核酸提取與鑒定

關于核酸提取與鑒定1

核酸的提取與鑒定第一節(jié)預處理第二節(jié)DNA的提取

第三節(jié)RNA的提取

第四節(jié)核酸的鑒定概述第2頁,共54頁，2024年2月25日，星期天研究對象：基因組DNA、質粒DNA、總RNA、mRNA過程：

裂解：破碎細胞，使細胞中的核酸游離在裂解體系中

純化：使核酸與其它雜質徹底分離，如蛋白質、鹽等一、概述

總原則：①應保證核酸一級結構的完整性；②排除其它分子的污染。鑒定：濃度、純度、分子量、測序（技術：分光光度技術、凝膠電泳技術等）第3頁,共54頁，2024年2月25日，星期天1、植物樣品

新鮮組織先用無菌生理鹽水洗；干藥材除去霉點，無菌水浸洗；

（一）樣品預處理（獲取分散細胞）

搗碎或剪碎；加液氮研磨成粉狀。第4頁,共54頁，2024年2月25日，星期天2、動物樣品（1）組織樣品：新鮮樣品，生理鹽水洗，直接使用（或分裝、-70℃/液氮低溫保存）；甲醛固定組織要先去掉甲醛；石蠟包埋組織要經(jīng)過組織切片和二甲苯脫蠟等處理。第5頁,共54頁，2024年2月25日，星期天（2）血細胞樣品：（3）培養(yǎng)細胞：

離心，棄細胞培養(yǎng)液；用緩沖液多次漂洗；來源：新鮮血液或者凍貯血液；抗凝劑：一般用EDTA-Na2或檸檬酸鈉（枸櫞酸鈉），不可使用肝素；分離：紅白細胞，一般用明膠，加緩沖液懸浮白細胞。（血清DNA是研究腫瘤的材料之一）第6頁,共54頁，2024年2月25日，星期天3、微生物培養(yǎng)物樣品離心獲取菌體細胞，加緩沖液洗滌，加緩沖液懸浮菌體細胞。4、微生物混合樣品用緩沖液懸浮菌體，低速離心，沉淀雜質。高速離心獲取菌體細胞。用緩沖液洗滌菌體細胞。加緩沖液懸浮菌體細胞。第7頁,共54頁，2024年2月25日，星期天（二）提取用具預處理1、DNA提取用具的處理要求無菌；試劑、器材高壓干燥等進行無DNA酶處理。2、RNA提取用具的處理要求無菌，防止二次污染。RNA易被RNase水解，RNase無處不在且耐高溫，提取條件要求嚴格。第8頁,共54頁，2024年2月25日，星期天二、真核生物基因組DNA的常規(guī)提取裂解細胞，溶出DNA除去雜質重新溶解DNA沉淀、濃縮DNA第9頁,共54頁，2024年2月25日，星期天

⒈破碎細胞，溶解DNA：用提取液（裂解液）破壞細胞壁、細胞膜和核膜。微生物樣品提取液：含表面活性劑SDS、溶菌酶等動物樣品提取液：含SDS、蛋白酶K等植物樣品提取液：含CTAB核酸酶可被Ca2+、Mg2+等激活，提取液均含有螯合劑（如EDTA，檸檬酸等），螯合這些離子。第10頁,共54頁，2024年2月25日，星期天2、除去雜質（主要是蛋白質）

（SDS，破膜、蛋白質變性沉淀）——苯酚抽提蛋白質——氯仿抽提、萃取苯酚經(jīng)離心后溶液分為三層：上層是核酸溶液、中間不溶物為變性蛋白質，下層是苯酚氯仿溶液。蛋白質苯酚氯仿核酸溶液第11頁,共54頁，2024年2月25日，星期天3.沉淀DNA有機溶劑沉淀DNA：2倍體積無水乙醇（或1倍體積的異戊醇）再用75%乙醇清洗多次。4.重新溶解DNA將DNA溶于水或TE溶液。第12頁,共54頁，2024年2月25日，星期天

