培養(yǎng)細(xì)胞的生長

培養(yǎng)細(xì)胞的生長Steadyandcontractedbusinesssummary20183傳代培養(yǎng)和細(xì)胞系的維持培養(yǎng)細(xì)胞增殖長滿瓶壁時，既達(dá)到所謂的飽和密度。此時正常細(xì)胞則不再生長；惡性細(xì)胞重疊生長，易于從瓶壁上成片脫落,，為此傳代勢在必行。培養(yǎng)細(xì)胞的生長過程1）原代（初代）培養(yǎng)期：從機(jī)體取下組織培養(yǎng)到第一次傳代，此代細(xì)胞保持異質(zhì)性，細(xì)胞種類較多，接近原組織細(xì)胞種類。維持時間，因細(xì)胞種類不同，一般1-4周。2）傳代期培養(yǎng)：初代培養(yǎng)的細(xì)胞生長到一定程度，即可連接傳代，使其連續(xù)生長。一般正常二倍體細(xì)胞，不加附加條件，可傳代30-50代，此時可發(fā)生染色體丟失、突變、細(xì)胞增殖變慢、停止分裂，進(jìn)入衰退期，我們稱之有限細(xì)胞系。這一轉(zhuǎn)折點(diǎn)有人稱之危象臨界點(diǎn)（crisis）有些細(xì)胞的少數(shù)后代，或通過人工條件轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可通過這一期，獲得持久的增殖傳代能力，我們稱細(xì)胞系，或無限細(xì)胞系，即一般通稱的細(xì)胞系。（3）衰退期：傳代細(xì)胞到達(dá)一定代數(shù)，即發(fā)生增殖緩慢，逐漸停止，進(jìn)而發(fā)生衰退、死亡，多數(shù)傳代細(xì)胞（或叫有限細(xì)胞系），不能通過所謂的“crisis（危象臨界點(diǎn)），導(dǎo)致最終死亡，這一現(xiàn)象可能說明生物學(xué)衰老的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。人胚胎成纖維細(xì)胞可以進(jìn)行60代增殖，而80歲老人的肺成纖維細(xì)胞僅傳代了16代后便死亡。表皮細(xì)胞壽命4-10天；紅細(xì)胞3周-3個月，白細(xì)胞5-7天，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)年或更多。密度抑制（Densityinhibition）或接觸抑制（Ccontactinhibition）1958年Abercrombie等學(xué)者提出的一種現(xiàn)象，培養(yǎng)細(xì)胞再生長過程中多發(fā)生分裂增殖，細(xì)胞移動而相互靠近，這時某些細(xì)胞可移向其他方向，保證細(xì)胞不會重疊，一但接觸，這種活動即可停止。所謂接觸抑制實(shí)際使細(xì)胞匯合形成單層時，細(xì)胞變得擁擠，與培養(yǎng)液接觸的表面區(qū)域也相應(yīng)減少，營養(yǎng)成分消耗，其分裂也將停止。細(xì)胞生長曲線細(xì)胞數(shù)量生長天數(shù)緩慢生長期對數(shù)生長期平衡期

（1）遲緩期（或延遲期）當(dāng)細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶后，細(xì)胞逐漸貼附于瓶底，并恢復(fù)貼壁形狀，代謝開始旺盛，出現(xiàn)細(xì)胞分裂及增殖，但生長緩慢。

（2）對數(shù)生長期：此期幾乎所有的細(xì)胞都在進(jìn)行分裂，細(xì)胞數(shù)目迅速增長。期細(xì)胞倍增時間（TD）等于細(xì)胞周期時間（TC）長度。這一期常用細(xì)胞倍增時間及細(xì)胞分裂指數(shù)來判定。（3）平衡期（平坦期）這期細(xì)胞數(shù)目雖然在增加，但其增加速度在減慢，直至細(xì)胞數(shù)量不再增加，處于平衡狀態(tài)。

