菊花種質(zhì)資源離體保存技術(shù)規(guī)程

DB32/TXXXX—2019PAGE1菊花種質(zhì)資源離體保存技術(shù)規(guī)程范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了菊花種質(zhì)資源離體保存的術(shù)語和定義、基本要求和常溫生長離體保存、低溫生長離體保存、超低溫離體保存方法及再生與檢測方法等。本標(biāo)準(zhǔn)適用于菊花種質(zhì)資源的離體保存，菊屬其他種質(zhì)資源保存可參照執(zhí)行。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。NY/T1491花卉植物病毒檢測規(guī)程術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1常溫離體保存conservationatroomtemperatureinvitro在常溫（25℃±2℃）下保存正常生長的離體保存物的方式。3.2低溫離體保存conservationatlowtemperatureinvitro通過低溫條件、改變培養(yǎng)基成分或添加抑制型植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)等手段以延緩保存物生長速度的離體保存方式。3.3超低溫離體保存cryopreservation在液氮（-196℃）中保存離體材料，使之代謝和生長基本停止，生物學(xué)狀態(tài)相對穩(wěn)定的離體保存方式。4材料要求4.1基本要求保存的材料應(yīng)符合以下要求：a）用于保存的材料應(yīng)該保證品種純正，來源可靠，基本性狀清楚，且未發(fā)生變異。b)依據(jù)DNY/T1491規(guī)定的方法進行病毒檢測，確保材料不攜帶菊花B病毒（CVB）、番茄不孕病毒（TAV）、菊花矮化類病毒（CSVd）、菊花褪綠斑駁類病毒（CChMVd）等。4.2材料登記要求保存的材料應(yīng)進行信息登記，內(nèi)容包括種質(zhì)名稱或編號、產(chǎn)地或產(chǎn)權(quán)單位（人）、引種情況、保存情況等（見附錄A）。5常溫離體保存保存材料選擇符合4.1條件的材料并按照4.2要求詳細登記，利用生根培養(yǎng)30d左右、生長整齊一致的無菌苗為材料，切割成帶2個～3個節(jié)的莖段供保存。保存容器采用規(guī)格為直徑(18～30)mm×長(160～200)mm的試管，用內(nèi)置硅膠圈的密封塑料蓋或封口膜封口，貼好標(biāo)注保存編號的標(biāo)簽。保存條件MS培養(yǎng)基均附加0.3mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、30g/L蔗糖和7g/L瓊脂，pH6.0。置于溫度（25±2）℃、光照強度2000lx～3000lx、光照時間12h/d的條件下培養(yǎng)。每管加培養(yǎng)基15mL～25mL。保存數(shù)量每份種質(zhì)5管以上，每管1個～2個莖段。繼代時間視不同種質(zhì)的生長速度，每2個～3個月繼代1次。技術(shù)指標(biāo)變異率≤2%；無菊花B病毒（CVB）、番茄不孕病毒（TAV）、菊花矮化類病毒（CSVd）、菊花褪綠斑駁類病毒（CChMVd）。6低溫離體保存6.1保存材料同5.1。6.2保存容器同5.2。6.3保存條件根據(jù)種質(zhì)特點，下列兩種方法可以選用一種:減少培養(yǎng)基養(yǎng)分水平法：低溫（5±2）℃下，1/4MS或1/2MS+0.3mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂，該方法適宜地被、盆栽型菊花種質(zhì)資源。添加抑制型植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)法：低溫（5±2）℃下，MS+0.3mg/6-BA+0.1mg/LNAA+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂，培養(yǎng)基中添加20mg/L～80mg/LABA，或者15g/L～20g/L甘露醇；地被、盆栽型資源宜添加低劑量ABA或甘露醇，切花型資源宜采用較高劑量。