細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)

關(guān)于細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)目錄基本原理1質(zhì)粒提取擴(kuò)增234常見問題及解決方案5影響轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的因素轉(zhuǎn)染方法第2頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天基本原理1將外源分子如DNA，RNA等導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染——研究?jī)?nèi)容：研究和控制真核細(xì)胞基因功能應(yīng)

用：基因功能、調(diào)控基因表達(dá)、突變分析和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等生物學(xué)試驗(yàn)第3頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體（episome）存在。盡管線性DNA比超螺旋DNA轉(zhuǎn)入量低但整合率高。外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1/104轉(zhuǎn)染細(xì)胞能整合，通常需要通過一些選擇性標(biāo)記，如來氨丙基轉(zhuǎn)移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反復(fù)篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個(gè)宿主細(xì)胞中可存在多個(gè)拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達(dá)，但通常只持續(xù)幾天，多用于啟動(dòng)子和其它調(diào)控元件的分析。一般來說，超螺旋質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率較高，在轉(zhuǎn)染后24-72小時(shí)內(nèi)（依賴于各種不同的構(gòu)建）分析結(jié)果，常常用到一些報(bào)告系統(tǒng)如熒光蛋白，β半乳糖苷酶等來幫助檢測(cè)。第4頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天第5頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理基于電荷吸引原理，先形成脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物，散布在細(xì)胞周圍，然后通過細(xì)胞的內(nèi)吞作用，將目的基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)。第6頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天1.

promega公司

Promega轉(zhuǎn)染試劑產(chǎn)品適合于人HeLa，HepG2，293，K562，Jurkat；猴COS-7，CV-1；小鼠NIH3T3；倉(cāng)鼠BHK，CHO；大鼠PC12；昆蟲S19等等細(xì)胞系的RNAi轉(zhuǎn)染。

2.

Invitrogen公司

Lipofetamine2000，適合于Hela，BHK，HEK，COS-7，PC12，NIH3T3等各種常用細(xì)胞系的RNAi轉(zhuǎn)染。

3.

轉(zhuǎn)染FAQs：轉(zhuǎn)染試劑的選擇脂質(zhì)體復(fù)合物與貼壁細(xì)胞的接觸機(jī)會(huì)比懸浮細(xì)胞高出很多倍，所以，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染時(shí)懸浮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率要明顯低于貼壁細(xì)胞。懸浮細(xì)胞是用的電穿孔法。第7頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天質(zhì)粒提取擴(kuò)增2質(zhì)粒是細(xì)胞內(nèi)的一種環(huán)狀的小分子DNA，是進(jìn)行DNA重組的常用載體。將細(xì)菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，然后從大腸桿菌中收獲大量質(zhì)粒的過程?！獙①|(zhì)粒

DNA

導(dǎo)入細(xì)菌的過程1、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌細(xì)胞在

CaCl

2

低滲溶液中膨脹為球狀（感受態(tài)細(xì)菌的制備，略）。質(zhì)粒

DNA

與

CaCl

2

形成抗

DNase

羥基

-

磷酸鈣復(fù)合物黏附于細(xì)菌表面，經(jīng)