3.1原代細(xì)胞培養(yǎng)的傳代細(xì)胞由培養(yǎng)瓶內(nèi)分離再培養(yǎng)稱之為傳代,進(jìn)行一次分離再培養(yǎng)稱之為傳一代。原代培養(yǎng)的首次傳代是建系的關(guān)鍵時期，細(xì)胞需覆蓋大部分瓶底后再傳代。首次傳代時細(xì)胞接種數(shù)量要多一些，使細(xì)胞能盡快適應(yīng)新環(huán)境而利于細(xì)胞生存和增殖。3.2細(xì)胞傳代方法貼壁生長的細(xì)胞用消化法傳代；部分貼壁生長的細(xì)胞用直接吹打即可傳代；懸浮生長的細(xì)胞采用離心分離后傳代，3.2.1貼壁細(xì)胞傳代步驟吸除瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液；加入1ml消化液；37C或室溫25C消化2~5分鐘顯微鏡下進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大后；直接加少許含血清的培養(yǎng)液，終止消化；細(xì)胞脫離瓶壁后形成細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)，分別接種在新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。3.2.2懸浮細(xì)胞的傳代直接傳代即讓懸浮細(xì)胞慢慢沉淀在瓶底后，將上清洗掉1/2~1/3，然后用吸管吹打形成細(xì)胞懸液后，再傳代。離心法：離心800~1000rpm，5min，除上清，加新的培養(yǎng)液，然后傳代接種。部分貼壁生長細(xì)胞直接吹打傳代或需消化后傳代3.3細(xì)胞系的維持是通過換液、傳代和細(xì)胞凍存實(shí)現(xiàn)的：建立檔案：記錄組織來源，生物學(xué)特性，培養(yǎng)液要求、傳代、換液時間和規(guī)律，細(xì)胞的遺傳學(xué)標(biāo)志，生長形態(tài)，常規(guī)病理染色的標(biāo)本等。3.3細(xì)胞系的維持防細(xì)胞之間的交叉污染，傳代時所用器械要編號或做好標(biāo)記每一種細(xì)胞系都應(yīng)有充足的凍存儲備，以防絕種；另外二倍體細(xì)胞等有限細(xì)胞系如果暫時不用最好凍存以免傳代太多，造成細(xì)胞衰老或發(fā)生改變4.3.4培養(yǎng)細(xì)胞的純化自然純化自然純化即利用某一種類細(xì)胞的增殖優(yōu)勢，而排除其它細(xì)胞生長，靠自然的增殖潛力最后留下生長優(yōu)勢細(xì)胞，去除其它細(xì)胞，達(dá)到細(xì)胞純化的目的。4.3.4.2人工純化利用人為手段造成對某一細(xì)胞生長有利的環(huán)境條件，抑制其它細(xì)胞的生長，從而達(dá)到純化細(xì)胞的目的。3.4.2.1酶消化法酶消化法：由于上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞對胰蛋白酶的耐受性不同,，成纖維細(xì)胞先脫壁，而上皮細(xì)胞要消化相當(dāng)長的時間才脫壁，利用這種差異采用多次差別消化方法將上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分開。3.4.2.2機(jī)械劃除法機(jī)械劃除法：上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞多數(shù)都同時出現(xiàn)，混雜生長常常分區(qū)呈片，采用機(jī)械的方法去除不需要的細(xì)胞區(qū)域，而保留需要的細(xì)胞。3.4.2.3反復(fù)貼壁法成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞相比，其貼壁過程快，大部分細(xì)胞常能在短時間內(nèi)大約10~30min完成附著過程（但不一定完全伸展）；而上皮細(xì)胞大部分細(xì)胞在短時間內(nèi)不能附著或附著不穩(wěn)定，稍加振蕩即浮起，這樣可以利用此差別來純化細(xì)胞3.4.2.4克隆法將細(xì)胞分成單個細(xì)胞，使之分別生長成克隆，然后對每一克隆進(jìn)行測試，選擇出所需要的克隆。3