蛋白質(zhì)合成分離

關(guān)于蛋白質(zhì)合成分離意義解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，為應(yīng)用及人工合成蛋白質(zhì)提供全面信息；許多肽具有獨(dú)特的生物學(xué)活性，是目前合成的主要物質(zhì)；第2頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天第一節(jié)肽合成合成肽的方法有三類(lèi)第一類(lèi)是由不同氨基酸按照一定順序的控制合成；第二類(lèi)是由氨基酸自由共聚；第三類(lèi)由酶催化在非水介質(zhì)中合成。第3頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天

第一類(lèi)是目前合成肽的主要方法，該方法在合成前必須先將不參與形成肽鍵的活潑基團(tuán)保護(hù)起來(lái)。例如，羧基可用活性酯法（酰氯），氨基可以采用碳二亞胺法形成卞氧甲酰胺，合成后再將保護(hù)基水解下來(lái)。最后分離產(chǎn)物。第4頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天第5頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天第6頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天第7頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天80年代，開(kāi)發(fā)出固相合成技術(shù)。合成肽鏈時(shí)，在聚苯乙烯樹(shù)脂小珠固相上進(jìn)行。⑴待合成的第一個(gè)氨基酸的羧基先和氯甲基聚苯乙烯樹(shù)脂反應(yīng)，共價(jià)地掛接在樹(shù)脂上。⑵除去該氨基酸的N-末端保護(hù)基;⑶第二個(gè)氨基酸（氨基被保護(hù)）以碳二亞胺為縮合劑，接到第一個(gè)氨基酸的氨基上；⑷除去第二個(gè)氨基酸的氨基保護(hù)基；重復(fù)上述步驟，使肽鏈按控制順序從C端向N端延長(zhǎng)。合成一個(gè)十肽，花費(fèi)27小時(shí)，產(chǎn)率85%。第8頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天肽鏈合成到最后一步時(shí)，把樹(shù)脂懸浮在無(wú)水三氟乙酸中，通入干燥的HBr，使肽與樹(shù)脂脫離，同時(shí)也切除保護(hù)基團(tuán)?，F(xiàn)在多肽合成儀上進(jìn)行，反應(yīng)杯中的試劑按程序泵入和除去。第9頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天第10頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天第11頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天第二類(lèi)實(shí)際上在講氨基酸成肽反應(yīng)時(shí)已經(jīng)講過(guò)，從理論上講，該反應(yīng)在工業(yè)上可以用來(lái)制備聚氨基酸，但是該反應(yīng)沒(méi)有選擇性。第三類(lèi)是用酶合成，在水環(huán)境下，合成肽需要消耗能量（ATP）；在非水條件下，蛋白酶等水解酶可轉(zhuǎn)變成合成酶，將氨基酸合成肽。而且不需要消耗ATP。該法優(yōu)點(diǎn)是條件溫和，步驟少，缺點(diǎn)是氨基酸或肽的溶劑體系選擇以及合成物的卸載。第12頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天近25年來(lái)，生物催化劑在非水介質(zhì)中催化反應(yīng)以及應(yīng)用的研究論文呈現(xiàn)爆炸性增長(zhǎng)。這里的生物催化劑主要指酶，非水介質(zhì)包括微水有機(jī)溶劑體系；反膠束體系；水-水不互溶兩相體系。在有機(jī)介質(zhì)中，酶改變反應(yīng)方向，例如水解酶變成合成酶；剛性增加，對(duì)底物的專(zhuān)一性大大提高；熱穩(wěn)定性顯著提高；可重復(fù)使用；避免微生物污染；可對(duì)水敏感的底物進(jìn)行催化。非水介質(zhì)中生物催化簡(jiǎn)介第13頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶催化的反應(yīng)氧化還原酶轉(zhuǎn)移酶第14頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天水解酶裂合酶異構(gòu)酶合成酶第15頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶分子在非水介質(zhì)中主要以下列形式存在，即：固態(tài)-凍干粉或固定化酶或結(jié)晶酶；可溶解酶-水溶性大分子修飾酶；非共價(jià)修飾的高分子-酶復(fù)合物、表面活性劑-酶復(fù)合物、乳液酶等；在非水介質(zhì)中酶能保持整體結(jié)構(gòu)的完整性；其活性部位的結(jié)構(gòu)與在水溶液中相同；非水介質(zhì)中酶的狀態(tài)第16頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天非水介質(zhì)中的酶學(xué)性質(zhì)非水介質(zhì)中，酶分子內(nèi)的氫鍵起主要作用，導(dǎo)致其〝剛性增加〞，維持其活性中心的構(gòu)象與在水介質(zhì)中的一致。

