真核基因表達系統(tǒng)

關于真核基因表達系統(tǒng)概述(introduction)真核基因結構及表達調控特點(Featuresofeukaryoticgenestructureandregulation)真核表達系統(tǒng)(eukaryoticgeneexpressionsystem)酵母表達系統(tǒng)(yeastexpressionsystem)哺乳動物細胞表達系統(tǒng)(mammaliancellexpression)昆蟲細胞表達系統(tǒng)(insectcellexpression)

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容第2頁,共97頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)概述一、真核基因組的復雜性二、原核表達系統(tǒng)的局限性三、真核表達系統(tǒng)的必要性及優(yōu)勢第3頁,共97頁，2024年2月25日，星期天一、真核基因組的復雜性

1.真核基因組巨大大腸桿菌基因組約4×106bp，哺乳類基因組在109bp數(shù)量級大腸桿菌約有4000個基因，人則約有10萬個基因2.真核生物遺傳信息復雜

原核生物的基因組基本上是單倍體，而真核基因組是二倍體真核生物主要的遺傳物質與組蛋白等構成染色質，被包裹在核膜內，核外還有遺傳成分(如線粒體DNA等)，這就增加了基因表達調控的層次和復雜性。第4頁,共97頁，2024年2月25日，星期天

細菌多數(shù)基因按功能相關成串排列，組成操縱子，共同開啟或關閉，轉錄出多順反子(polycistron)的mRNA；真核生物則是一個結構基因轉錄生成一條mRNA，即mRNA是單順反子(monocistron)，基本上沒有操縱子的結構。真核細胞的許多活性蛋白是由相同和不同的多肽形成的亞基構成的，這就涉及到多個基因協(xié)調表達的問題，真核生物基因協(xié)調表達要比原核生物復雜得多。

3.真核生物基因協(xié)調表達第5頁,共97頁，2024年2月25日，星期天4.真核生物基因編碼復雜原核基因組的大部分序列都為基因編碼，而核酸雜交等實驗表明：哺乳類基因組中僅約10%的序列為蛋白質、rRNA、tRNA等編碼，其余約90%的序列功能至今還不清楚。原核生物的基因為蛋白質編碼的序列絕大多數(shù)是連續(xù)的，而真核生物為蛋白質編碼的基因絕大多數(shù)是不連續(xù)的，即有外顯子(exon)和內含子(intron)，轉錄后需經剪接(splicing)去除內含子，才能翻譯獲得完整的蛋白質，這就增加了基因表達調控的環(huán)節(jié)。原核基因組中除rRNA、tRNA基因有多個拷貝外，重復序列不多。哺乳動物基因組中則存在大量重復序列(repetitivesequences)。真核生物mRNA5’有帽狀結構，3’末端有PolyA尾巴

第6頁,共97頁，2024年2月25日，星期天1、沒有轉錄后的剪接和加工系統(tǒng)2、缺乏翻譯后加工修飾系統(tǒng)：不能進行糖基化、磷酸化、甲基化的修飾，影響某些蛋白的活性。二、原核表達系統(tǒng)的局限性第7頁,共97頁，2024年2月25日，星期天3、在原核細胞中表達的真核蛋白不穩(wěn)定易被細菌蛋白酶降解;難實現(xiàn)真正的分泌出胞，其產量很低;而且容易出現(xiàn)信號肽不被切割，或不在特異位置上切割。表達產物常以包涵體的形式存在，后期變性、復性的效率低4、內毒素的污染(contaminationofendotoxin)第8頁,共97頁，2024年2月25日，星期天1.具轉錄后加工系統(tǒng):2.具翻譯后修飾系統(tǒng)3.可實現(xiàn)真正的分泌表達三、真核表達系統(tǒng)的必要性及優(yōu)勢

(advantagesofeukaryoticexpressionsystem)第9頁,共97頁，2024年2月25日，星期天

（一）真核基因表達調控特點

---多層次、多方面（二）真核基因表達的調控模式

第二節(jié)真核基因表達調控特點

FeaturesofEukaryoticgenestructureandexpression第10頁,共97頁，2024年2月25日，星期天真核基因表達的調控模式

