P1-3定量分析及其方法驗證

P1-3定量分析及其方法驗證主講教師孫清榮教學目標知識目標：了解定量分析的方法，了解標準品和對照品的使用方法；掌握藥物的分析中常用的分析方法及其原理：包括重量法、非水滴定法、沉淀滴定法、還原糖測定、凱氏定氮法等；掌握精密度和準確度的計算方法，以及在數(shù)據(jù)處理中的重要作用；掌握回收率的含義及計算方法，了解回收率在藥物分析中的作用；了解分析方法的驗證的8個方面。掌握絕對誤差和相對誤差的含義；掌握提高分析結(jié)果準確度的方法；掌握有效數(shù)字的概念及其運算法則；系統(tǒng)誤差和偶然誤差、準確度和精密度的含義；誤差的減免方法，有效數(shù)字的取舍，可疑數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)的處理等基本方法。技能目標：了解定量分析的方法，了解標準品和對照品的使用方法；掌握藥物的分析中常用的分析方法及其操作技能；掌握精密度和準確度的計算方法，以及在數(shù)據(jù)處理中的重要作用；掌握回收率的含義及計算方法，了解回收率在藥物分析中的作用；了解分析方法的驗證的8個方面。掌握絕對誤差和相對誤差的含義；掌握提高分析結(jié)果準確度的方法；掌握有效數(shù)字的概念及其運算法則；掌握系統(tǒng)誤差和偶然誤差、準確度和精密度的含義；誤差的減免方法，掌握有效數(shù)字的取舍，可疑數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)的處理等基本方法。

藥品檢驗工作的基本程序有取樣、鑒別、檢查、含量（效價）測定、和出具檢驗報告等。藥品檢驗是藥品質(zhì)量控制的一個重要環(huán)節(jié)。藥品檢驗工必須具有堅實的藥物檢驗的理論基礎(chǔ)和熟練的實驗操作技能，認真負責的工作態(tài)度以及嚴謹求實的工作作風，才能做好藥品檢驗工作，保證檢驗結(jié)果的正確性，可靠性。藥物檢驗的程序一、藥物的取樣任何藥品的檢驗工作首先都是進行取樣，取樣時應(yīng)具有科學性、真實性和代表性，否則，藥品檢驗工作就失去了意義。樣品的取用量應(yīng)符合藥品質(zhì)量標準的要求。取樣應(yīng)遵循均勻、合理的原則。鑒別是采用化學法、物理法及生物學方法來確證生物藥物的真?zhèn)?。通常需用標準品或?qū)φ掌吩谕粭l件下進行對照試驗，依據(jù)藥物的化學結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，測定某些理化常數(shù)或光譜特征，來判斷藥物及其制劑的真?zhèn)巍Ｍǔ?，一項鑒別試驗只能反映藥物某一方面的特征，因此藥物的鑒別需要由一組鑒別實驗來全面評價，才能保證鑒定結(jié)論的可靠性。常用的鑒別方法有：化學反應(yīng)法、紫外分光光度法、酶法、電泳法、生物法等。二、藥物的鑒別

藥物在生產(chǎn)和貯藏過程中會引入雜質(zhì)，在不影響療效及人體健康的原則下，可以允許適度的雜質(zhì)存在。藥物的雜質(zhì)檢查就是檢查藥物在生產(chǎn)和貯存過程中引入的雜質(zhì)是否超過規(guī)定的限量，以判斷藥物的純度是否符合限量規(guī)定要求。藥物的雜質(zhì)檢查通常按照藥品質(zhì)量標準規(guī)定的項目進行“限度檢查”。藥物的雜質(zhì)檢查又分為一般雜質(zhì)檢查和特殊雜質(zhì)檢查，后者主要是指從生產(chǎn)過程中引入或原料中帶入的雜質(zhì)。三、藥物的檢查生物藥物的檢查生物藥物由于其制備和使用的特殊性，還應(yīng)保證符合無毒、無菌、無熱原、無致敏原和降壓物質(zhì)等一般安全性要求，對于生物藥物還需要進行下列安全性檢查：

（1）異常毒性試驗

是用一定劑量的藥物按指定的操作方法和給藥途徑給予規(guī)定體重的某種試驗動物，觀察其急性毒性反應(yīng)。反應(yīng)的判斷以試驗動物死亡與否為終點。（2）無菌檢查

無菌檢查法是檢查藥品及敷料是否染有活菌的一種方法，是藥典中較重要的檢查項目之一。由于許多生物藥物是在無菌條件下制備的，且不能高溫滅菌，因此無菌檢查就更有必要。

（3）熱原檢查

本法是將一定劑量的供試品，靜脈注入家兔體內(nèi)（家兔法），以其體溫升高的程度，判定該供試品中所含熱原是否符合規(guī)定，是一種限度試驗法。（4）過敏試驗

過敏試驗是檢查異性蛋白的試驗。藥物中若夾雜有異性蛋白，在臨床使用時易引起病人多種過敏反應(yīng)，因此，有可能存在異性蛋白的藥物應(yīng)作過敏試驗。（5）降壓物質(zhì)檢查