第17頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天在非水介質(zhì)中，酶與介質(zhì)間的疏水相互作用平衡改變，導(dǎo)致酶的專(zhuān)一性、催化性質(zhì)等受到影響酶的穩(wěn)定性提高，例如脂肪酶酶的特異性不變，但是對(duì)底物的催化效率會(huì)發(fā)生變化，即催化效率增加了分配系數(shù)項(xiàng)第18頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天微量水的影響是影響非水介質(zhì)中酶活力及選擇性的控制步驟水的作用：調(diào)控酶構(gòu)象微量水對(duì)酶發(fā)揮有效催化是必需的，水分子直接或間接參與酶穩(wěn)定構(gòu)象的各種非共價(jià)作用，弱化荷電基團(tuán)或極性基團(tuán)間的相互作用，增加酶柔性及選擇性第19頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天非水介質(zhì)中酶結(jié)合水的位點(diǎn)及結(jié)合量離子化基團(tuán)水化：與酶分子表面的荷電基團(tuán)結(jié)合；結(jié)合量0-0.07g/g酶極性水族生長(zhǎng)：與酶分子表面極性基團(tuán)結(jié)合；結(jié)合量0.07-0.25g/g酶弱吸附：與酶表面弱極性區(qū)域結(jié)合；結(jié)合量0.25-0.38g/g酶完全水化：酶蛋白表面完全水化；結(jié)合量0.38g/g酶第20頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天第21頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天非水介質(zhì)中酶催化反應(yīng)類(lèi)型及應(yīng)用酶催化反應(yīng)的類(lèi)型C-O鍵的形成，包括酯合成、環(huán)氧化、糖苷合成、加氧氧化C-N鍵的反應(yīng)，包括肽的合成C-C鍵的形成，包括羥醛、酮醛和羥醛轉(zhuǎn)移、醛縮合、醛加成等還原反應(yīng)氧化反應(yīng)，包括C-H、C=C氧化，醇氧化，酚氧化，羧酸氧化，C-N氧化，異構(gòu)化反應(yīng)形成C-X的反應(yīng)（鹵化反應(yīng)）包括烯烴、炔烴、芳香族及含有活潑的C-H鍵的化合物的鹵化。第22頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶非水催化反應(yīng)的應(yīng)用⑴制備光學(xué)活性化合物⑵合成旋光性高分子⑶糖和類(lèi)固醇的選擇性催化⑷功能性高分子合成⑸可生物降解高分子的酶促合成第23頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天合成肌肽及其類(lèi)似物存在于動(dòng)物肌肉中的肌肽是由β-丙氨酸與L-組氨酸組成的二肽，具有抗氧化、清除自由基，pH緩沖等生理功能。其最顯著的性質(zhì)是抗氧化，主要表現(xiàn)為捕獲活性氧和自由基，螯合金屬離子，結(jié)合脂肪酸氧化產(chǎn)物-醛，是迄今發(fā)現(xiàn)的最有效天然抗氧化、抗衰老二肽。第24頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天肌肽及其類(lèi)似物的結(jié)構(gòu)式第25頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天正丁醇中合成肌肽

40℃、pH6.5，轉(zhuǎn)化率84.26%第26頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天四氫呋喃中合成肌肽類(lèi)似物

50℃、pH8.5，轉(zhuǎn)化率76.35%第27頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天第28頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天合成硬脂酰三乙醇銨單酯硬脂酰三乙醇胺鹽酸鹽是一種季銨化合物，在日化行業(yè)主要用于洗發(fā)香波中，中和頭發(fā)蛋白質(zhì)的負(fù)電荷及抗菌。該分子在頭發(fā)上的附著力強(qiáng)，產(chǎn)生〝飄逸〞效果，但無(wú)光亮。該物質(zhì)目前采用酸催化劑在140℃左右脫水合成第29頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天用脂肪酶在正己烷中合成，合成溫度55℃，轉(zhuǎn)化率72.75%，酶可以反復(fù)使用多次。