CTAB法原理（植物DNA提取經(jīng)典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽離子去污劑，可溶解細胞膜，并與核酸形成復合物。該復合物在高鹽溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，通過有機溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。注：CTAB溶液在低于15℃時會形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的植物材料之前必須預熱，且離心時溫度不要低于15℃?；蚪MDNA－CTAB法第13頁,共54頁，2024年2月25日，星期天SDS法原理基因組DNA－SDS法SDS是一種陰離子去垢劑，在高溫（55～65℃）條件下能裂解細胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸；提高鹽(KAc或NH4Ac)濃度并降低溫度（冰浴），使蛋白質及多糖雜質沉淀，離心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反復抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。第14頁,共54頁，2024年2月25日，星期天DNA提取的一般流程第15頁,共54頁，2024年2月25日，星期天三、質粒DNA的提取質粒DNA特點：（1）細菌基因組DNA以外的小型閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子。（2）大都含有抗生素抗性基因。（3）可自我復制或表達。（重組DNA技術中構建載體）（4）大小1-300kb。第16頁,共54頁，2024年2月25日，星期天1、培養(yǎng)細菌和擴增質粒

加適當?shù)囊种苿ㄈ缏让顾兀?，抑制細菌蛋白質合成，抑制細胞分裂，但質粒會繼續(xù)復制。

第17頁,共54頁，2024年2月25日，星期天2、收獲細菌和溶菌

離心收集細菌細胞。細菌裂解方法：機械法化學試劑法（SDS）溶菌酶－化學試劑聯(lián)合法（最常用）第18頁,共54頁，2024年2月25日，星期天3、分離質粒DNA基因組DNA與質粒DNA分離堿裂解法（最常用）用溶液1（EDTA）懸浮菌體。溶液2（NaOH和SDS）裂解菌體，蛋白質與DNA發(fā)生變性。溶液3中和pH，質粒DNA分子能夠迅速復性，呈溶解狀態(tài)，基因組DNA不復性與蛋白質形成絮狀沉淀。離心后，質粒DNA留在上清液中。第19頁,共54頁，2024年2月25日，星期天通過加熱，使細菌裂解、蛋白質和DNA變性。降低溫度，質粒DNA復性留于上清液，基因組DNA復性很慢與蛋白質形成沉淀，可通過離心除去。煮沸裂解法（偶爾用）梯度離心法（極少用）基因組DNA斷裂，吸附大量EB，密度大；質粒DNA密度小。利用氯化銫梯度離心，分離基因組DNA和質粒DNA。第20頁,共54頁，2024年2月25日，星期天離心分離后，吸取含有質粒DNA的上清液。用苯酚、氯仿抽提，除去溶解于上清液中的蛋白質。用乙醇或異戊醇沉淀質粒DNA（與基因組DNA方法同）。4、質粒DNA的純化蛋白質苯酚氯仿核酸溶液第21頁,共54頁，2024年2月25日，星期天四、RNA的提?。ㄒ唬┛俁NA的提取所有RNA的提取過程中都有五個關鍵點，即：①樣品細胞或組織的有效破碎；②有效地使核蛋白復合體變性；③對內源RNA酶的有效抑制；④有效地將RNA從DNA和蛋白混合物中分離；⑤對于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質的有效除去。

——最關鍵的是抑制RNA酶的活性。第22頁,共54頁，2024年2月25日，星期天常用的RNA酶抑制劑

焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。異硫氰酸胍：可裂解細胞并抑制RNA酶，目前被認為是最有效的RNA酶抑制劑。RNA酶的蛋白抑制劑(RNAsin)等。第23頁,共54頁，2024年2月25日，星期天（1）提取RNA所用器皿的處理及溶液的準備塑料制品：使用滅菌的一次性用品?；蛴?.1％DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用氯仿處理）。玻璃用品：使用前于180℃的高溫下干烤6h以上，或在220℃下干烤3h以上。有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再用3％H2O2室溫浸泡10min，然后用0.1％DEPC水沖洗，晾干。