降壓物質(zhì)是指某些藥物中含有的能導(dǎo)致血壓降低的雜質(zhì)，包括組胺、類組胺或其他導(dǎo)致血壓降低的物質(zhì)。中國藥典采用貓（或狗）血壓法檢查藥物中所含的降壓物質(zhì)。此外，某些生物藥物還需要進行藥代動力學和毒理學（致突變、致癌、致畸等）的研究。四、藥物的含量（效價）測定含量測定就是測定藥物中主要有效成分的含量。通常采用化學分析法、儀器分析法或生物學的方法進行測定，以確定藥物的含量是否符合藥品標準的規(guī)定要求。生物藥物的含量表示方法通常有兩種：一種用百分含量表示，適用于結(jié)構(gòu)明確的小分子藥物或經(jīng)水解后變成小分子的藥物；另一種用生物效價或酶活力單位表示，適用于多肽、蛋白質(zhì)和酶類等藥物。 判斷一個藥物的質(zhì)量是否符合要求，必須全面考慮鑒別、檢查與含量測定三者的檢驗結(jié)果。五、檢驗報告的書寫在藥品檢驗中應(yīng)作好原始記錄并寫出檢驗報告。原始記錄應(yīng)整潔、真實、具體。作為分析檢驗的第一手資料，原始數(shù)據(jù)不能任意涂改，應(yīng)妥善保存，備查。若寫錯原始數(shù)據(jù)時，應(yīng)在錯誤的地方劃上單線或雙劃線，在旁邊改正重寫，并簽名蓋章。檢驗記錄的內(nèi)容和記錄順序如下：1.品名、規(guī)格、批號、數(shù)量、來源、檢驗依據(jù)；2.取樣日期、檢驗日期；3.檢驗項目、數(shù)據(jù)、結(jié)果、計算；4.判定；5.檢驗人、復(fù)核人簽名或蓋章檢驗完畢后，應(yīng)根據(jù)檢驗結(jié)果寫出檢驗報告。檢驗報告書的內(nèi)容如下：1.品名、規(guī)格、批號、數(shù)量、來源、檢驗依據(jù)；2.取樣日期、報告日期；3.檢驗結(jié)果；4.結(jié)論；5.檢驗人、復(fù)核人、負責人簽名或蓋章檢驗報告是對藥品質(zhì)量檢驗結(jié)果的證明書，判定必須明確、肯定有依據(jù)，檢驗報告上的簽章又寫全名，否則檢驗報告無效。對于不符合規(guī)定的藥品，在完成藥品檢驗工作，寫出書面報告后，還應(yīng)提出處理意見，以便供有關(guān)部門參考，并盡快地使藥品的質(zhì)量符合要求。藥物定量分析與分析方法驗證一、標準品與對照品

國家藥品標準品、對照品系指國家藥品標準中用于鑒別、檢查、含量測定、雜質(zhì)和有關(guān)物質(zhì)檢查等標準物質(zhì)，均由國務(wù)院藥品監(jiān)督管理部門指定的單位制備、標定和供應(yīng)。它是國家藥品標準不可分割的組成部分。國家藥品標準物質(zhì)是國家藥品標準的物質(zhì)基礎(chǔ)，它是用來檢查藥品質(zhì)量的一種特殊的專用量具；是測量藥品質(zhì)量的基準；也是作為校正測試儀器與方法的物質(zhì)標準；在藥品檢驗中，它是確定藥品真?zhèn)蝺?yōu)劣的對照，是控制藥品質(zhì)量必不可少的工具。中國藥典凡例中已有明確的定義：對照品系指用于鑒別、檢查、含量測定和校正檢定儀器性能的標準物質(zhì)，而標準品系指用于生物檢定、抗生素或生物藥品中含量或效價測定的標準物質(zhì)，以效價單位(或μg)表示，以國際標準品進行標定；對照品除另有規(guī)定外，按干燥品（無水物）進行計算后使用。

對照品與標準品是兩個不同的概念，在實際工作中常常將這兩個概念混淆。有的藥品既有對照品，又有標準品。例如，當用微生物法測定頭孢克羅效價時，用頭孢克羅標準品，用HPLC或UV法測定時，則用對照品。但是我們不能認為對照品就是標準品，因為即使是同一種物質(zhì)的標準品和對照品，它們的規(guī)格、標定方法以及用途都可能是不同的。如英國Glaxo公司提供的頭孢呋肟酯對照品，HPLC標定為96.9%，供含量測定用；UV為98.8%，供溶出度測定。二、藥物定量分析方法

藥物中有效成分的含量或效價是評價藥品質(zhì)量的主要指標之一。通過對藥物進行定量分析可以確認藥品質(zhì)量的優(yōu)劣。一般來說，藥物定量分析應(yīng)在鑒別無誤、雜質(zhì)限量檢查合格的基礎(chǔ)上采取合適的方法來進行。用化學方法或物理化學方法測定藥物中有效成分的含量，稱為“含量測定”，測定的結(jié)果原料藥用含量百分率表示，制劑用含量占標示量的百分率表示。用生物學方法（包括生物檢定法和微生物檢定法）或酶化學方法測定藥物的效價，稱為“效價測定”，測定結(jié)果一般用效價單位（U）表示。常用生物藥物定量分析方法有滴定分析法、重量分析法、電化學分析法、光學分析法、色譜法等。（一）滴定分析法 滴定分析法是藥物定量分析中應(yīng)用最多的分析方法，它是通過用已知準確濃度的標準溶液通過滴定管滴加到待測溶液中，直至化學反應(yīng)按計量關(guān)系完全作用為止，根據(jù)滴定終點時消耗標準溶液的體積和濃度以及標準物質(zhì)和測定組分之間滴定反應(yīng)的摩爾數(shù)的比值，來計算被測組分的含量。滴定分析法具有精密度好，準確度高，操作方便、儀器要求低等特點，相對誤差一般在0.2%以下。 并不是所有的化學反應(yīng)都適用于滴定分析法。凡適用于滴定分析的化學反應(yīng)必須具備以下三個條件：