42℃

短時(shí)間熱沖擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收

DNA

復(fù)合物。在豐富培養(yǎng)基上生長(zhǎng)數(shù)小時(shí)后，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增殖。被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中，外源基因得到表達(dá)。BL21(DE3)一般用于外源基因的原核表達(dá)，DH5a，TG1和HB2151一般用于重組質(zhì)粒的克隆和擴(kuò)增TG1長(zhǎng)得慢，菌落較小，轉(zhuǎn)化效率高，用于普通的克隆測(cè)序，BL21(DE3)長(zhǎng)的快，菌落較大，轉(zhuǎn)化效率低點(diǎn)，主要用于原核表達(dá)。第8頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天感受態(tài)細(xì)菌細(xì)胞特點(diǎn)用途TG1長(zhǎng)得慢，菌落較小，轉(zhuǎn)化效率高，用于普通的克隆測(cè)序DH5aE.coliDH5a在使用pUC系列質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化時(shí)，可與載體編碼的β－半乳糖苷酶氨基端實(shí)現(xiàn)α－互補(bǔ)?？捎糜谒{(lán)白斑篩選鑒別重組菌株。常用于分子克隆、質(zhì)粒提取和蛋白質(zhì)表達(dá)。BL21(DE3)該菌株用于高效表達(dá)克隆于含有噬菌體T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體（如pET系列）的基因。T7噬菌體RNA聚合酶位于λ噬菌體DE3區(qū)，該區(qū)整合于BL21的染色體上。該菌適合表達(dá)非毒性蛋白。長(zhǎng)的快，菌落較大，轉(zhuǎn)化效率低點(diǎn)。一般用于外源基因的原核表達(dá)JM109該菌株在使用pUC系列質(zhì)粒載體進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)化或用M13phage載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，由于載體DNA產(chǎn)生的LacZa多肽和JM09編碼的LacZΔM15進(jìn)行α－互補(bǔ)，從而顯示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鑒別重組體菌株分子克隆、質(zhì)粒提取和蛋白質(zhì)表達(dá)。第9頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)菌鋪板：加入抗生素（終濃度是50ug/ml-100ug/ml）挑選菌落：從LB培養(yǎng)基上挑選菌落備用細(xì)菌培養(yǎng)：37攝氏度培養(yǎng)箱中以180rpm搖動(dòng)12~14h，使大腸桿菌繁殖堿裂解抽提：采用細(xì)胞裂解的方式，從含目標(biāo)質(zhì)粒的大腸桿菌菌液中將質(zhì)粒提取出來2、質(zhì)粒的提取擴(kuò)增質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化具體方法省略……NOTE:不同的感受態(tài)細(xì)菌轉(zhuǎn)化效率不同，選擇合適的E.coli1ng的cccDNA就可使50ul的感受態(tài)細(xì)胞飽和，DNA量過多會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化時(shí)為提高轉(zhuǎn)化效率，質(zhì)粒加入E.coli培養(yǎng)1h后可離心棄上清后用剩余的菌液涂布。第10頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天在質(zhì)粒提取過程中，由于機(jī)械力、酸堿度、試劑等的原因，可能使質(zhì)粒DNA鏈發(fā)生斷裂。所以，多數(shù)質(zhì)粒粗提取物中含有三種構(gòu)型的質(zhì)粒：15,000bp10,000bp7,500bp5,000bpErbB2ErbB2ErbB2共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（超螺旋）：質(zhì)粒的兩條鏈沒有斷裂；開環(huán)DNA：質(zhì)粒的一條鏈斷裂；松弛的環(huán)狀分子；線形DNA：質(zhì)粒的兩條鏈均斷裂；線性分子第11頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天Q1：原先測(cè)序鑒定沒有問題的細(xì)菌，37℃搖菌后發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒大小或序列出現(xiàn)異常?這種情況出現(xiàn)的幾率較小，常出現(xiàn)在較大質(zhì)?；虮容^特殊的序列中。解決辦法：降低培養(yǎng)溫度，在20～25℃下培養(yǎng)，或室溫培養(yǎng)可明顯減少發(fā)生概率。使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重組酶，如rec類等，使得質(zhì)粒復(fù)制更加穩(wěn)定。質(zhì)粒抽提有一個(gè)酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH濃度過高造成的常見問題及解決方案第12頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天Q2：未提出質(zhì)?；蛸|(zhì)粒得率較低，如何解決?

