殼聚糖的制備

殼聚糖的制備TingBaowasrevisedonJanuary6,20021殼聚糖的制備甲殼素是許多甲殼類動物（如蝦、蟹）及昆蟲等外殼的重要組成成分,同時也存在于菌類的細(xì)胞壁中，還可來源于有機(jī)酸類，抗生素與酶釀造副產(chǎn)物。甲殼素是一種十分豐富的天然資源，在自然界蘊(yùn)藏量僅次于纖維素。它不溶于水和酸性介質(zhì)，甲殼素脫乙酰后形成殼聚糖（CTS）。其溶解性較甲殼素大。它是生物合成的天然高分子,又可生物降解,安全無毒,有良好的生物相容性且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,具有許多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。殼聚糖廣泛應(yīng)用于紡織、印染、皮革、涂料、卷煙、塑料、化妝品食品醫(yī)藥保健彩色膠卷造紙、生物工程、農(nóng)業(yè)植保、污水處理等。殼聚糖的脫乙酰度是一項(xiàng)極為重要的技術(shù)指標(biāo)之一殼聚糖的脫乙酰度的高低,直接關(guān)系到它在稀酸中的溶解能力、粘度離子交換能力、絮凝性能和與氨基有關(guān)的化學(xué)反應(yīng)能力,以及許多方面的應(yīng)用。殼聚糖的英文名:chitosan,化學(xué)名:（1,4）-二氨基-2-脫氧-B-D-葡聚糖,其它中英文名尚有Deacetylatedchitin、FlonacN、甲殼胺、可溶性甲殼質(zhì)、脫乙酰甲殼素、脫乙酰幾丁質(zhì)聚氨基葡糖可溶性甲殼素、粘性甲殼素等。殼聚糖的脫乙酰度（DegreeofDeacetylation,縮寫為D1D1）可定義為殼聚糖分子中脫除乙?；奶菤埢鶖?shù)占?xì)ぞ厶欠肿又锌偟奶菤埢鶖?shù)的百數(shù)。脫乙酰度的測定方法很多,如堿量法(包括酸堿滴定法、電位滴定法、氫溴酸鹽法等)、紅外光譜法、折光指數(shù)法、膠體滴定法、熱分析法、氣相色譜法、元素分析法、紫外光譜一階導(dǎo)數(shù)、苦味酸分光光度法等。常用的有酸堿滴定法、紅外光譜法、紫外光譜法、電位滴定法等。一、殼聚糖的制備將蝦殼去腿去雜質(zhì)后,流水沖洗,洗凈殘余的蝦肉,于60℃烘箱中烘干，用研缽磨碎.稱取10g蝦殼3份,于100mL5%HCl中浸泡4h至無氣泡冒出，再補(bǔ)加50mL5%HCl,浸泡2h,除去蝦殼中的鈣質(zhì)和無機(jī)鹽,抽濾用去離子水洗至中性,加100mL10%NaOH于50℃水浴中加熱2h,除去蛋白,過濾,用去離子水80℃水浴中反應(yīng)4h,水洗至中性,抽濾,烘干后得白色粉末狀甲殼素分別為,，2,12g,平均產(chǎn)率為％。二、殼聚糖制備工藝的設(shè)計(jì)甲殼素堿液質(zhì)量和體積比一般選取m甲殼素(g):NaOH(ml)為1：20,堿液濃度在30%以下,脫乙酰反應(yīng)進(jìn)行得非常緩慢,溫度超過120℃時,脫乙酰雖然進(jìn)行得較快,但是因此會造成主鏈的大幅降解，故實(shí)驗(yàn)中采用30%?60%的濃堿，控溫在90?120℃進(jìn)行反應(yīng)。即可的殼聚糖。三、殼聚糖的純化將所得粗品殼聚糖溶于2%HAc水溶液中，配成1.5%~2.0%的殼聚糖醋酸水溶液,濾去不溶雜質(zhì),攪拌下緩慢滴入4%NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH值至8?9,放各洗2次，真空干燥，得殼聚糖純品。四、脫乙酰的測定1.堿量法甲殼質(zhì)脫乙?；笊傻募讱に刂械陌坊视坞x態(tài),屬伯胺,具有陽離子性質(zhì),可與酸定量反應(yīng)生成鹽,且胺基特別穩(wěn)定,即使在50%氫氧化鈉溶液中，在150℃也不會分解,基于上述特性來測定脫乙酰度。