反應(yīng)必須定量完成，即待測藥物與標準溶液之間的化學反應(yīng)必須嚴格按照一定的化學計量關(guān)系進行，且反應(yīng)完成的程度要達到99.9%以上。反應(yīng)必須迅速完成。對于速度較慢的化學反應(yīng)應(yīng)采取措施（如使用催化劑）提高反應(yīng)速度。必須有適宜的指示劑或其他簡便可靠的方法來指示終點。常用的有中和滴定法、非水溶液滴定法、氧化還原滴定法（亞硝酸鈉滴定法、高錳酸鉀法、亞硝酸鈉滴定法等）、配位滴定法等。在選擇滴定分析方法時，首先應(yīng)根據(jù)藥物的化學結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，選擇適當?shù)姆治龇椒āＨ缢幬锞哂休^強的酸、堿性（其Ka或Kb值大于10-7，可選擇中和滴定法測定。酸、堿性較弱的有機藥物，可采用非水滴定法測定。含有Mg2+、Ca2+、Al3+、Zn2+等金屬離子藥物可選擇配位滴定法.氧化還原滴定法可用于還原性或氧化性的藥物的測定。（二）重量分析法

重量分析法是以質(zhì)量為測量值的分析方法。測定時一般先采用適當?shù)姆椒ǎ箿y定組分與試樣中其它組分分離，然后轉(zhuǎn)化為一定的稱量形式，稱重，從而求得該組分含量的方法。重量分析法由于可以直接利用分析天平的稱量而獲得分析結(jié)果，而在分析過程中不需要基準物質(zhì)進行比較，也沒有由于容量器皿而引入的數(shù)據(jù)誤，故在測量時精密度好、準確度高，但操作繁瑣、費時，對于低含量組分的測定誤差較大，一般僅在無合適的滴定分析法測定含量時使用。

重量分析法一般可分為揮發(fā)法、萃取法和沉淀法。采用重量分析法對藥物進行定量分析時應(yīng)先確定稱量形式的組成，以及分離、純化、干燥的條件，并給出換算因數(shù)，作為計算結(jié)果的依據(jù)。（三）電化學分析法

電化學分析法是利用電化學原理進行藥物定量分析的方法。在分析時，通常是將藥物配制成相應(yīng)的溶液，再根據(jù)其電化學性質(zhì)，選擇適當?shù)碾姌O組成化學電池，通過測量電池的某種電信號（如電壓、電流、電阻、電量等）的強度或變化，對被測藥物進行定量分析。

電化學分析法可粗略分為電解法、電導(dǎo)法、電位法和伏安法四類。

（四）光學分析法

光學分析法是根據(jù)藥物發(fā)射的電磁輻射或物質(zhì)與輻射的相互作用建立起來的一類藥物的定量分析方法。常用于定量的光學分析法有比色法、紫外-可見分光光度法、熒光分析法和原子吸收分光光度法。1.比色法被測藥物或其溶液本身沒有顏色，在一定條件下與試劑反應(yīng)或經(jīng)處理產(chǎn)生顏色，與相同條件下顯色的對照品溶液比較顏色的深淺，從而進行定量分析。比色法其原理實質(zhì)就是利用顏色對光輻射的吸收不同來進行定量的，該方法的專屬性較強，但操作較為繁瑣，往往在不能采用紫外-可見分光光度法測定時才考慮選用。如蛋白質(zhì)的含量測定、硫酸軟骨素的含量測定都是利用的比色法。2.紫外-可見分光光度法利用藥物在紫外-可見光區(qū)分子吸收光譜來進行定量分析的方法稱為紫外-可見分光光度法。本法具有靈敏度較高、準確度較高、精密度較好、操作簡便、快速等優(yōu)點。定量分析時不僅可以進行單一組分的測定，而且可以對多種混合組分不經(jīng)分離進行同時測定，多用于微量和痕量組分的定量分析。3.熒光分析法某些藥物受到特定波長的光的激發(fā)產(chǎn)生熒光，根據(jù)熒光譜線的強度進行藥物含量測定的方法稱為熒光分析法。由于天然熒光的藥物數(shù)量不多，故本法的應(yīng)用不如紫外分光光度法廣泛但由于本法的專屬性比紫外-可見分光光度法高，測定的靈敏度高（可達到10-12g/ml），許多重要的生化物質(zhì)、藥物都有熒光現(xiàn)象，因此本法在藥物分析中有著特殊的重要性。4．原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法是基于蒸汽相中被測元素的基態(tài)原子對其原子共振輻射的吸收來測定該樣品中該元素含量，以此來進行藥物定量的分析方法。一般來說當含金屬元素的藥物沒有更簡便、可靠的定量方法時，可選用本法測定。本法的專屬性、靈敏度均較高。（五）色譜法色譜法是利用藥物在流動相與固定相之間的分配系數(shù)差異而實現(xiàn)分離，然后對各個組分逐一進行分析的方法。和前面所述分析方法相比，色譜法顯著的特點是具有分離和定量檢測兩種功能。這種方法具有高靈敏度，高選擇性，高效能，分析速度快及應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點。特別適用于抗生素、生化藥品的定量分析。藥物定量分析中使用的色譜法主要有高效液相色譜法、氣相色譜法和薄層色譜法等。薄層色譜法主要用于一些組成復(fù)雜，又不能采用其它方法進行含量測定的中藥制劑，經(jīng)薄層分離后，采用薄層掃描法進行含量測定。氣相色譜法主要用于一些揮發(fā)性較大的藥物的含量測定。在藥物的含量測定中，高效液相色譜法是最廣泛應(yīng)用的方法。高效液相色譜法測定藥物的含量時，首先需建立藥物與其它組分的色譜分離條件。對不具有酸、堿性的有機藥物，可采用一般的反相高效液相色譜法測定；對具有弱酸、弱堿性的有機藥物，可選擇離子抑制或離子對高效液相色譜法；對強酸、強堿等離子型藥物，一般只能采用離子對高效液相色譜法或離子交換高效液相色譜法。吸附色譜使用有機溶劑作流動相，主要適用于難溶于水的藥物以及一些含有脂溶性基質(zhì)制劑的含量測定。（六）其它測定方法除上述化學和物理化學方法外，在藥物含量測定中還應(yīng)用微生物檢定法（用于抗生素的含量測定）、生物檢定法（用于活性成分復(fù)雜且來源于生物體的藥物）和酶分析法（用于酶類藥物的測定），這些方法在本書其他章節(jié)中有詳細介紹，在此不再贅述。三、藥物分析方法驗證分析方法必須滿足一定的要求，才能保證分析結(jié)果的可靠性，才能確保藥品的質(zhì)量。因此，對于新建立的藥物分析方法，必須進行驗證。藥物分析方法驗證的目的是證明采用的方法適合于相應(yīng)檢測要求?！吨袊幍洹窂?000年版起，開始收載了“藥品質(zhì)量標準分析方法驗證的指導(dǎo)原則”。指導(dǎo)原則要求：在起草藥品質(zhì)量標準時，藥物分析方法需經(jīng)驗證；在藥物生產(chǎn)工藝變更、制劑的組分改變、或?qū)υ治龇椒ㄟM行修訂時，需要對質(zhì)量標準分析方法進行驗證。驗證的內(nèi)容驗證的內(nèi)容有：準確度、精密度（包括重復(fù)性、中間精密度和重現(xiàn)性）、專屬性、檢測限、定量限、線性、范圍和耐用性等。（一）準確度(accuracy)準確度是指該分析方法所得的測定結(jié)果與真實值或參考值接近的程度，表示分析方法測量的正確性，通常采用回收率（%）表示。準確度應(yīng)在規(guī)定的范圍內(nèi)建立。原料藥定量分析方法驗證時，可用已知純度的對照品或樣品進行測定，或用本法所得結(jié)果與已知準確度的另一方法測定的結(jié)果進行比較，看是否一致。制劑定量分析方法一般用回收試驗來驗證。通常將已知量被測藥物加入到處方比例的輔料中，照驗證的方法進行測定，根據(jù)測定的結(jié)果計算回收率。對于一些生物藥物，如不能得到制劑的全部組分，常用標準添加法來計算回收率，即將已知量的被測藥物加入一定量已知含量的樣品中，照驗證的方法進行測定，根據(jù)測定的結(jié)果計算回收率。（二）精密度（precision）精密度系指在規(guī)定的測試條件下，同一個均勻樣品，經(jīng)多次取樣測定所得結(jié)果之間的接近程度。精密度一般用偏差、標準偏差（SD）或相對標準偏差（RSD）表示。