(Theregulatingmodelof

eukaryoticgeneexpression)

1、轉錄前水平(基因組水平)：genelevel2、轉錄水平調控:transcriptionlevel3、轉錄后調控:post-transcriptionlevel4、翻譯水平的調控:translationlevel5、翻譯后修飾:post-translationmodification第11頁,共97頁，2024年2月25日，星期天1、轉錄前水平(基因組水平)：genelevel基因結構的改變、穩(wěn)定持久、不可逆，組蛋白修飾，DNA甲基化等第12頁,共97頁，2024年2月25日，星期天2.轉錄水平調控順式調控元件(cis-actingelement)

反式作用因子(trans-actingfactor)第13頁,共97頁，2024年2月25日，星期天（1）順式調控元件(cis-actingelement)

結構基因周圍能與特異轉錄因子結合而啟動轉錄的DNA序列，主要包括：起正性調節(jié)作用：啟動子、增強子起負性調節(jié)作用：沉寂子，終止子，加尾信號第14頁,共97頁，2024年2月25日，星期天

啟動子位于基因5’末端與轉錄起始有關的核苷酸序列。作用特點是近距離作用、具有方向性、空間位置較恒定。一般包括核心啟動子元件（corepromoterelements)：指RNA聚合酶起始轉錄所必需的最小的DNA序列，決定基因轉錄的精確起始位點產生基礎水平的轉錄，包括：轉錄起始點及-30區(qū)的TATA-box上游啟動子元件（upstreampromoterelements)包括-70到-80bp區(qū)域的CAAT盒及其兩側的GC盒，協(xié)同決定轉錄的基礎效率組織特異性元件誘導性啟動子元件第15頁,共97頁，2024年2月25日，星期天真核啟動子結構模式圖核心啟動子元件上游啟動子元件第16頁,共97頁，2024年2月25日，星期天

哺乳類RNA聚合酶Ⅱ啟動子中常見的元件元件名稱共同序列結合的蛋白因子名稱分子量結合DNA長度TATAboxTATAAAATBP30,000~10bpGCboxGGGCGGSP-1105,000~20bpCAATboxGGCCAATCTCTF/NF160,000~22bpOctamerATTTGCATOct-176,000~20bp

Oct-253,000~23bpkBGGGACTTTCCNFkB44,000~10bpATFGTGACGTAFT?20bp第17頁,共97頁，2024年2月25日，星期天

增強子(enhancer)是一種能夠提高轉錄效率的順式調控元件增強子要有啟動子才能發(fā)揮作用，但增強子對啟動子沒有嚴格的專一性

無方向性（序列、位置）遠距離作用（1-4kB）無基因特異性具組織特異性構建載體第18頁,共97頁，2024年2月25日，星期天沉寂子（silencer)或衰減子（dehancer)

是一類抑制基因轉錄的調控因子，作用方式與增強子相同轉錄終止信號：

控制基因轉錄的終止，由polyA上游的10-20bp處的加尾信號（AATAA）和polyA下游的G/T簇構成

第19頁,共97頁，2024年2月25日，星期天（2）反式作用因子(trans-actingfactor)

由位于不同或相同染色體上相距較遠的基因所編碼的蛋白質因子，通過與順式調控元件和RNA聚合酶的相互作用而調節(jié)基因轉錄活性。第20頁,共97頁，2024年2月25日，星期天轉錄信號1PTrans-actingfactorTrans-actingfactor(DNA結合蛋白）Cis-actingfactorAgenemRNAofAProteinABgenemRNAofBProteinBDNA第21頁,共97頁，2024年2月25日，星期天3、轉錄后的修飾內含子的剪接外顯子的拼接mRNA的加尾和加帽mRNA的穩(wěn)定性第22頁,共97頁，2024年2月25日，星期天

4、翻譯水平的調控主要是microRNA對mRNA、tRNA和rRNA的調控第23頁,共97頁，2024年2月25日，星期天5、翻譯后的調控

切除信號肽糖基化乙?；姿峄谆鞍踪|的降解第24頁,共97頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)真核表達系統(tǒng)組成：真核表達載體受體細胞第25頁,共97頁，2024年2月25日，星期天真核表達載體