第30頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天合成羥基脯氨酸雙酯羥基脯氨酸（L-Hyp），修飾氨基酸，抗自由基、抗衰老，日化行業(yè)在功能性皮膚化妝品中使用。脂/水平衡系數(shù)低，不能透過(guò)皮膚細(xì)胞膜。目前采用兩步法化學(xué)合成。單酯合成溫度達(dá)120℃，苯系物為帶水劑，雙酯的合成方法未見(jiàn)公開(kāi)報(bào)道。由于其吡咯環(huán)的干擾，預(yù)計(jì)合成溫度將超過(guò)160℃，伴隨單酯鍵部分水解。第31頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天合成羥基脯氨酸雙酯

無(wú)溶劑、脂肪酶、60℃、6-8h，轉(zhuǎn)化率超過(guò)93%第32頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天酯交換合成單酯第33頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天單酯酯化合成雙酯第34頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天第二節(jié)蛋白質(zhì)分子量測(cè)定

⒈最小分子量如血紅蛋白含0.335%鐵，其最低分子量=16700⒉滲透壓法π=RT（c/Mτ+Kc2）,Mτ=RT/lim(c0)π/C第35頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天第36頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天⒊凝膠過(guò)濾Ve/Vo=a-blogMτ

式中，Ve為洗脫液體積，Vo為外水體積，Mτ為相對(duì)分子質(zhì)量，a，b為常數(shù)。移項(xiàng)得：logMτ=a/b-1/b（Ve//Vo）基于蛋白質(zhì)主要呈球狀，假設(shè)分子量相同，其分子體積及直徑相同。先測(cè)幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的Ve，以其相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)（logMτ）對(duì)Ve作圖，得一條直線(xiàn)。再測(cè)樣品的Ve，即可從圖中查出其相對(duì)分子量。第37頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天第38頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天第39頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天⒋SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳這是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的電泳方法?；诒环蛛x物質(zhì)的分子大小和電荷。①聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺和N，N’-甲叉雙丙烯酰胺聚合而成的大分子。第40頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天②聚丙烯酰胺凝膠是人工合成的高聚物，聚合前調(diào)節(jié)單體濃度比，使之既有適宜的空隙度，又有較好的機(jī)械性質(zhì)。第41頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天③丙烯酰胺單體和甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)劑在水溶液中通過(guò)自由基引發(fā)的聚合反應(yīng)形成凝膠。

聚合反應(yīng)的催化劑包括引發(fā)劑和加速劑。引發(fā)劑使丙烯酰胺成為自由基，發(fā)動(dòng)聚合反應(yīng)，加速劑則加快引發(fā)劑釋放自由基的速度。④聚丙烯酰胺熱穩(wěn)定，無(wú)色透明，可肉眼觀(guān)察或用檢測(cè)儀測(cè)定。第42頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天常用的引發(fā)劑和加速劑的配伍如下表：

引發(fā)劑

加速劑（NH4)2S2O8

TEMEDN，N，N，N';四甲基乙二胺

(NH4)2S2O8DMAPNβ－二甲基胺基丙晴核黃素

TEMED第43頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天

用過(guò)硫酸銨引發(fā)的反應(yīng)為化學(xué)聚合反應(yīng)；用核黃素引發(fā)，需要強(qiáng)光照射反應(yīng)液，為光聚合反應(yīng)。聚丙烯酰胺聚合反應(yīng)受下列因素影響：

1、大氣中氧能淬滅自由基，使聚合反應(yīng)終止（空氣隔絕）。

2、某些材料如有機(jī)玻璃，能抑制聚合反應(yīng)（選擇容器材質(zhì)）。

3、某些試劑可以減慢反應(yīng)速度，如赤血鹽（電位）。

4、溫度高聚合快，溫度低聚合慢（控溫）。

第44頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天每100mL凝膠溶液中含有單體和交聯(lián)劑的總質(zhì)量數(shù)（g）稱(chēng)凝膠濃度，常用T%表達(dá)；凝膠中交聯(lián)劑占單體或交聯(lián)體質(zhì)量的百分?jǐn)?shù)稱(chēng)為交聯(lián)度，常用C%表示。此外，聚丙烯酰胺凝膠還有分子篩效應(yīng)。電泳遷移率與肽鏈分子量的對(duì)數(shù)有如下關(guān)系：logMτ=a-bμR