若對同一樣品重復(fù)測定了n次，第i次的測定結(jié)果為xi,測定結(jié)果的平均值為，則標準偏差的計算公式為：

由于SD的大小與所使用的單位以及測定結(jié)果數(shù)值的大小有關(guān)，所以常常使用相對標準偏差來表示精密度。其計算公式為：

含量測定和雜質(zhì)定量測定應(yīng)考慮方法的精密度。1．重復(fù)性在相同條件下，由一個分析人員測定所得結(jié)果的精密度稱為重復(fù)性；考察重復(fù)性時，可在規(guī)定范圍內(nèi)設(shè)計高、中、低三種濃度，每個濃度測3次，用至少9次測定結(jié)果進行評價，或把被測物濃度當作100%，用至少測定6次的結(jié)果進行評價。2．中間精密度在同一個實驗室，不同時間由不同分析人員用不同設(shè)備測定結(jié)果的精密度，稱為中間精密度；中間精密度試驗用于考察隨機變動因素（不同日期、不同分析人員、不同設(shè)備）對精密度的影響。

3．重現(xiàn)性在不同實驗室由不同分析人員測定結(jié)果的精密度，稱為重現(xiàn)性。當分析方法將被法定標準采用時，應(yīng)進行重現(xiàn)性試驗。如建立藥典分析方法時通過協(xié)同檢驗得出重現(xiàn)性結(jié)果，協(xié)同檢驗的過程、重現(xiàn)性結(jié)果均應(yīng)記載在起草說明中。偏差、標準偏差（SD）或相對標準偏差（RSD）越小，說明測定結(jié)果越集中，精密度越好。方法的精密度好是保證準確度高的先決條件，但方法的精確度好，準確度并不一定高。只有在消除了系統(tǒng)誤差的情況下，精密度好，準確度也才高。換句話說，準確度表示測量結(jié)果的正確性，精確度表示測量結(jié)果的重現(xiàn)性或再現(xiàn)性。（三）專屬性（specificity）專屬性系指在其他成分（如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等）可能存在下，采用的方法能準確測定出被測物的特性。原料藥中常含有雜質(zhì)，如合成的原料、中間體、副產(chǎn)物以及降解產(chǎn)物等，制劑中則含有輔料，分析方法的專屬性高，就可以排除這些干擾組分的影響，準確地測定被測組分?？疾旆治龇椒ǖ膶傩?，可以用驗證的分析方法，分別測定加有干擾組分的樣品和未加干擾組分的樣品，并對二者的測定結(jié)果加以比較。也可用驗證的方法和公認專屬性強的分析方法（如色譜法），對同一樣品進行分析后比較，以對驗證方法的專屬性進行評價。如方法不夠?qū)?，?yīng)采用多個方法予以補充。（四）檢測限（limitofdetectionLOD）檢測限系指分析方法在規(guī)定的實驗條件下試樣中被測物能被檢測出的最低量，當被測組分的量高于檢測限時，可以被此分析方法檢測出來，但不一定能準確測定。1．目視法目視法可用于非儀器分析的方法檢測限的確定。即用已知濃度的測定物，試驗出能被可靠地檢測出的最低濃度或最低量。如在薄層色譜中，通過在薄層板上點加不同濃度的供試品溶液，相同條件下展開后，目視，以可觀察的最低濃度作為檢測限。2．信噪比法信噪比法用于能顯示基線噪音的分析方法檢測限的確定。即把已知低濃度試樣測出的信號與空白樣品測出的結(jié)果進行比較，按信（號）噪（音）（S/N）比算出能被可靠地檢測出的最低濃度或量。檢測限的確定因分析方法的類型不同而異。對儀器分析方法，一般以信噪比為3：1或2：1時相應(yīng)濃度或注入儀器的量確定檢測限。也可以通過重復(fù)測定空白樣品的背景信號4-6次，計算此背景信號的標準差S，以2S或3S來估算檢測限。

