zhuǎn)化為乙內(nèi)酰硫脲(TH)。第113頁,共130頁，2024年2月25日，星期天(2)酰胺化保護(hù)側(cè)鏈羧基側(cè)鏈羧基形成混合酸酐后，與哌叮硫氰酸鹽（piperidinethiocyanate）進(jìn)一步作用形成酰胺，以保護(hù)側(cè)鏈。第114頁,共130頁，2024年2月25日，星期天(3)烷基化

由于C末端環(huán)化成的TH衍生物較為穩(wěn)定而不易被切割，因此產(chǎn)率不高。用Bromomethylna－phthylene選擇性地烷基化修飾硫原子，形成烷基化-TH(ATH)衍生物，裂解產(chǎn)率將大大提高.。第115頁,共130頁，2024年2月25日，星期天

(4)修飾Thr和Ser的羥基

蛋白質(zhì)和多肽中的羥基會干擾測序，因此需要修飾。在活化過程中，乙酸酐也會與羥基反應(yīng)將其乙?；?，但反應(yīng)不完全，在N-甲基咪唑（N-methlimidazole，NMI）和乙酸酐的共同作用下，Thr和Ser上的羥基基本被乙?；?。第116頁,共130頁，2024年2月25日，星期天

(5)裂解和衍生

C末端的ATH衍生物在酸性條件下與硫氰酸鹽反應(yīng)而被裂解生成ATH-氨基酸，新的C末端自動形成TH，而不必重新活化。因此，整個測序過程只需在開始時對C端進(jìn)行一次性活化，并修飾Asp和Glu側(cè)鏈羧基，以及Thr和Ser的羥基。第117頁,共130頁，2024年2月25日，星期天六、C端蛋白質(zhì)序列儀C端序列儀一般由N端序列儀改裝而成，其基本結(jié)構(gòu)與后者相似，兩者的不同之處主要在于:(1)反應(yīng)所用的試劑不同，因此兩者不可兼容，否則極易堵塞管道。(2)在C端序列儀中，所有的化學(xué)反應(yīng)均在彈筒型反應(yīng)室中進(jìn)行，切割下來的ATH-AA僅在轉(zhuǎn)化腔內(nèi)干燥和溶解后即進(jìn)入HPLC系統(tǒng)分離分析。而在N端測序儀中，ATZ-AA需在轉(zhuǎn)化腔中轉(zhuǎn)化為PTH-AA。第118頁,共130頁，2024年2月25日，星期天第119頁,共130頁，2024年2月25日，星期