保存數(shù)量同5.4。繼代時間視不同種質(zhì)的生長速度，每8個～12個月繼代1次。6.6技術(shù)指標(biāo)變異率≤2%；無菊花B病毒（CVB）、番茄不孕病毒（TAV）、菊花矮化類病毒（CSVd）、菊花褪綠斑駁類病毒（CChMVd）。7.超低溫離體保存7.1保存材料選擇符合4.1條件的材料并按照4.2要求詳細登記，利用生根培養(yǎng)30d左右、生長整齊一致的無菌苗為材料，切成0.5cm～1cm，含2個以上腋芽，在MS培養(yǎng)基附加30g/L蔗糖和7g/L瓊脂，pH6.0，溫度（25±2）℃、光照強度2000lx～2500lx、光照時間16h/d，培養(yǎng)2w～3w。7.2保存容器采用規(guī)格為直徑(15～20)mm×長(120～160)mm試管，用內(nèi)置硅膠圈的密封塑料蓋，貼好標(biāo)注保存編號的標(biāo)簽。7.3分離莖尖在無菌條件下，通過解剖鏡逐層剝?nèi)ネ鈱尤~片,切取1mm～2mm大小的莖尖。7.4保存數(shù)量每份種質(zhì)5管以上，每管8個～10個莖尖。7.5預(yù)培養(yǎng)莖尖分別接種到含0.4mol/L蔗糖濃度的MS培養(yǎng)基內(nèi)，4℃暗培養(yǎng)3d。7.6裝載將無菌棉紙放置在培養(yǎng)皿中，用裝載溶液(附錄B)濕潤。將8個～10個菊花莖尖包在棉紙中，迅速浸入裝載溶液中，室溫（25±2）℃下暗處理30min，取出后用無菌濾紙吸去多余裝載液。7.7脫水將包有莖尖的棉紙團轉(zhuǎn)入玻璃化保護劑PVS2（附錄B），冰浴條件下處理15min。7.8冷凍保存將脫水（玻璃化）處理后包有莖尖的棉紙團轉(zhuǎn)移至裝有預(yù)冷新鮮玻璃化試劑PVS2的冷凍管中,密封塑料蓋并用封口膜封口，迅速投入液氮中保存。7.9技術(shù)指標(biāo)凍后再生率≥20%，變異率≤1%；無菊花B病毒（CVB）、番茄不孕病毒（TAV）、菊花矮化類病毒（CSVd）、菊花褪綠斑駁類病毒（CChMVd）。8.再生與檢測8.1超低溫保存材料的再生8.1.1化凍在無菌條件下，快速將冷凍管從液氮轉(zhuǎn)移至40℃水浴中，劇烈震蕩120s。然后將包有莖尖的棉紙團從冷凍管取出，在經(jīng)滅菌的干燥濾紙放置30s。8.1.2卸載將化凍后包有莖尖的棉紙團轉(zhuǎn)移到卸載液（附錄B），室溫（25±2）℃下放置10min，中間5min時換一次卸載液。然后將棉紙團展開，莖尖在卸載液中懸浮5min。8.1.3再生用含蔗糖1.2mol/L的MS液體培養(yǎng)基洗滌20min,濾紙吸干后接種到含0.1mg/LBA和0.01mg/LNAA的MS固體或半固體培養(yǎng)基中,在（25±2）℃條件下暗培養(yǎng)或弱光培養(yǎng)1d～3d后轉(zhuǎn)入正常光照培養(yǎng)條件下培養(yǎng)2-3周。8.2檢測8.2.1病毒檢測保存再生后代的病毒檢測按照NY/T1491的方法進行。8.2.2變異率檢測取定植2個月后植株心葉，CTAB法提取DNA，采用20.0μLPCR反應(yīng)體系，包括10×Buffer2.0μL，5mmol/LMg2＋1.5μL，10mmol/LdNTPMixture0.8μL，5U/μlTaq酶0.2μL，20μmol/LISSR隨機擴增引物0.5μL，ddH2O13.0μL，模板DNA2.0μL。所用的擴增反應(yīng)程序為95℃預(yù)變性5min，94℃變性45s；53℃復(fù)性40s；72℃延伸70s，45個循環(huán)，72℃延伸7min，最后4℃保存。電泳結(jié)束后凝膠成像系統(tǒng)分析儀中觀察并拍照，比較離體保存苗與對照苗的條帶差異。附錄A（資料性附錄）菊花種質(zhì)資源離體保存登記表表A.1菊花種質(zhì)資源離體保存登記表種質(zhì)名稱或編號（中文）種質(zhì)名稱或編號（英文）其他名稱原產(chǎn)地或引種單位產(chǎn)權(quán)單位（人）來源地或引種單位引種人引種時間引種數(shù)量采集號或引種號保存號保存方法保存時間保存數(shù)量保存者繼代次數(shù)繼代時間保存數(shù)量操作人附錄B（資料性附錄）菊花種質(zhì)超低溫離體保存溶液的配制B.1裝載液MS培養(yǎng)基＋184ml/L甘油＋137g/L蔗糖，pH5.8，0.22μm濾膜過濾滅菌。B.2