檢測限確定后，還要配制接近檢測限或檢測限濃度的樣品，按考察方法分析，對確定的限度進行驗證。（五）定量限（limitofquantitationLOQ）定量限是指樣品中被測物能被定量測定的最低量，其測定結(jié)果應(yīng)具備一定的準確度和精密度。雜質(zhì)和降解物用定量測定方法分析時，應(yīng)確定定量限。定量限與檢測限的區(qū)別在于，它所規(guī)定的最低濃度，應(yīng)滿足一定的精密度和準確度的要求。對非儀器分析方法，定量限可用類似檢測限的方法來確定。對儀器分析方法，定量限常用信噪比法來確定。一般信噪比為10：1時相應(yīng)的濃度或注入儀器的量進行確定。也可用空白信號的標準差（或噪音）乘以10，作為定量限的估計值。定量限確定后，也需要配制接近定量限濃度的樣品溶液，按考察方法分析，考察其精密度和準確度，對確定的限度進行驗證。（六）線性（linearity）

線性是指在設(shè)計的范圍內(nèi)，測試結(jié)果與試樣中被測組分的濃度（或量）直接呈正比關(guān)系的程度。在藥物分析中，很多檢測結(jié)果在理論上與測定組分的濃度（或量）有線性關(guān)系，線性方程一般為Y=a+bX

。相關(guān)系數(shù)r越接近于1，說明兩個變量的線性越好。r值的大小受測定中偶然誤差的影響，不同的方法對r值的要求不同，如色譜法，一般可達到0.999以上。幾乎所有生物藥物定量分析方法都必須考察線性關(guān)系，線性關(guān)系的考察方法應(yīng)與定量分析所采用的分析方法完全一致?？疾炀€性關(guān)系時通常可用一貯備液經(jīng)精密稀釋，或分別精密稱樣，制備一系列具有一定濃度梯度的5-8個樣品溶液進行測定，以測得的相應(yīng)信號作為被測物濃度的函數(shù)作圖，觀察是否呈線性，再用最小二乘法進行線性回歸。求得相關(guān)系數(shù)r和a、b的值，必要時，相應(yīng)信號可經(jīng)數(shù)學轉(zhuǎn)換，再進行線性回歸計算。（七）范圍（range）

范圍系指在達到一定精密度、準確度和線性的前提下，測定方法適用的高低限濃度或量的區(qū)間。范圍范圍應(yīng)根據(jù)分析方法的具體應(yīng)用和線性、準確度、精密度試驗的結(jié)果和要求確定。原料藥和制劑含量測定，范圍應(yīng)為測試濃度的80%-120%；制劑含量均勻度檢查，范圍應(yīng)為測試濃度的70%-130%，根據(jù)劑型特點，如氣霧劑、噴霧劑，范圍可適當放寬，溶出度或釋放度中的溶出量測定，范圍應(yīng)為限度的±20%；如規(guī)定限度范圍，則應(yīng)為下限的-20%到上限的+20%。用百分歸一化法，則線性范圍應(yīng)為雜質(zhì)規(guī)定限度（或下限）的-20%至含量限度（或上限）的+20%。（八）耐用性（ruggedness）方法的耐用性是指測定條件有小的變動時，測定結(jié)果不受影響的承受程度。方法的耐用性好，意味著該方法對測定條件的要求不苛刻，一定條件在適度范圍內(nèi)的變化對測定的結(jié)果影響不顯著。開始研究分析方法時，就應(yīng)考慮其耐用性。如果測試條件要求苛刻，則應(yīng)在方法中寫明。變動時，方法的適用性典型的變動因素有：被測溶液的穩(wěn)定性，樣品提取次數(shù)、時間等；色譜法中流動相的組成和pH值，不同廠牌或不同批號的同類型的色譜柱，柱溫，流速等。氣相色譜中不同廠牌或不同批號的同類型的色譜柱，固定相，不同類型的擔體，色譜柱，檢測器和進樣器的溫度等。在建立分析方法時，應(yīng)對以上條件進行試驗，說明小的變動能否通過設(shè)計的系統(tǒng)適用性試驗，以確保方法有效。

對分析方法進行驗證時，不同的檢驗項目對方法驗證指標的要求有所不同。不同檢驗項目對驗證指標的要求見表2-3：表2-3不同檢驗項目對驗證指標的要求驗證指標鑒別定量測定限量檢查含量測定準確度－＋－＋精密度－＋－＋專屬性＋＋＋＋檢測限－－＋－定量限－＋－－線性－＋－＋范圍－＋－＋耐用性＋＋＋＋第四節(jié)誤差及數(shù)據(jù)處理一、誤差及消除測定值х與真實值μ相接近的程度，它說明測定值的正確性，常用誤差的大小來衡量。誤差一般用絕對誤差和相對誤差來表示。