適用于在真核細胞中表達外源基因的載體。真核載體根據受體不同，又可分為幾種：酵母表達載體哺乳動物細胞表達載體昆蟲桿狀病毒表達載體第26頁,共97頁，2024年2月25日，星期天受體細胞據受體細胞及表達載體的不同分為3種：酵母表達系統(tǒng)哺乳動物細胞表達系統(tǒng)昆蟲細胞表達系統(tǒng)第27頁,共97頁，2024年2月25日，星期天發(fā)酵簡單、快速、便宜真核生物，有翻譯后修飾功能可分泌表達，簡化了純化工藝受體細胞安全一、酵母表達系統(tǒng)第28頁,共97頁，2024年2月25日，星期天（一）酵母載體:1、概念：

攜帶外源基因在酵母細胞中復制、擴增和表達的載體，包括克隆載體和表達載體。

2、組成元件：遺傳標記調控序列第29頁,共97頁，2024年2月25日，星期天1）遺傳標記：用于重組子的篩選和鑒定

營養(yǎng)標記基因：亮氨酸（Leu）

抗生素選擇標記基因：Zeocin第30頁,共97頁，2024年2月25日，星期天

2）調控序列ARS：酵母復制起始區(qū)(點)酵母啟動子：常用的有:

PGK(磷酸甘油激酶)

GAP（3-磷酸甘油醛脫氫酶）ADH1(醇脫氫酶)SUC(蔗糖酶)Apase(堿性磷酸酶)

酵母著絲粒區(qū)段(CEN)：增加轉化子穩(wěn)定性第31頁,共97頁，2024年2月25日，星期天3、類型(types)酵母克隆載體(yeastclonevector)：不含酵母啟動子，不能在酵母中表達外源基因，如YIP、YRP、YEP

酵母表達載體(yeastexpression

vector)：酵母克隆載體+酵母啟動子,若引入信號肽序列，則成為分泌型載體

酵母人工染色體（yeastartificialchromosome,YAC)克隆大片段DNA，2μM質粒：酵母核質中的小的環(huán)狀DNA，可以獨立復制并轉錄。第32頁,共97頁，2024年2月25日，星期天（1）酵母克隆載體的構建酵母整合型質粒(yeastintegratedplasmid.Yip)

細菌質粒DNA+酵母遺傳標記，通過同源重組整合入酵母染色體，轉化子穩(wěn)定，但轉化率極低。酵母復制型質粒(Yeastreplicableplasmid,YRp)

細菌質粒DNA+酵母遺傳標記(YIp)+酵母復制序列(ARS),可自主復制，但穩(wěn)定性差酵母附加子型質粒,YEp：細菌質粒DNA+酵母標記基因(YIp)+酵母2μM質粒，游離于核外存在并自主復制第33頁,共97頁，2024年2月25日，星期天酵母復制序列酵母2μM質粒第34頁,共97頁，2024年2月25日，星期天（2）酵母表達載體特點：含酵母啟動子

穿梭載體(shuttlevector)：既可以攜帶外源基因在原核細胞中復制，又可以使其在真核細胞中表達的載體。種類：啤酒酵母表達載體畢赤酵母表達載體：

分泌型表達載體非分泌型表達第35頁,共97頁，2024年2月25日，星期天啤酒酵母表達載體第36頁,共97頁，2024年2月25日，星期天畢赤酵母表達載體------整合型第37頁,共97頁，2024年2月25日，星期天(3)酵母人工染色體（yeastartificial

chromosome,YAC)----克隆大片段DNA

由下列元件組成

酵母染色體

2umDNA的復制起始區(qū)

著絲粒序列（CEN)

四膜蟲端粒DNA(TEL)第38頁,共97頁，2024年2月25日，星期天YAC:利用酵母的著絲粒區(qū)段（CEN）、自動復制序列（ARS）及四膜蟲端粒DNA(TEL)構建的人工染色體結構：左臂：TEL、選擇標記、ARS、CEN右臂：TEL、選擇標記特點：容量大（50-1000kb），穩(wěn)定性差作用：構建基因組文庫第39頁,共97頁，2024年2月25日，星期天第40頁,共97頁，2024年2月25日，星期天