或logMτ=K1-K2μR式中μR為相對(duì)遷移率=樣品遷移距離/前沿（染料）遷移距離，其余為常數(shù)。第45頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天測(cè)定時(shí)，以幾種標(biāo)準(zhǔn)物蛋白質(zhì)的Mτ的對(duì)數(shù)值對(duì)其μR值作圖，根據(jù)待測(cè)樣品的μR，從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出它的Mτ。含丙烯酰胺7-7.5%的凝膠，適用于分離1萬(wàn)至100萬(wàn)物質(zhì)，1萬(wàn)以下的則采用15-30%的凝膠，分子量特別大的采用含4%的凝膠。第46頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳十二烷基磺酸鈉（SDS）是一種有效的蛋白質(zhì)變性劑，它能破壞蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水作用。SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合使變性蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，覆蓋于多肽鏈上，數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)蛋白質(zhì)所帶電荷。第47頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天第48頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天SDS改變了蛋白質(zhì)單體分子的構(gòu)象SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物呈近似雪茄的長(zhǎng)橢圓棒，不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合體直徑（短軸）都是一樣的，約為1.8nm，而長(zhǎng)軸長(zhǎng)度卻隨蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量成正比例變化。因此，電泳時(shí)蛋白質(zhì)遷移率僅與其分子量相關(guān)。第49頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天因此，在電泳時(shí)以同樣的電荷/蛋白質(zhì)比(荷質(zhì)比）向正極方向移動(dòng)；消除了蛋白質(zhì)原有的電荷、分子形狀等因素的影響。第50頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天第51頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天第52頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天第53頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天第54頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天常用的電泳方法除了凝膠電泳以外，還有區(qū)帶電泳：支持介質(zhì)為薄膜、紙等；等電聚焦電泳（IEF）：以?xún)尚噪娊赓|(zhì)為電泳介質(zhì)，將其制備成pH梯度，分離蛋白質(zhì)等帶電離子的方法。兩性電解質(zhì)是由多種氨基與羧基比例不同的多氨基多羧酸的混合物構(gòu)成，例如丙稀酸、順丁烯二酸、反丁烯二酸、亞甲基丁二酸等；常用的脂肪胺有乙二胺、二乙烯三胺、乙醇胺等。將上述的酸與胺進(jìn)行加成反應(yīng)獲得。第55頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天當(dāng)被分離的蛋白質(zhì)到達(dá)其等電點(diǎn)區(qū)間時(shí)，以兼性離子存在，靜電荷為零，既不向正極、也不向負(fù)極泳動(dòng)；等電聚焦電泳分辨率高、可大規(guī)模使用，用于分析和工業(yè)制備。現(xiàn)在已經(jīng)有規(guī)?；a(chǎn)的兩性電解質(zhì)銷(xiāo)售。第56頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天第三節(jié)蛋白質(zhì)的鹽溶與鹽析鹽溶：中性鹽對(duì)球狀蛋白質(zhì)的溶解度有顯著影響，在低濃度時(shí)，可以增加蛋白質(zhì)的溶解度，稱(chēng)鹽溶。鹽溶是蛋白質(zhì)吸附鹽離子后，帶電層使蛋白質(zhì)分子彼此排斥，而蛋白質(zhì)與水之間的作用加強(qiáng)，溶解度增高。第57頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天第58頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天鹽析：指蛋白質(zhì)在高濃度中性鹽存在時(shí)從溶液中沉淀析出的現(xiàn)象鹽析時(shí)，同濃度二價(jià)中性鹽對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的影響，要比單價(jià)大。中性鹽影響蛋白質(zhì)溶解度的能力是其離子強(qiáng)度的函數(shù)。離子強(qiáng)度定義為：I=1/2∑CiZi2Ci為離子的濃度，Zi為離子的凈電荷第59頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天計(jì)算溶液的離子強(qiáng)度，可將各種離子的濃度分別乘以各種離子所帶的凈電荷的平方，然后將所有乘積相加并除以2。例如，2mol/L硫酸銨溶液的離子強(qiáng)度為：［（4×1）+（2×2）］/2=6第60頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天在鹽析時(shí)，要加入的硫酸銨可用下式表示：⑴0℃，硫酸銨濃度由飽和度S1增至S2，應(yīng)向1升溶液中添加的固體硫酸銨克數(shù)：W=505（S2-S1）/（1-0.285S2）S1和S2分別表示起始和終了飽和度.飽和度是在給定條件下某中性鹽達(dá)到的最大百分濃度；505是0℃時(shí)1000mL飽和硫酸銨(100%或1.00飽和度)溶液中所含的硫酸銨克數(shù)(505g/1000毫升溶液);⑵將100mL硫酸銨溶液,由飽和度S1