絕對誤差

絕對誤差δ表示測定值х與真實值μ之差，即

δ=х-μ由上式可見，絕對誤差是以測量值的單位相同，其值可正可負，值為正時，表示測量值大于真值，稱為正誤差，值為負時，表示測量值小于真值，稱為負誤差。絕對誤差越小，測定值與真實值越接近，測定結(jié)果越準確。絕對誤差絕對誤差相對誤差但是，用絕對誤差的大小來衡量測定結(jié)果的準確度，有時并不明顯，因為它沒有和測定過程中所取試樣的數(shù)量多少聯(lián)系起來。通常把絕對誤差在真實值中所占的比例稱為相對誤差，通常以百分率（%）來表示，即相對誤差也有正值和負值之分，正值表示分析結(jié)果偏高，負值表示分析結(jié)果偏低由于相對誤差能夠反映誤差在真實值中所占的比例，故常用相對誤差來表示或比較各種情況下測定結(jié)果的準確度。

例，用分析天平稱量兩個樣品，稱量結(jié)果如表2-4所示：稱量值（g）真實值（g）絕對誤差（g）相對誤差（%）4.14354.1437-0.0002-0.0050.00320.0034-0.0002-6表2-4某分析天平稱量結(jié)果表

由此例可看出，雖然測量的絕對誤差都是-0.0002g，但由于兩個樣品的稱量值大小不同，相對誤差卻相差很多，真實值小的相對誤差比真實值大的大得多。

在定量分析中，由于受到分析方法、測量儀器、試劑及分析人員主觀條件等主客觀因素的限制，使得測量值與真實值不可能完全一致；即便是技術(shù)嫻熟的分析工作者，用最完善的分析方法和最精密的儀器，對同一樣品進行多次測定，其結(jié)果也不可能完全一樣。只有通過分析誤差產(chǎn)生的原因，采取有效措施減小誤差，才能提高分析結(jié)果的準確度。

根據(jù)誤差的性質(zhì)和來源不同，誤差可分為系統(tǒng)誤差和隨機誤差兩種類型。

1．系統(tǒng)誤差系統(tǒng)誤差也叫可定誤差，它是由于分析過程中某些固定的、經(jīng)常性的原因所引起的誤差，一般具有固定的方向和大小，多次平行測定中系統(tǒng)誤差會重復(fù)出現(xiàn)，使得測量值總是系統(tǒng)地偏高或偏低，故有可測性。系統(tǒng)誤差和隨機誤差系統(tǒng)誤差主要來自于以下幾個方面：

①方法誤差方法誤差是指在樣品分析時采用了不夠完善的分析方法所造成的誤差。這種誤差與方法本身固有的特性有關(guān)，而與分析者的操作技術(shù)無關(guān)。例如滴定分析中，滴定反應(yīng)不能定量地完成，指示劑所確定的滴定終點與化學計量點不完全相符等，都會使測定結(jié)果有規(guī)律地偏離，產(chǎn)生系統(tǒng)誤差。

②試劑誤差

試劑誤差是指由于試劑或溶劑的純度不夠，所含有的雜質(zhì)能夠干擾樣品的分析而引起的誤差。

③儀器誤差儀器誤差是指由于儀器本身精度不夠或未經(jīng)校準而引起的誤差。例如天平砝碼不準未經(jīng)校正，分析儀器如滴定管、容量瓶、移液管等的刻度值與真實值不相符，都會在分析過程中使測定結(jié)果產(chǎn)生誤差。

操作誤差操作誤差是指分析人員的在正常分析操作過程中所造成的誤差。例如滴定管讀數(shù)偏高或偏低，滴定終點顏色辨別偏深或偏淺等。這種誤差雖然具有一定的主觀性，但也有固定的方向和大小。

上述四種誤差在一個測定過程中可能會同時存在，根據(jù)系統(tǒng)誤差所具有的特性，可以采用對照試驗、加樣回收試驗、空白試驗和校準儀器等方法來消除系統(tǒng)誤差。

①對照試驗

用含量已知的標準試樣或純物質(zhì)作為樣品，在同樣測定條件下，采用與樣品測定相同的分析方法，進行定量分析，分析結(jié)果與已知含量的差值即為分析方法的系統(tǒng)誤差。用此誤差對實際樣品的定量結(jié)果進行校正，便可消除系統(tǒng)誤差。②加樣回收試驗

在沒有標準試樣，又不宜用純物質(zhì)進行對照試驗時，可以向樣品中加入一定量的被測純物質(zhì)，用相同的方法進行定量分析。由分析結(jié)果中被測組分含量的增加值與加入量之差，即可估算出分析結(jié)果的系統(tǒng)誤差。

③空白試驗

在不加試樣的情況下，按照與試樣分析完全相同的操作步驟和條件而進行的測定叫做空白試驗。所得結(jié)果稱為空白值。從樣品的分析結(jié)果中扣除空白值，就可以消除由于環(huán)境、實驗器皿、試劑不純或溶劑干擾等所造成的系統(tǒng)誤差。

④校準儀器

在分析結(jié)果準確度要求較高時，應(yīng)對測量所用儀器如天平、移液管、容量瓶、滴定管等進行校正，并將校正值應(yīng)用到分析結(jié)果的計算中來消除系統(tǒng)誤差。2．隨機誤差