二）受體細胞1.啤酒酵母：較早使用，了解清楚安全性高，被FDA確認為安全生物表達量較低過量糖基化轉化子不穩(wěn)定，易發(fā)生質粒丟失第41頁,共97頁，2024年2月25日，星期天2.畢赤酵母：新發(fā)展的酵母受體細胞高表達（12g/L）高穩(wěn)定-----載體為整合型高分泌（10g/L）第42頁,共97頁，2024年2月25日，星期天三）轉化

1.原生質體法：去除厚壁2.電穿孔法：效率較高，整合型載體轉化前要酶切線性化3.LiCl法：做成感受態(tài)細胞第43頁,共97頁，2024年2月25日，星期天四）外源基因在酵母菌中的表達1、胞內表達：直接表達外源基因，如：HBsAg的酵母重組疫苗2、分泌表達：在MCS前加入信號肽序列，pGAPZ,利用因子分泌表達第44頁,共97頁，2024年2月25日，星期天

五）高表達的策略（1）利用誘導型強啟動子：畢赤酵母表達載體中常用啟動能力強的GAP啟動子（2）提高整合拷貝數(shù)：可利用載體中提供的抗生素遺傳標記，以抗生素加壓篩選含有多拷貝的轉化子。（3）控制蛋白酶降解活性：采用蛋白酶缺陷型宿主菌，改變發(fā)酵培養(yǎng)基的PH值，或在培養(yǎng)基中補加氨基酸或多肽，均可避免產物被降解。（4）分泌表達：也是一種避免產物被降解的良好策略。第45頁,共97頁，2024年2月25日，星期天酵母雙雜交系統(tǒng)YeastTwo-HybridSystem第46頁,共97頁，2024年2月25日，星期天

酵母雙雜交系統(tǒng)是在真核模式生物酵母中進行的，研究活細胞內蛋白質相互作用，對蛋白質之間微弱的、瞬間的作用也能通過報告基因的表達產物敏感地檢測得到。

1989年美國紐約州立大學的Fields和Song首先描述了酵母雙雜交系統(tǒng)(yeasttwo-hybridsystem)。蛋白的酵母雙雜交實驗是以酵母的遺傳分析為基礎，研究反式作用因子之間的相互作用對真核基因轉錄調控影響的實驗。

第47頁,共97頁，2024年2月25日，星期天很早就已知道，轉錄活化蛋白可以和DNA上特異的序列結合而啟動相應基因的轉錄反應。這種DNA結合與轉錄激活的功能是由轉錄活化蛋白上兩個相互獨立的結構域即DNA結合結構域(BindingDomain,BD)和轉錄活化結構域(ActivationDomain,AD)分別來完成的，并且這兩個結構域對于基因的轉錄活化都是必須的轉錄激活因子DNA結合結構域(BD)(DNAbindingdomain)轉錄激活結構域(AD)(activationdomain)第48頁,共97頁，2024年2月25日，星期天

這兩個結構域各具功能，互不影響,單獨存在時沒有轉錄激活的功能，只有兩者通過共價或非共價鍵連接建立起來的空間結構方可表現(xiàn)出一個完整的激活特定基因表達的激活因子的功能。第49頁,共97頁，2024年2月25日，星期天基本原理在利用GAL4系統(tǒng)篩選cDNA文庫或研究蛋白間的相互作用時，DNA結合結構域與靶蛋白即“誘餌”相結合，轉錄活化結構域與文庫蛋白或要驗證的蛋白相結合。一般情況下，單獨的BD可以與GAL4上游活化序列（GALUAS）結合但不能引起轉錄，單獨的AD則不能與GALUAS結合，只有當BD與AD分別表達的融合蛋白由于相互作用而導致兩者在空間上相互靠近時，BD與AD才能與GALUAS結合并且引起報道基因的轉錄。第50頁,共97頁，2024年2月25日，星期天ADYADYXDNA-BDGAL4UASPromoterlacZ(orHIS)reportergenetranscriptionGAL4UASPromoterlacZ(orHIS)reportergeneGAL4UASPromoterlacZ(orHIS)reportergeneXDNA-BDtranscriptiontranscription已知蛋白X與BD-fusion---誘餌（bait）未知蛋白Y與AD-fusion---獵物或靶蛋白（preyortargetprotein）報告基因（reportergene）