大腸桿菌老化，細(xì)菌發(fā)生溶菌，可減少培養(yǎng)時(shí)間或者試試平板培養(yǎng)，質(zhì)粒拷貝數(shù)低，質(zhì)粒抽提過程很大程度上是受細(xì)菌生長(zhǎng)情況決定的，剛活化的菌比負(fù)80℃保存菌種所培養(yǎng)出來的菌液狀態(tài)好，保存久的菌株可能會(huì)造成質(zhì)粒濃度低，質(zhì)粒丟失等不明原因。菌體中無質(zhì)粒，質(zhì)粒丟失。每次接種時(shí)應(yīng)接種單菌落。另外，檢查抗生素使用濃度是否正確。判斷生長(zhǎng)的菌液是否正常，可以用肉眼觀察，在光線明亮處搖蕩新鮮培養(yǎng)液，如果菌液呈漂絮狀，情況很好。如果呈泥水狀，即看不到絮狀，則可能提不出好的質(zhì)粒，或者沒有質(zhì)粒。堿裂解不充分，菌液不宜生長(zhǎng)太濃，搖床速度不宜過高。吸附柱過載：第13頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天質(zhì)粒未全部溶解(尤其質(zhì)粒較大時(shí))：洗脫溶解質(zhì)粒時(shí)，可適當(dāng)加溫或延長(zhǎng)溶解時(shí)間。乙醇?xì)埩簦浩匆合礈旌髴?yīng)離心盡量去除殘留液體，再加入洗脫緩沖液。洗脫液加入位置不正確：洗脫液應(yīng)加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會(huì)完全覆蓋硅膠膜的表面達(dá)到最大洗脫效率。洗脫液不合適：DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫，如洗脫緩沖液或水。洗脫效率還取決于pH值，最大洗脫效率在pH7.0-8.5間。當(dāng)用水洗脫時(shí)確保其pH值在此范圍內(nèi)，如果pH過低可能導(dǎo)致洗脫量低。洗脫時(shí)將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加熱至60℃后使用，有利于提高洗脫效率。洗脫體積太?。弘S著洗脫體積的增大回收率增高，但產(chǎn)品濃度降低。洗脫時(shí)間過短：洗脫時(shí)間對(duì)回收率也會(huì)有一定影響。洗脫時(shí)放置1min可達(dá)到較好的效果。第14頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天3轉(zhuǎn)染方法

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染23逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染第15頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)胞培養(yǎng)用品表面積（mm2/孔）細(xì)胞密度培養(yǎng)基（μl/孔）96孔板501.5×104-5.0×104100μl48孔板1003.0×104-1.0×105200μl24孔板2008.0×104-2.0×105500μl12孔板4011.6×105-4.0×1051.0ml6孔板9623.0×105-8.0×1052.0ml35mm9623.0×105-8.0×1052.0ml60mm28271.0×106-2.5×1066.0ml轉(zhuǎn)染前細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)用品siRNA/DNA培養(yǎng)基終體積Lipo2000（siRNA/DNA）96孔板5pmol/0.2μg100μl0.25μl/0.5μl24孔板20pmol/0.8μg500μl1μl/2μl12孔板40pmol/1.6μg1.0ml2μl/4μl6孔板100pmol/4.0μg2.0ml5μl/10μl35mm100pmol/4.0μg2.0ml5μl/10μl60mm600pmol/8.0μg5.0ml10μl/20μl推薦的DNA:Lipo2000=1:0.5-1:5（ug：ul）siRNA:Lipo2000=1:0.01-1:0.1（pmol：ul）第16頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染1轉(zhuǎn)染前一天鋪板：5.0-8.0×104細(xì)胞接種在24孔板上，0.5ml正常培養(yǎng)基。24h后的細(xì)胞融合達(dá)到70%-90%的密度。轉(zhuǎn)染：（1）50ul無血清培養(yǎng)基（Opti-MEM）+20pmolsiRNA（或0.8ugDNA），柔和混勻，室溫孵育5min（2）50ul無血清培養(yǎng)基+1ullipo2000（DNA+2ullipo2000）柔和混勻，室溫孵育5min。（3）將DNA加入Lipo2000中，輕柔混勻，室溫孵育20min4.將24孔板中的正常培養(yǎng)基換為無血清的培養(yǎng)基（Opti-MEM）1.9ml。5.將100ulsiRNA/Lipo2000（DNA/Lipo2000）復(fù)合物混勻逐滴加入孔中，輕輕搖勻。6.4-6h后，換培養(yǎng)基（全培），48-72小時(shí)監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染水平。7.轉(zhuǎn)染效率：綠色熒光蛋白看熒光mRNA水平，48h后收樣品，做PCR蛋白水平，72h后收蛋白，做WB。第17頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天穩(wěn)定轉(zhuǎn)染2轉(zhuǎn)染前一天鋪板：5.0-8.0×104細(xì)胞接種在24孔板上，0.5ml正常培養(yǎng)基。24h后的細(xì)胞融合達(dá)到70%-90%的密度。轉(zhuǎn)染：（1）50ul無血清培養(yǎng)基（Opti-MEM）+20pmolsiRNA（或0.8ugDNA），柔和混勻，室溫孵育5min（2）50ul無血清培養(yǎng)基+1ullipo2000（DNA+2ullipo2000）柔和混勻，室溫孵育5min。（3）將DNA加入Lipo2000中，輕柔混勻，室溫孵育20min4.將24孔板中的正常培養(yǎng)基換為無血清的培養(yǎng)基（Opti-MEM）1.9ml。5.將100ulsiRNA/Lipo2000（DNA/Lipo2000）復(fù)合物混勻逐滴加入孔中，輕輕搖勻。6.4-6h后，換培養(yǎng)基（全培），48-72小時(shí)監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染水平。7.加相應(yīng)的抗生素篩選，一般是轉(zhuǎn)染48小時(shí)后加入抗生素。挑出單后就可以用維持濃度，一般是篩選濃度的1/2第18頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天1．