變?yōu)镾2,應(yīng)向其中加入飽和硫酸銨的毫升數(shù)V:V=100(S2-S1)/(1-S2)第61頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天第四節(jié)蛋白質(zhì)的性質(zhì)一、蛋白質(zhì)的可解離基團(tuán)蛋白質(zhì)分子中可解離基團(tuán)的pKa值第62頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)分子達(dá)到膠體質(zhì)點(diǎn)的范圍，具有膠體所有的性質(zhì)，特別是不能通過(guò)半透膜。半透膜：能讓水和小分子物質(zhì)自由通過(guò)的膜。蛋白質(zhì)分子表面分布大量親水側(cè)鏈，水溶液中蛋白質(zhì)分子表面形成一層水膜，吸水量為0.3～0.5克/克蛋白。許多可解離的基團(tuán)，與周?chē)喾措姾傻碾x子形成鹽鍵,即雙電層。第63頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天第64頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、蛋白質(zhì)的兩性性質(zhì)和等電點(diǎn)蛋白質(zhì)分子中的可解離側(cè)鏈基團(tuán)，有的與酸作用，有的與堿作用，是兩性電解質(zhì)。等電點(diǎn)：某一pH值時(shí)，蛋白質(zhì)所帶正電荷和負(fù)電荷相等，即凈電荷為零，此時(shí)溶液pH值稱(chēng)該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。第65頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天第66頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)分子中可解離側(cè)鏈基團(tuán)的凈電荷為零，雙電層幾乎消失，溶解度最小。等離子點(diǎn)：等電點(diǎn)與介質(zhì)的離子組成、pH變化有關(guān)，故測(cè)定等電點(diǎn)要在確定的pH、離子強(qiáng)度的緩沖液中進(jìn)行。純水中測(cè)得的等電點(diǎn)稱(chēng)等離子點(diǎn)。第67頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天幾種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)

第68頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)酸性氨基酸和堿性氨基酸含量與等電點(diǎn)的關(guān)系第69頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天四、蛋白質(zhì)變性和復(fù)性變性作用：蛋白質(zhì)受某些物理化學(xué)因素的影響，空間構(gòu)象破壞導(dǎo)致的理化性質(zhì)，生物學(xué)活性改變的現(xiàn)象。變性是蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)以上的高級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞而導(dǎo)致生物活性喪失的過(guò)程。變性因素：強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、劇烈攪拌、重金屬鹽、有機(jī)溶劑、脲、胍類(lèi)、超聲波、加熱等。第70頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天變性結(jié)果：溶解度降低，不對(duì)稱(chēng)性增加，結(jié)晶能力喪失，易被蛋白酶水解?？赡孀冃裕褐赋プ冃砸蛩睾?，變性蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)恢復(fù)，使生物學(xué)活性恢復(fù)。不可逆變性：指除去變性因素后，變性蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)及生物學(xué)活性不能恢復(fù)。復(fù)性：變性蛋白質(zhì)恢復(fù)空間結(jié)構(gòu)及生物學(xué)活性的過(guò)程。第71頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天五、蛋白質(zhì)的沉淀水化層和雙電層是蛋白質(zhì)溶液穩(wěn)定的兩個(gè)主要因素，破壞其中的一個(gè)或兩個(gè)都可使蛋白質(zhì)變性而沉淀析出。這種變性蛋白質(zhì)從溶液中析出的現(xiàn)象稱(chēng)為蛋白質(zhì)的沉淀作用。第72頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天1.可逆沉淀：指除去沉淀劑后，使蛋白質(zhì)恢復(fù)溶解狀態(tài)。鹽析；鹽析作用破壞雙電層并奪去蛋白質(zhì)水分。鹽溶；形成雙電層2.不可逆沉淀