第24頁,共54頁，2024年2月25日，星期天所需溶液的配制：必須用高壓滅菌的水和RNA提取專用的化學試劑配制溶液，用干烤過的藥匙稱取試劑，把溶液裝入無RNase的玻璃器皿。嚴格來說，所有溶液均應用0.1％DEPC于37℃處理12小時以上，然后于100℃加熱15分鐘或高壓滅菌15分鐘，去除殘余DEPC。第25頁,共54頁，2024年2月25日，星期天

在涉及RNA的一切操作過程中，都應戴一次性手套和口罩，應勤換手套。

（2）RNA提取中RNase污染的控制

第26頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第27頁,共54頁，2024年2月25日，星期天RNA的提取方法

1、異硫氰酸胍-氯化銫超速離心法使用蛋白質強變性劑異硫氰酸胍裂解組織和有效抑制RNA酶的活性；再進行CsCl密度梯度超速離心，RNA沉淀于管底，而DNA與蛋白質在上清液中。這種方法能得到高質量的RNA，同時分離出細胞染色體DNA。第28頁,共54頁，2024年2月25日，星期天2、鹽酸胍-有機溶劑法利用鹽酸胍使蛋白質變性，抑制RNA酶；3、氯化鋰-尿素法利用高濃度尿素變性蛋白質同時抑制RNA酶；氯化鋰選擇性沉淀RNA。其缺點是有時會存在DNA污染，氯化鋰沉淀RNA會丟失一些小分子RNA。第29頁,共54頁，2024年2月25日，星期天4、一步快速熱酚抽提法將異硫氰酸胍、巰基乙醇和去污劑SDS等聯(lián)合使用，抑制RNA的降解，裂解細胞，增強對核蛋白復合物的解離，使RNA與蛋白質分離；用高溫苯酚、氯仿等抽提去除蛋白質和DNA，乙醇或異丙醇沉淀純化RNA。此法操作簡便快速，可在3小時以內處理大批樣品，對大量或少量組織的細胞RNA提取均甚合適。

第30頁,共54頁，2024年2月25日，星期天5、試劑盒快速提取法裂解液含胍鹽，抑制RNA酶，使蛋白質和DNA同時變性；氯仿等抽提去除蛋白質和DNA；乙醇或異丙醇沉淀純化RNA；此法操作簡便快速。

第31頁,共54頁，2024年2月25日，星期天Trizol一步提取總RNA：TRIzol的主要成分是異硫氰酸胍和苯酚。異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一類強力的蛋白質變性劑，可溶解蛋白質主要作用是裂解細胞，使細胞中的蛋白，核酸物質解聚得到釋放。苯酚雖可有效的變性蛋白質，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中還加入了8-羥基喹啉、β-巰基乙醇等來抑制內源和外源RNase。第32頁,共54頁，2024年2月25日，星期天1）實驗前取冰，4℃離心機預冷，DEPC處理水（高壓滅菌處理）配制的75%乙醇4℃預冷；步驟：2）1mlTrizol勻漿好的樣品；3）加入0.2ml氯仿，顛倒混勻（15秒）——“慢”，氯仿使蛋白變性4）室溫，靜置3分鐘；5）離心機4℃、14000轉/分，離心15分鐘；靜置1分鐘（分層即可；樣品會分成三層：下層有機相，中間層和上層無色的水相，RNA主要存在于水相中）6）取上清0.5ml（注意：取最上層水相，小心污染，寧可吸少點也不要吸到中間層的物質）放入另一個1.5ml的EP管中；7）加入等體積的異丙醇（0.5ml），渦旋混勻；第33頁,共54頁，2024年2月25日，星期天8）室溫，靜置10分鐘（該條件由Trizol試劑盒提供；其他提供的條件用-20℃、1小時，目的為了更好分層）9）離心機4℃、14000轉/分，離心10分鐘10）棄上液(移液器調至1ml，分兩步快速輕輕吸棄上清：第1步，沿液面吸棄約0.9ml上清；第2步，沿液面吸棄其余上清;注意吸頭不要接觸到沉淀斑區(qū)）11)沿試管內壁輕輕加入1ml4℃預冷的75%乙醇,注意切勿沖擊到沉淀斑區(qū)12）離心機4℃、10000轉/分，離心5分鐘13）棄上液（用槍把里面的乙醇吸去，留極少許即可，以防干燥過程中把RNA烤干），60℃恒溫箱干燥5分鐘（注意：打開管蓋；或用真空干燥5分鐘）14）加入50μlDEPC處理水溶解（可以根據(jù)管底的白色沉淀判斷RNA量的多少加DEPC處理水）15）-80℃冰箱保存。第34頁,共54頁，2024年2月25日，星期天組織勻漿