確定抗生素作用的最佳濃度：不同的細(xì)胞株對(duì)各種抗生素有不同的敏感性,因此在篩選前要做預(yù)試驗(yàn),確定抗生素對(duì)所選擇細(xì)胞的最低作用濃度.

①提前24小時(shí)在96孔板或24孔板中接種細(xì)胞8孔,接種量以第二天長(zhǎng)成25%單層為宜,置CO2孵箱中37℃培養(yǎng)過夜.

②將培養(yǎng)液換成含抗生素的培養(yǎng)基,抗生素濃度按梯度遞增0,（50,100,200,400,600,800和1000μg/ml）.

③培養(yǎng)10-14天以絕大部分（>90%）細(xì)胞死亡濃度為準(zhǔn),篩選穩(wěn)定表達(dá)克隆時(shí)可比該濃度適當(dāng)提高一個(gè)級(jí)別,維持時(shí)使用篩選濃度的一半.

2．

轉(zhuǎn)染48-72小時(shí)后按1:10的比例將轉(zhuǎn)染細(xì)胞在6孔板中傳代,換為含預(yù)試驗(yàn)中確定的抗生素濃度的選擇培養(yǎng)基.在6孔板內(nèi)可見單個(gè)細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)可見單個(gè)細(xì)胞分裂繁殖形成單個(gè)抗性集落.轉(zhuǎn)染細(xì)胞的穩(wěn)定篩選第19頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.挑選單克隆.

①濾紙片法：用消毒的5x5mm濾紙片浸過胰酶,將濾紙片貼在單細(xì)胞集落上10-15秒,取出粘附有細(xì)胞的濾紙片放于24孔板中繼續(xù)加壓培養(yǎng).細(xì)胞在24孔板中長(zhǎng)滿后轉(zhuǎn)入25cm2培養(yǎng)瓶中,長(zhǎng)滿后再轉(zhuǎn)入75cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng).

②有限稀釋法：將細(xì)胞消化下來后做連續(xù)的10倍稀釋（10-2-10-10）,將每一稀釋度的細(xì)胞滴加到96孔板中培養(yǎng),7-10天后,選擇單個(gè)克隆生長(zhǎng)的孔再一次進(jìn)行克隆.

4.

ELISA或Westernblot檢測(cè)單克隆細(xì)胞中外源蛋白的表達(dá)情況由于不同克隆的表達(dá)水平存在差異因此可同時(shí)挑選多個(gè)克隆選擇表達(dá)量最高的克隆傳代并保種.