準(zhǔn)確稱取0.2g樣品置于250ml三角燒瓶中，加入0.2mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液25ml,攪拌0.5?1h完全溶解，以甲基橙作指示劑,0.2mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定過量的鹽酸至終點(diǎn),另取1份樣品于105烘箱中至恒重,測定樣品含水量。fCi%-CSVS)-0,"二Gf100-W)x0.1001式中：C「鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度；V＞加入鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積；Cr氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度：Vr消耗氫氧化鈉溶液的體積；G-樣品重;W-樣品的水分百分含量；0.016?與1mH-1/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)?shù)陌妨?0.1001-殼聚糖中理論霸基含量這種方法簡單,但由于達(dá)到終點(diǎn)時,殼聚糖析出沉淀,使終點(diǎn)判定容易產(chǎn)生誤差,尤其在樣品摩爾質(zhì)量較大情況下更是如此,從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性差。而且樣品受溶解度影響較大,有時需加熱才能使樣品完全溶解,這樣使鹽酸揮發(fā),測定結(jié)果受到影響。但這種方法不需大型儀器,操作簡便易行,經(jīng)常操作,積累一定操作經(jīng)驗(yàn),會改善重復(fù)性差的缺點(diǎn)。電位滴定法準(zhǔn)確稱取0.2g殼聚糖,溶于25ml0.2mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液回滴過量鹽酸,作pH-VNaOH曲線,用三切線法確定終點(diǎn),按堿量法的公式計(jì)算脫乙酰度。此方法操作簡單,分析速度較快,終點(diǎn)判斷清楚,精確度較高,對具有較高脫乙酰度的樣品來說,應(yīng)是一個較為可供選擇的方法。紫外光譜法其作用的原理是選擇合適的染料使之與殼聚糖作用,在一定波長下測定吸光度,根據(jù)吸光度與濃度的關(guān)系,經(jīng)簡單的數(shù)學(xué)處理得到一標(biāo)準(zhǔn)曲線,利用這一標(biāo)準(zhǔn)曲線,可以測定與此殼聚糖具有同一脫乙酰度的未知?dú)ぞ厶堑暮?。人們對染料的變色作用早?9世紀(jì)就有了認(rèn)識。B.和G.A.F.Roberts［報(bào)道了陰離子染料酸性紅88與殼聚糖的作用。酸性紅88這種帶負(fù)電荷的染料與殼聚糖大分子上質(zhì)子化的氨基以1：1的化學(xué)計(jì)量形成絡(luò)和物，此時酸性紅88的最大吸收波長為505nm,吸光度達(dá)到最低點(diǎn),可以定量利用這一變色作用。本文用酸性紅143,與已知含量殼聚糖作用,測定未知含量殼聚糖。(1)殼聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取0.15048日本產(chǎn)殼聚糖,溶于100ml0.1mol/LHCl,準(zhǔn)確稱取5ml,10ml,15ml,20ml,25ml此溶液，用0.1mol/L的HAC溶液定容至250ml。(2)染料標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：稱取酸性紅0.5g143溶于0.1mol/LHAC溶液中，并稀釋至1000ml。(3)殼聚糖的測定：移取等份染料溶液2ml于50ml容量瓶中,分別從各濃度的殼聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液中準(zhǔn)確移取不同體積的標(biāo)樣。用0.1mol/LHAC稀釋至50ml。以2ml染料，用HAC定容為50ml的溶液為空白，吸收波長為530nm，于Perkin-Elmer紫外分光光度計(jì)測定吸光度，作吸光度對各濃度的殼聚糖標(biāo)樣體積的曲線,分別得到兩條直線,直線交點(diǎn)處所對體積為質(zhì)子化氨基與染料離子等量反應(yīng)所需相應(yīng)殼聚糖標(biāo)樣的體積。圖1酸性紅143吸光度隨殼聚糖濃度變化曲線