---LacZ（編碼β-半乳糖苷酶）第51頁,共97頁，2024年2月25日，星期天第52頁,共97頁，2024年2月25日，星期天第53頁,共97頁，2024年2月25日，星期天第54頁,共97頁，2024年2月25日，星期天LacZreporter

-Blue/WhiteScreeningHIS3reporter-ScreenonHis+media(usuallyneedtoadd3ATtoincreaseselectivity)LEU2reporter-ScreenonLeu+mediaADE2reporter-ScreenonAde+mediaURA3reporter-ScreenonUra+media(candonegativeselectionbyaddingFOA)報告基因第55頁,共97頁，2024年2月25日，星期天已知蛋白的cDNA序列為誘餌(bait)，將其與DNA結合域（BD）融合，構建成誘餌質粒將待篩選蛋白的cDNA序列與轉錄激活域(AD)融合，構建成文庫質粒將這兩個質粒共轉化于酵母細胞中酵母細胞中，已分離的DNA結合域和轉錄激活域不會相互作用，但誘餌蛋白若能與待篩選的未知蛋白特異性地相互作用，則可激活報告基因的轉錄第56頁,共97頁，2024年2月25日，星期天第57頁,共97頁，2024年2月25日，星期天酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點

高敏感性。真實性。檢測在活細胞內進行，作用條件與作用力無需模擬，在一定程度上代表細胞內的真實情況。簡潔性。融合蛋白相互作用后，減少了制備抗體和純化蛋白質的繁瑣步驟。廣泛性。采用不同組織器官細胞類型和分化時期的材料構建cDNA文庫，能分析不同亞細胞部位和功能的蛋白質，適用于部分細胞質、細胞核及膜結合蛋白。第58頁,共97頁，2024年2月25日，星期天

分析已知蛋白之間的相互作用對蛋白質功能域的分析，如可將待測蛋白質進行點突變或缺失突變再進行雙雜交。用已知功能蛋白質篩選雙雜交cDNA文庫，研究蛋白質之間相互作用的傳遞途徑，發(fā)現(xiàn)新基因。分析新基因的生物學功能。即以功能未知的新基因去篩選文庫，再根據篩的已知基因推測新基因功能。繪制蛋白質相互作用系統(tǒng)圖譜在藥物設計中的應用酵母雙雜交系統(tǒng)的應用現(xiàn)狀第59頁,共97頁，2024年2月25日，星期天進行完全的翻譯后修飾可表達產生有功能的膜蛋白用途：表達大量的外源蛋白研究基因的功能基因治療兩部分：哺乳動物表達載體受體：哺乳動物細胞二、哺乳動物細胞表達系統(tǒng)第60頁,共97頁，2024年2月25日，星期天1、主要元件2、載體的類型

非病毒性載體

病毒性載體

一）哺乳動物細胞表達載體第61頁,共97頁，2024年2月25日，星期天(一）主要元件1）啟動子

病毒來源的：

SV40:綠猴空泡病毒（Simianvacuolatingvirus-40）CMV:巨細胞病毒（Cytomegalovirus）RSV:肉瘤病毒（Roussarcomavirus）ADV:adenovirus（腺病毒）LTR:逆轉錄病毒長末端重復序列（Longterminalrepeatfromretrovirus）

細胞來源的：HSP：heatshockprotein（熱休克蛋白）第62頁,共97頁，2024年2月25日，星期天(Promoter+ori)

(PolyA)ori第63頁,共97頁，2024年2月25日，星期天2）增強子許多來源于病毒的增強子在不同種屬細胞中都有極強的促進轉錄能力SV40enhancerRSVenhancerCMVenhancerLTRenhancer第64頁,共97頁，2024年2月25日，星期天3）篩選標記胸苷激酶(tk)基因

Thymidinekinasegene二氫葉酸還原酶(dhfr)基因

Dihydrofolatereductase,dhfr新霉素抗性基因neomycinresistancegene第65頁,共97頁，2024年2月25日，星期天胸苷激酶(tk)基因tk+細胞中：胸苷(T)→胸苷一磷酸二氫葉酸二氫葉酸還原酶