隨機誤差是由一些偶然的、意外的、無法控制的外界因素所引起的誤差。例如測量時環(huán)境溫度、壓力、濕度的波動，操作的細小變化等，使得此次的測量值和真實值不會完全一致，從而帶來隨機誤差。

隨機誤差對測定結(jié)果的影響具有不確定性。往往同一條件下進行多次平行測定所出現(xiàn)的隨機誤差有時正、有時負，其數(shù)值也不固定，有時大、有時小，不可預(yù)測，也難以控制，故該誤差又稱為未定誤差。這類誤差是不可避免又無法校正的。隨機誤差的出現(xiàn)表面上似乎無規(guī)律可尋，但是經(jīng)消除系統(tǒng)誤差以后，對同一試樣在同一條件下進行多次重復(fù)測定，并將測定的數(shù)據(jù)用數(shù)理統(tǒng)計的方法進行處理，便可發(fā)現(xiàn)隨機誤差具有以下特點：

①大小相近的正負誤差出現(xiàn)的概率相等，即絕對值相近而符號相反的誤差是以同等機會出現(xiàn)的；②絕對值小的誤差出現(xiàn)的概率大，絕對值大的誤差出現(xiàn)的概率小，絕對誤差很大的誤差出現(xiàn)的概率更小。

可見在消除系統(tǒng)誤差的前提下，只要增加測定次數(shù)，細心操作，則大小相等的正負誤差就可以相互抵消，平均值就接近于真實值。因此，增加測定次數(shù)可以減小隨機誤差。在一般的生物藥品分析測定中，測定次數(shù)為3—4次，基本上可以得到比較準確的分析結(jié)果。

但是，由于分析操作者工作不認真負責，不遵守操作規(guī)程所造成的一些差錯，如儀器未洗凈、加入其他試劑、讀錯刻度值、記錄或計算錯誤等而造成的錯誤結(jié)果，不是偶然誤差，不能通過增加平行測定的次數(shù)減免。因此操作者應(yīng)加強工作責任心，嚴格遵守操作規(guī)程，認真仔細地進行實驗，做好原始記錄，反復(fù)核對，以避免類似錯誤的發(fā)生。二、有效數(shù)字

（一）有效數(shù)字的基本概念有效數(shù)字是指在藥物分析工作中實際上能測量到的有實際意義的數(shù)值。有效數(shù)字反映了測量的準確到了什么程度。從第一位不是零的數(shù)字起，到最后一個數(shù)字至，所有的數(shù)字，就是有效數(shù)字。

在分析工作中記錄測量值時，其數(shù)值位數(shù)必須與所使用的方法及儀器的準確程度相一致，允許誤差相差±1個單位，即可保留一位可疑數(shù)，由可靠數(shù)字和最后一位不確定數(shù)字組成的數(shù)值，即為有效數(shù)字。換句話說，有效數(shù)字為準確數(shù)字加一位可疑數(shù)字，有效數(shù)字只允許末位數(shù)欠準。

例如，用10ml量筒量取10ml溶液，應(yīng)記成10ml，取兩位有效數(shù)字，因為末位上的0是欠準數(shù)字，有±1ml的誤差，這是與量筒量取溶液的準確度相符的。使用10ml移液管量取10ml溶液，應(yīng)記成10.00ml，取四位有效數(shù)字，這是因為移液管可準確到0.01ml。

在十進位數(shù)中，有效數(shù)字系指從非零數(shù)字最左一位向右數(shù)而得到的位數(shù)。數(shù)字“0”既可以是有效數(shù)字，也可以是無效數(shù)字，例如，在數(shù)據(jù)0.04070g中，4后面的兩個0都是有效數(shù)字；而4前面的兩個0都是無效數(shù)字，僅起定位作用；末位0說明該質(zhì)量可準確到十萬分之一克，所以該數(shù)據(jù)是四位有效數(shù)字。

用0定位不便的數(shù)，可以用10的方次表示。例如，0.00002030kg可以表示成2.030×10-5kg仍然是四位有效數(shù)字。很大的數(shù)字也可采取這種表示方法。例如，3500L若為三位有效數(shù)字，則可寫成3.50×103L。對于首位為8或9的數(shù)據(jù)，有效數(shù)字可以多記一位。例如，8.66可以認為是四位有效數(shù)字。對于pH，lgK等對數(shù)數(shù)值的有效數(shù)字的位數(shù)取決于小數(shù)部分數(shù)字的位數(shù)，而整數(shù)部分只代表原值的方次。例如，pH=10.02的有效數(shù)字應(yīng)為兩位。

非連續(xù)型數(shù)值（如個數(shù)、分數(shù)、倍數(shù)、名義濃度或標示量）是沒有欠準數(shù)字的、其有效位數(shù)可視為無限多位；常數(shù)、和等數(shù)值的有效應(yīng)數(shù)也可視為是無限多位。例如含量測定項下“每lml的鹽酸滴定液（0.01mol/L）”中的“1”為個數(shù)，“0.01”為名義濃度，其有效位數(shù)均為無限多位；規(guī)格項下的“0.5g”的“0.5”的有效位數(shù)也均為無限多位。

一般常量分析要求四位有效數(shù)字，以表明分析結(jié)果的準確度是0.1%。如使用計算器，在計算過程中可能保留了過多的位數(shù)，但最后計算結(jié)果仍應(yīng)記成適當位數(shù)以表達應(yīng)有的準確度。變換單位時，要注意有效數(shù)字的位數(shù)不能變。例如，10.00ml應(yīng)寫成0.01000L；2.5g應(yīng)寫面2.5×103mg。（二）有效數(shù)字修約規(guī)則在定量分析過程中，所涉及到的測量數(shù)據(jù)的有效數(shù)字的位數(shù)可能不同，如需運算，應(yīng)按一定的規(guī)則舍棄多余的位數(shù)，稱為數(shù)字修約。數(shù)字修約的基本原則是四舍六入五成雙，而若采用“四舍五入”則會使修約后的數(shù)值偏高，不宜使用。數(shù)字修約規(guī)則如下：