殼聚糖標(biāo)樣體積，M曲線；1-150口或冠；2-3GOp^ni;3*450pg/id;4-GOOpg/ml;5-75昨41位(4)數(shù)據(jù)處理:用已知不同量的殼聚糖為橫坐標(biāo),用圖1中直線交叉點(diǎn)處所對應(yīng)的殼聚糖溶液的體積的倒數(shù)為縱坐標(biāo)作圖(見圖2）。殼聚糖溶液濃度，乂⑶川鎮(zhèn)nd圖2殼聚糖標(biāo)準(zhǔn)工作曲線五、分子質(zhì)量的測定目前國內(nèi)外研究降解甲殼素的方法有很多，有酶降解法，化學(xué)降解法，物理降解法等。每種降解方法都有一定的局限性,化學(xué)降解法會對環(huán)境造成污染;酶的價格昂貴,不易得到,且具有選擇性；物理降解法雖然對環(huán)境沒有污染，但降解效率太低。H2O2有很強(qiáng)的氧化性,可以氧化甲殼素主鏈上的殼素氧化降解法制備低分子量的甲殼素。.利用H2O2制備低分子量分布的殼聚糖將蝦皮用HCl浸泡去除碳酸鈣鹽；再用稀堿除去蛋白質(zhì)得甲殼素;然后濃堿在50℃與其反應(yīng),并控制反應(yīng)時間,分別制備出脫乙酰度為85%,93%,99%的殼聚糖，最后用H2O2氧化不同脫乙?；瘹ぞ厶?得到不同低分子量的殼聚糖。2．低聚殼聚糖的制備取樣品按殼聚糖：水二1：30（質(zhì)量：體積）將其分散在水中。在50℃下加熱,用滴液漏斗慢慢滴加一定體積、濃度為30%的H2O2，并不斷攪拌，在30min內(nèi)滴加完畢。反應(yīng)6h后，抽濾得固相產(chǎn)品,水洗,烘干稱重。用粘度法測定相對分子量。.殼聚糖粘度與分子量的關(guān)系低粘度樣品在滴定過程中呈澄清溶液狀態(tài),測定值偏差較小;而粘度較高的樣品,在滴定過程中易出現(xiàn)凝集現(xiàn)象,使測定結(jié)果偏差較大。所以在測定粘度較高的樣品時,樣品量不宜太大,在0.3g左右即可，而且用少量蒸餾水稀釋。以85%脫乙酰度未降解CTS為例，配制不同濃度的85%脫乙酰度的CTS,用烏氏粘度計(jì)測定其粘度，結(jié)果見圖1。0 1 20 1 2先聚精濃度「荷圖1脫乙酰度為85%未降解殼聚糖的濃度與粘度關(guān)系350150S4UI)索由圖1得出n為4022min2查表得85%殼聚糖K為1.424x為Q96,代入：q=得M為4.7xiu\用以上方法，分別得到85%脫乙酰度的分子量有4.7xitf,3.5xio\20xio\L2x10;8太10193%脫乙酰度的有L8箕101L2kjo\8x10=99%脫乙酰度的有8乂10\1測定方法準(zhǔn)確稱取105e烘干至恒重的樣品013~015g殼聚糖樣品,置于250ml三角瓶中,加入011mol/L鹽酸30m,l在20e~25e攪拌至溶解完全（若粘度太大可加適量加蒸餾水稀釋）,加入2~3滴混合指示劑（1%）甲基橙+(1%)苯胺藍(lán)(1B2),用011mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液計(jì)算公式:自由氨基的含量=@100%(cv1-qvj@01oi6自由氨基的含量=@100%1 ri-i d-i脫乙酰度=焉翳@1＜愀式中：G）鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mo]/LC2）氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/LV,）加入的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mlV2）滴定耗用的氫氧化