第20頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天3逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染一、概述反轉(zhuǎn)錄病毒是RNA病毒，但有反轉(zhuǎn)錄酶，可使RNA轉(zhuǎn)錄為DNA，再整合到宿主細(xì)胞基因組。在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下首先將RNA轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA，再在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等蛋白酶作用下擴(kuò)增的一類病毒。它有三個(gè)基因：gag-編碼病毒的核心蛋白；pol-編碼逆轉(zhuǎn)錄酶；env-編碼病毒的被膜糖蛋白。二、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體優(yōu)點(diǎn)：(1)轉(zhuǎn)染范圍廣，可以感染各種細(xì)胞類型，如淋巴細(xì)胞或肝細(xì)胞、肌細(xì)胞等;(2)轉(zhuǎn)入的外源基因可完全整合(3)對(duì)細(xì)胞感染率高，基因轉(zhuǎn)移率在10%-100%(4)感染細(xì)胞不產(chǎn)生病變，可建立細(xì)胞系長(zhǎng)期持續(xù)表達(dá)外源基因逆轉(zhuǎn)錄病毒通常分兩種：簡(jiǎn)單的（有時(shí)又稱為致癌病毒或γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒，如鼠白血病病毒）和復(fù)雜的（如慢病毒）。這些亞型間主要的差異在于復(fù)雜的逆轉(zhuǎn)錄病毒存在一些附屬基因和調(diào)控基因，而簡(jiǎn)單的則沒有。第21頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天當(dāng)重組病毒載體導(dǎo)入包裝細(xì)胞后，缺陷病毒載體和包裝細(xì)胞的互補(bǔ)作用共同完成病毒裝配,該病毒顆?？筛腥酒渌拗骷?xì)胞，此時(shí)目的基因進(jìn)入該細(xì)胞并整合到細(xì)胞基因組中，導(dǎo)致插入序列在宿主細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)生目的蛋白。宿主細(xì)胞不能像包裝細(xì)胞那樣為缺失結(jié)構(gòu)基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒提供結(jié)構(gòu)蛋白，因而在宿主細(xì)胞內(nèi)不會(huì)產(chǎn)生新的感染性病毒顆粒,保證了該載體在生物制品領(lǐng)域的生物安全性問題。三、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包裝原理逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)共由兩部分組成：缺陷病毒本身包裝細(xì)胞系提供病毒載體包裝成病毒粒子所需的結(jié)構(gòu)蛋白去除了正常的蛋白編碼序列而保留了復(fù)制和包裝信號(hào)，通過分子克隆技術(shù)將目的基因插入此載體上第22頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天第23頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)染前一天，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的HEK293T細(xì)胞5×104個(gè)/孔種于24孔板中，500μlDMEM+10%FBS培養(yǎng)基/孔，設(shè)立空白組及p-BABE-EGFE-野生型及突變型質(zhì)粒組，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80~90%融合時(shí)，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。取0.5μg

p-BABE-EGFR野生型及突變型質(zhì)粒+

0.45μg

p-BABE-gag

+

0.05μgp-BABE-VSV質(zhì)粒分別稀釋于50μl無雙抗無血清的DMEM培養(yǎng)基中，輕柔混勻，室溫放置5分鐘。取2.5μLLipofectamineTM2000稀釋于50μl無雙抗無血清DMEM培養(yǎng)基中，輕柔混勻，室溫下靜置5分鐘。將轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒DNA稀釋液輕柔混合均勻，室溫靜置20分鐘。用無血清無雙抗的DMEM培養(yǎng)基洗細(xì)胞2-3次，并換上400μl新鮮的無血清無雙抗的DMEM培養(yǎng)基。將質(zhì)粒和LipofectamineTM2000混合物100μl逐滴加入孔中，來回輕柔搖晃細(xì)胞培養(yǎng)板，使混合物均勻覆蓋細(xì)胞。

4~6h后（可鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)確定轉(zhuǎn)染時(shí)間），去掉轉(zhuǎn)染試劑，用DMEM完全培養(yǎng)基洗兩遍，加入500μlDMEM完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞板置于37℃、5%CO2

培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48h后，1000rpm，4℃，離心5min，收集48h病毒上清，并換上500μL新鮮的10%FBSDMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h，1000rpm，4℃，離心5min，收集72h病毒，收集的病毒可以直接用于感染，也可凍于-80℃用于后續(xù)感染實(shí)驗(yàn)。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包裝第24頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天（1）種板：在感染前12～18h，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的NIH3T3細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，以5×104/孔種于24孔板中，置于37℃、5%CO2

培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（2）第一次感染：取0.5ml48h病毒上清+0.5ml10%FBSDMEM培養(yǎng)基+4μg/mlpolybrene，加入NIH3T3細(xì)胞中，置于37℃、5%CO2

培養(yǎng)箱中感染16h。

（3）第二次感染：去除上述培養(yǎng)基，并向NIH3T3細(xì)胞中加入0.5ml72h病毒上清+0.5ml10%DMEM培養(yǎng)基+4μg/mlpolybrene，置于37℃、5%CO2