（1）等于或小于4時，舍棄；等于或大于6時，進位。

例如:將數(shù)字5.2814修約成三位有效數(shù)字為5.281，將數(shù)字5.2817修約為兩位有效數(shù)字為5.282。

（2）測量值中被修約數(shù)為5時，若后無數(shù)，則要看進位后測量值末位數(shù)的奇偶，若進位后測量值末位數(shù)為偶數(shù)（2，4，6，8，0），則進位；若為奇數(shù)（1，3，5，7，9），則舍棄。

例如將測量值5.185、5.175、5.205修約為三位數(shù)。

5.185修約為5.18；

5.175修約為5.18；

5.205修約為5.205

（3）若5后還有數(shù)，說明被修約數(shù)大于5，應(yīng)進位。例如將數(shù)字5.2814修約成三位有效數(shù)字為5.281。（4）如果舍棄的數(shù)字不止一位，應(yīng)一次修約至所需位數(shù)，不能分次修約。例如將5.2348修約成兩位有效數(shù)字，不能先修約為5.235,再修約成5.24，只能修約為5.23。

（5）在修約標準偏差時，通常要使其值變得更大一些，即只進不舍。例如某計算結(jié)果的SD為0.312，取兩位有效數(shù)字，宜修約為0.32，取一位則為0.4。（三）有效數(shù)字運算法則

在計算分析結(jié)果時，每個測量值的誤差都要傳遞到分析結(jié)果中，因此，對于有效數(shù)字的運算，必須根據(jù)誤差的傳遞規(guī)律，按照有效數(shù)字的運算法則合理取舍，使各步測量值的誤差對最終分析結(jié)果準確度的影響能夠正確表達。由于加減法與乘除法的誤差傳遞方式不同，因此在運算時遵循的方法也不同。加減法加減法是各數(shù)值絕對誤差的傳遞，所以計算結(jié)果的絕對誤差必須與各數(shù)中絕對誤差最大的那個相當。即有效數(shù)字加減法的計算應(yīng)按照小數(shù)點后位數(shù)最少（即絕對誤差最大）的那個數(shù)保留其他各數(shù)的位數(shù)，然后再相加減。例：計算下列結(jié)果：（1）（2）（3）（4）解：（1）第一式中各數(shù)的絕對誤差相同，計算過程和結(jié)果勿需修約。原始數(shù)值中的兩個數(shù)都有五個有效數(shù)字，而結(jié)果僅有一位有效數(shù)字。

（2）第二式中各數(shù)的絕對誤差也相同，計算過程和結(jié)果勿需修約。但第三式中的第三個數(shù)只有一位有效數(shù)字，而結(jié)果卻有六位有效數(shù)字。（3）原數(shù)據(jù)可分別修約為0.576，0.001，0.35來計算則原式可修約為：

在第三式中，三個數(shù)字的絕對誤差大小不同，其中絕對誤差最大（即小數(shù)點位數(shù)最少）的是第三個數(shù)，那么結(jié)果的絕對誤差應(yīng)與第三個數(shù)據(jù)相當。此題如果先把三個數(shù)據(jù)修約成0.58，0.00及0.35再相加，結(jié)果不變，但實際卻存在誤差。

（3）原數(shù)據(jù)可分別修約為4.36，2.4，0.05和3.24來計算

則原式可修約為：在第四式中，四個數(shù)字的絕對誤差大小不同，其中絕對誤差最大（即小數(shù)點位數(shù)最少）的是第二個數(shù)，那么結(jié)果的絕對誤差應(yīng)與第二個數(shù)據(jù)相當。為了減少舍入誤差，參加運算的數(shù)字保留一位有效數(shù)字，在算出結(jié)果后，再將結(jié)果修約成與最大誤差數(shù)據(jù)相當?shù)奈粩?shù)。在第四式中，四個數(shù)字的絕對誤差大小不同，其中絕對誤差最大（即小數(shù)點位數(shù)最少）的是第二個數(shù)，那么結(jié)果的絕對誤差應(yīng)與第二個數(shù)據(jù)相當。為了減少舍入誤差，參加運算的數(shù)字保留一位有效數(shù)字，在算出結(jié)果后，再將結(jié)果修約成與最大誤差數(shù)據(jù)相當?shù)奈粩?shù)。乘除法

乘除法是各數(shù)相對誤差的傳遞，所以結(jié)果應(yīng)保留的有效數(shù)字的位數(shù)必須以各數(shù)中相對誤差最大的那個為依據(jù)。在實際計算時，可按照有效數(shù)字位數(shù)最少的那個保留其它各數(shù)的位數(shù)，然后再相乘除。藥品檢驗工作的基本程序包括取樣、鑒別、檢查、含量測定和寫出檢驗報告等。酶法、電泳法、理化法以及生物檢定法普遍用于藥物的分析中。而用于含量測定的常見分析方法有重量法、非水滴定法、沉淀滴定法、還原糖測定、凱氏定氮法等。小結(jié)重量法是將供試品用適當?shù)姆椒▽⒈粶y組分與試樣中其他組分分離，根據(jù)被測組分和供試品的重量以計算組分的含量的百分數(shù)的定量方法。由于供試品中被測組分的性質(zhì)不同，采用的分離方法也不同，重量法一般分為揮發(fā)法、萃取法和沉淀法。在非水溶劑