四氫葉酸

dCTPdATP

dTTP氨基喋呤(Aminopterin)

tk阻斷補加次黃嘌呤（Hypoxanthine）死亡存活DihydrofolateThymidine（1）（2）（3）HAT第66頁,共97頁，2024年2月25日，星期天二氫葉酸還原酶基因篩選法原理攜帶外源基因的載體連接有dhfr基因，可以表達二氫葉酸還原酶以dhfr-細胞為受體:CHO細胞dhfr-細胞無法在普通培養(yǎng)基中存活，而轉化入dhfr基因后可以存活，并表達外源基因。若在培養(yǎng)基內加入甲氨蝶呤，進行加壓篩選，可以提高外源基因表達量第67頁,共97頁，2024年2月25日，星期天新霉素的類似物G418對原核、真核均有毒neo編碼的酶可使G418滅活此種篩選方法對受體細胞無要求，應用更簡便新霉素抗性基因(neo)第68頁,共97頁，2024年2月25日，星期天4）轉錄終止信號和多聚腺苷酸信號

使轉錄后的mRNA能有效進行切割和多聚腺苷酸化第69頁,共97頁，2024年2月25日，星期天多聚腺苷酸信號第70頁,共97頁，2024年2月25日，星期天5）復制元件：

使載體在受體細胞中復制，提高外源基因的表達水平6）原核細胞的部分序列在原核細胞復制的復制起始為點（ori)在原核細胞復制篩選的抗生素抗性基因（AMPr）第71頁,共97頁，2024年2月25日，星期天復制元件復制元件第72頁,共97頁，2024年2月25日，星期天

1）非病毒性載體

2）病毒性載體：腺病毒，慢病毒等2、載體的類型第73頁,共97頁，2024年2月25日，星期天1）非病毒型(復制子型,質粒型）由真核復制信號、啟動子,轉錄單位及質粒片段組成,不需要包裝細胞。如：pSV系列、pCDNA3等(二）載體的類型第74頁,共97頁，2024年2月25日，星期天第75頁,共97頁，2024年2月25日，星期天2）病毒型載體

外源DNA插入病毒DNA或取代病毒基因某一片段，重組DNA隨病毒顆粒而復制(多需輔助病毒或包裝細胞的存在)。如：逆轉錄病毒載體、腺病毒載體等第76頁,共97頁，2024年2月25日，星期天病毒型載體的類型整合型整合入宿主染色體，隨染色體復制而復制可持續(xù)表達外援基因安全性低：插入誘變

SV40載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體游離型不整合生物安全性高瞬時表達

腺病毒載體、痘苗病毒載體第77頁,共97頁，2024年2月25日，星期天1、CHO細胞（中國倉鼠卵巢癌細胞）----------可大規(guī)模培養(yǎng)2、COS細胞（猴腎細胞系）：可合成SV40復制的大T抗原，可使每個細胞中的SV40載體拷貝數(shù)多達10萬個，適合于大量表達SV40載體上的基因3、其他動物的細胞：如Hela細胞（人宮頸癌細胞）、HEK293細胞二）受體細胞------哺乳動物細胞第78頁,共97頁，2024年2月25日，星期天三）基因轉移技術轉化：將質?；蛞再|粒為載體構建的重組DNA導入細胞的方法。

1.磷酸鈣共沉淀法2.DEAE-Dextran3.脂質體轉染法：4.電穿孔法5.顯微注射法6.受體介導的基因轉移方法轉染：將病毒或以病毒為載體構建的重組DNA導入細胞的方法第79頁,共97頁，2024年2月25日，星期天脂質體介導的基因轉移脂質體(Liposome)介導：Lipid/DNAcomplex脂質體的特性：對溫度、pH敏感帶正電荷，與基因的復合過程比較容易脂質體與細胞膜融合將目的基因導入細胞后，脂質體即被降解無免疫原性，保護DNA不被降解對包裹的DNA大小沒有限制轉染過程方便易行，重現(xiàn)性好第80頁,共97頁，2024年2月25