第35頁,共54頁，2024年2月25日，星期天

（二）mRNA的提取從總RNA中分離mRNA，用Oligo（dT）層析柱。mRNA含polyA，在高鹽濃度條件下與Oligo（dT）結合，其他成分被洗掉，再用低鹽濃度洗脫mRNA。第36頁,共54頁，2024年2月25日，星期天（一）核酸濃度檢測OD260＝1時（比色皿厚度1.0cm）雙鏈DNA濃度為50μg/ml，單鏈DNA或RNA濃度為40μg/ml。DNA(μg/ml)=OD260×50RNA（μg/ml）=OD260×40五、核酸的鑒定第37頁,共54頁，2024年2月25日，星期天（二）核酸純度檢測（紫外吸收法）核酸在260nm處有吸收峰，蛋白質在280nm有吸收峰核酸的純度用OD260/OD280比值表示。

DNA樣品：OD260/OD280

＝1.8，DNA純度高OD260/OD280>1.8，含RNA，或DNA部分降解OD260/OD280<1.8，含苯酚或蛋白雜質RNA樣品：

OD260/OD280

＝1.8~2.0—RNA純度高

<1.8，含蛋白雜質；>2.0，RNA出現(xiàn)降解第38頁,共54頁，2024年2月25日，星期天（三）核酸完整性檢測核酸樣本的完整性和分子量可通過瓊脂糖凝膠電泳測定（RNA常采用甲醛瓊脂糖變性凝膠電泳），溴化乙錠染色，紫外燈觀察。凝膠上RNA存在處可觀察到清晰的條帶。完整性良好的總RNA應該清晰地看到28srRNA、18srRNA、5srRNA的三條帶，其中28srRNA的亮度應為18srRNA的兩倍，5srRNA較弱。電泳：帶電顆粒在電場的作用下發(fā)生遷移。第39頁,共54頁，2024年2月25日，星期天根據(jù)電泳支持介質分為瓊脂糖凝膠電泳：多用于鑒定較大核酸片段（0.1~60kb）聚丙烯酰胺凝膠電泳：用于鑒定較小的核酸片段（50~1000bp）六、電泳第40頁,共54頁，2024年2月25日，星期天瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖是從瓊脂中提純出來的一種多糖。凝膠具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度，低濃度的瓊脂糖形成較大的孔徑，而高濃度的瓊脂糖形成較小的孔徑。瓊脂糖濃度(％)線型DNA分子的分離范圍(kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2第41頁,共54頁，2024年2月25日，星期天瓊脂糖凝膠電泳裝置

第42頁,共54頁，2024年2月25日，星期天瓊脂糖凝膠電泳有許多優(yōu)點：操作簡單，電泳速度快，分離核酸范圍廣；電泳圖譜清晰，分辨率高，重復性好；電泳后區(qū)帶易染色，便于定量測定；可用于核酸的純化和分離（電洗脫法）；可制成干膜可長期保存。

第43頁,共54頁，2024年2月25日，星期天RNA可以使用非變性或變性凝膠電泳進行檢測。在非變性電泳中，可以分離混合物中不同分子量的RNA分子，但是無法確定分