重金屬鹽、有機(jī)溶劑、生物堿試劑等都能使蛋白質(zhì)生成不可逆沉淀，不能用透析等方法除去沉淀劑，使蛋白質(zhì)重新溶解。第73頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天⑴.重金屬鹽在堿性條件下蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，可與Hg、Pb等重金屬離子結(jié)合，形成不溶性的鹽沉淀。

NH2NH2Pr+Hg2+PrCOO-COO-:Hg2+第74頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天⑵.生物堿試劑生物堿是植物組織中具有顯著生理作用的一類(lèi)含氮的堿性物質(zhì)。能沉淀生物堿的試劑稱(chēng)為生物堿試劑。如單寧酸、苦味酸、三氯乙酸等

第75頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天⑶.有機(jī)溶劑乙醇、丙酮等可破壞蛋白質(zhì)的水膜，降低溶液的介電常數(shù)，使蛋白質(zhì)分子間的靜電作用增加，而聚集沉淀。介電常數(shù)：電荷被真空隔絕時(shí)的電勢(shì)與被介質(zhì)隔絕時(shí)的電勢(shì)之比值。第76頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天第77頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天六、蛋白質(zhì)的沉降作用溶液中的蛋白質(zhì)在離心力作用下會(huì)發(fā)生沉降運(yùn)動(dòng)，沉降速度與蛋白質(zhì)分子的大小和密度有關(guān)，也與蛋白質(zhì)分子的形狀、溶劑的密度和粘度有關(guān)。在離心場(chǎng)中蛋白質(zhì)分子受到的凈離心力（離心力—浮力）與摩擦阻力平衡時(shí)，單位離心場(chǎng)強(qiáng)度的沉降速度是定值，稱(chēng)為沉降系數(shù)（S表示）。S=1×10-13s。擴(kuò)散系數(shù)：當(dāng)濃度梯度等于1單位時(shí)，在1s內(nèi)通過(guò)1cm2面積而擴(kuò)散的溶質(zhì)量。（g/cm2s）以蛋白質(zhì)的S及擴(kuò)散系數(shù)，可按下式計(jì)算蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量第78頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天