培養(yǎng)箱進(jìn)行第二次感染，感染24h后，加入嘌呤霉素進(jìn)行篩選。2、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染NIH3T3細(xì)胞第二次感染后，加入8μg/ml嘌呤霉素進(jìn)行篩選，每3天換一液，待長(zhǎng)出陽(yáng)性克隆，抗生素減半維持，繼續(xù)篩選14天，挑取單克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，凍存細(xì)胞。3、篩選穩(wěn)定表達(dá)p-BABE-EGFR野生型及突變型質(zhì)粒的NIH3T3細(xì)胞株第25頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天逆轉(zhuǎn)錄病毒可能會(huì)整合到人的細(xì)胞中。所以進(jìn)行病毒操作時(shí)必須在生物安全柜中進(jìn)行，帶口罩，廢液密閉回收用84滅活，槍頭、離心管等也要滅活。第26頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天血清血清會(huì)影響復(fù)合物的形成，降低轉(zhuǎn)染效率陽(yáng)離子脂質(zhì)體和DNA的最佳量在使用血清時(shí)會(huì)有所不同，因此如果你想在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中加入血清需要對(duì)條件進(jìn)行優(yōu)化。大部分細(xì)胞可以在無血清培養(yǎng)基中幾個(gè)小時(shí)內(nèi)保持健康。對(duì)于對(duì)血清缺乏比較敏感的細(xì)胞，可以使用OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基，一種營(yíng)養(yǎng)豐富的無血清培養(yǎng)基，或者在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中使用血清。對(duì)于對(duì)血清缺乏比較敏感的貼壁細(xì)胞，建議使用LIPOFECTAMINE2000。14影響轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的因素第27頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)基中的抗生素抗生素，比如青霉素和鏈霉素，是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些抗生素一般對(duì)于真核細(xì)胞無毒，但陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性，使抗生素可以進(jìn)入細(xì)胞。這降低了細(xì)胞的活性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低。2第28頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天3細(xì)胞維護(hù)和培養(yǎng)的演變

一般低的細(xì)胞代數(shù)（<50）能確?；蛐筒蛔?。轉(zhuǎn)染前細(xì)胞最好經(jīng)過1-2次傳代，以保證細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，容易轉(zhuǎn)染。注意，貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)到幾乎匯片時(shí)就要趕快進(jìn)行下一次傳代，千萬不要使細(xì)胞保持融合超過24小時(shí)，因?yàn)橐坏╅L(zhǎng)滿了，細(xì)胞們就“故步自封”不思轉(zhuǎn)染啦?；盍Τ渑娴哪贻p細(xì)胞更容易接受外來的新鮮事物。第29頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天4細(xì)胞鋪板密度一般轉(zhuǎn)染時(shí)，貼壁細(xì)胞密度為70%-90%，懸浮細(xì)胞密度為2×106-4×106細(xì)胞/ml時(shí)效果較好。確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞沒有長(zhǎng)滿或處于靜止期。鋪板細(xì)胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細(xì)胞產(chǎn)量。5DNA

質(zhì)量DNA質(zhì)量對(duì)轉(zhuǎn)染效率影響非常大。一般的轉(zhuǎn)染技術(shù)（如脂質(zhì)體等）基于電荷吸引原理，如果DNA不純，如帶少量的鹽離子，蛋白，代謝物污染都會(huì)顯著影響轉(zhuǎn)染復(fù)合物的有效形成及轉(zhuǎn)染的進(jìn)行。第30頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天常見問題及解決方案5Q1：轉(zhuǎn)染效率低（1）沒有使用優(yōu)化的陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑。選擇針對(duì)您的細(xì)胞類型轉(zhuǎn)染效率可能最高的陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑。（2）沒有使用優(yōu)化條件。優(yōu)化陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑和DNA的量。（3）DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑復(fù)合物在存在血清條件下形成。在復(fù)合體形成時(shí)不要使用血清。（4）存在抑制劑。不要使用抗生素，EDTA，檸檬酸鹽，磷酸鹽，硫酸軟骨素，透明質(zhì)酸，硫酸葡聚糖或其他硫酸蛋白多糖。（5）不恰當(dāng)?shù)募?xì)胞密度。細(xì)胞密度在轉(zhuǎn)染時(shí)融合度為70%~90%。第31頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天（7）陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑凍結(jié)。

不要使用凍結(jié)的或儲(chǔ)存溫度低于4℃的陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑。（8）轉(zhuǎn)染分析的問