M=RTS/D（1-νρ）R——?dú)怏w常數(shù)，R=8.314J/molKT——絕對(duì)溫度，KS——沉降系數(shù)，SD——擴(kuò)散系數(shù)ν——蛋白質(zhì)的微分比體積（當(dāng)加入1克干物質(zhì)于無(wú)限大體積的溶劑中，溶液體積的增量）ρ——溶劑的密度，g/cm3第79頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天七、蛋白質(zhì)顏色反應(yīng)第80頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天第五節(jié)蛋白質(zhì)分離純化和測(cè)定一、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則大多數(shù)蛋白質(zhì)在細(xì)胞中都和核酸等生物大分子結(jié)合在一起；許多蛋白質(zhì)在性質(zhì)、結(jié)構(gòu)上有許多相似，目前，還沒(méi)有一種方法能適應(yīng)多種蛋白質(zhì)的提取、分離和純化。蛋白質(zhì)分離純化的基本原則如下：材料：目標(biāo)物濃度高、新鮮；采用溫和方法處理；盡量避免活性損失。第81頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天1.材料預(yù)處理及細(xì)胞破碎材料選擇：選擇目標(biāo)蛋白含量高，容易提取的材料；若要制備有活性的蛋白質(zhì)，所用材料須新鮮且含量高。⑴材料預(yù)處理①丙酮干粉：如果要制備的蛋白質(zhì)對(duì)丙酮不敏感，可制成丙酮干粉（反復(fù)用4-8倍體積的冷丙酮脫水），以防止蛋白酶的水解及溫度變化帶來(lái)的變性。②冰箱及液氮罐保藏冰箱-20℃，液氮-193℃?？砷L(zhǎng)期保藏。第82頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天⑵破碎細(xì)胞釋放蛋白質(zhì)破壞細(xì)胞的方法有：①機(jī)械破碎法；利用機(jī)械力的攪切作用破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜。高速組織搗碎機(jī)，勻漿器，研缽。第83頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天②滲透破碎：利用低滲條件使細(xì)胞膨脹而破碎。③凍融法：利用細(xì)胞內(nèi)冰晶破壞膜結(jié)構(gòu)，反復(fù)進(jìn)行多次。但溫度敏感蛋白不用此法。④超聲波法：超聲波使細(xì)胞膜受張力不均破裂，超聲波震蕩器。⑤酶法：溶菌酶破壞微生物細(xì)胞膜。第84頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天第85頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天第86頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天第87頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.蛋白質(zhì)抽提根據(jù)要制備的蛋白質(zhì)的性質(zhì)，選擇合適的溶劑將蛋白質(zhì)與其它組分分開(kāi)。合適溶劑是指選擇有適宜的pH、離子強(qiáng)度、組成成分等的緩沖液。例如磷酸鹽緩沖液檸檬酸緩沖溶液等。抽提過(guò)程中是在低溫下進(jìn)行的，要注意將溫度控制在4～10℃；提取時(shí)需要強(qiáng)化傳質(zhì)，往往使用攪拌器，但是要注意避免劇烈攪拌或使用過(guò)大的剪切力，以防止蛋白變性。第88頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.獲得蛋白粗品即從抽提液中獲得初步分離蛋白質(zhì)，常用的方法有：⑴等電點(diǎn)沉淀法；調(diào)節(jié)提取液pH，達(dá)到目標(biāo)蛋白的等電點(diǎn)。⑵鹽析法；鹽析分離的蛋白仍保持天然性質(zhì)并能再度溶解。一般使用中性鹽，例如最常用硫酸銨。但硫酸鈉、磷酸鉀效果最好。第89頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天⑶有機(jī)溶劑沉淀法使用與水可任意互溶的小分子有機(jī)溶劑，例如乙醇和丙酮它們從蛋白質(zhì)分子表面大量奪取水分子，迫使蛋白質(zhì)通過(guò)相反電荷間的吸引力聚集，溶解性降低，進(jìn)而沉淀下來(lái)。調(diào)節(jié)溶液pH，使其到達(dá)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近時(shí)再加入有機(jī)溶劑，則沉淀效果更好。有機(jī)溶劑破壞蛋白質(zhì)表面的水膜時(shí)要放熱，可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，應(yīng)盡量在低溫下操作并選擇合適的有機(jī)溶劑濃度。第90頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、分離純化的主要方法用上述方法得到的蛋白質(zhì)粗品還混有其它蛋白質(zhì)及非蛋白雜質(zhì)，須進(jìn)一步分離純化才能得到可用于醫(yī)藥或工業(yè)等的產(chǎn)品。常用的純化方法有：⒈離子交換色譜⒉分子排阻色譜⒊親和色譜⒋疏水色譜等常需要聯(lián)合使用這些方法才能獲得較高純度的樣品。第91頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天1.分子排阻色譜又稱(chēng)凝膠過(guò)濾法，分子篩色譜。該法使用一種凝膠即交聯(lián)葡聚糖，商品名Sephadex。這種物質(zhì)由水溶性的葡聚糖（Dextran）和環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)而成?？刂平宦?lián)劑用量，可控制凝膠網(wǎng)格大小，利用網(wǎng)孔大小分離純化蛋白質(zhì)（體積大，孔外最先流出、小者次之、體積與空相近最后流出。）凝膠過(guò)濾分離蛋白質(zhì)圖第92頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天第93頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天第94頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天第95頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天離子交換纖維素是人工合成的纖維素衍生物，其解離基團(tuán)可與帶電荷的蛋白質(zhì)交換達(dá)到分離純化。⑴羧甲基纖維素（CM-纖維素）帶羧甲基基團(tuán)（纖OCH2COOH），是一種陽(yáng)離子交換劑。在中性pH條件時(shí)，羧甲基上的質(zhì)子可解離下來(lái)，與溶液中帶正電荷的蛋白質(zhì)交換。2.離子交換柱色譜法纖維素顆粒

或瓊脂糖O

CH2CH2

O-

第96頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天⑵二乙氨基乙基纖維素(DEAE-纖維素)這是一種陰離子交換劑（纖OCH2CH2N+（C2H5）2，在中性pH條件時(shí)，它含有帶正電荷的基團(tuán)，可與帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)交換。纖維素顆粒

或瓊脂糖H+C2H5

CH2CH2N

C2H5

第97頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天離子交換樹(shù)脂第98頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天離子交換樹(shù)脂結(jié)構(gòu)第99頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天離子交換原理第100頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天第101頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天離子交換器第102頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天⑶親和色譜據(jù)酶與底物專(zhuān)一結(jié)合的原理，設(shè)計(jì)配基，使其能專(zhuān)一與酶結(jié)合，再與惰性載體連接，制成親和層析柱。效率特別高。如伴刀豆球蛋白A的純化，伴刀豆球蛋白A對(duì)葡萄糖有專(zhuān)一性親和吸附，將葡萄糖連接到瓊脂糖凝膠上，再行純化。CH2CH2CH2被吸附的蛋白質(zhì)分子瓊脂糖顆粒特異的配體連接臂第103頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天交聯(lián)殼聚糖接枝L-Hyp親和吸附樹(shù)脂羥脯氨酸（L-Hyp）是合成治療皮膚病、關(guān)節(jié)炎、腫瘤、減肥及促進(jìn)傷口愈合等藥物的原料，需求量不斷增加。目前的生產(chǎn)方式：以離子交換樹(shù)脂從酸水解膠原蛋白液中分離、洗脫結(jié)晶制得。離子交換分離精度低，需多根樹(shù)脂柱連續(xù)分離才能獲得產(chǎn)品，產(chǎn)生大量含氨基酸的洗脫廢液。第104頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天殼聚糖及其交聯(lián)微球制備殼聚糖分子：以氫鍵連接，比表面積小，傳質(zhì)阻力大，機(jī)械強(qiáng)度低交聯(lián)殼聚糖微球：席夫鍵連接，布滿(mǎn)微孔，傳質(zhì)阻力小，適當(dāng)機(jī)械強(qiáng)度。第105頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天第106頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天第107頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天第108頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天親和分離氨基酸對(duì)L-Hyp0.58mmol/g，對(duì)Pro0.24mmol/g動(dòng)態(tài)吸附交換容量0.58mmol/g，對(duì)Gly、Phe、Pro動(dòng)態(tài)交換容量依次為0.09、0.08、0.24mmol/g，基本不交換其它氨基酸，可以一次性獲得以Hyp和Pro兩氨基酸為主的混合物。第109頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天第110頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天第111頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天第112頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天第113頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天⑷高效（壓）液相色譜（HPLC）快速、靈敏、分辨率高、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)。⑸疏水色譜使用疏水凝膠作分離介質(zhì)，高濃度鹽情況下，蛋白質(zhì)疏水性增加，與疏水介質(zhì)結(jié)合。然后逐漸降低鹽濃度，不同蛋白質(zhì)因疏水性不同依次被洗脫而達(dá)到純化目標(biāo)。第114頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天反膠束萃取蛋白質(zhì)反膠束(reversemicelles):表面活性劑在有機(jī)溶劑中形成的內(nèi)核含微量水分的納米級(jí)球形體。反膠束的形態(tài)：球形或近似球形，也有呈柱狀。極性核(polarcore):表面活性劑分子自組裝形成的親水性?xún)?nèi)環(huán)境。微水相或“水池”(waterpool)：反膠束內(nèi)溶解的水。

第115頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天A

B

第116頁(yè),共128頁(yè)，2024年2月25日，星期天基本性質(zhì)內(nèi)水池直徑d：反膠束的大小與溶劑和S的種類(lèi)與濃度、溫度、I等因素有關(guān)，一般為5-20nm，d用下式計(jì)算：

Wo水與S的摩爾比，M-水分子質(zhì)量；asurf-界面面積；N-阿弗加德羅常數(shù)。內(nèi)水的性質(zhì)：微水相的水分子受S親水基團(tuán)的強(qiáng)烈束縛,表觀(guān)粘度上升50倍,疏水性也極高。隨W0的增大,這些現(xiàn)象逐漸減弱,當(dāng)W0>16時(shí),微水相的水與正常的水接近,反膠團(tuán)內(nèi)可形成雙電層。