植物組織培養(yǎng)的基本原理

關于植物組織培養(yǎng)的基本原理細胞全能性概述細胞脫分化細胞再分化第一節(jié)植物細胞全能性和細胞分化第2頁,共43頁，2024年2月25日，星期天

植物細胞的全能性：1902年由Haberlandt提出，植物體細胞在適當?shù)臈l件下，具有不斷分裂和繁殖、發(fā)育成完整植株的能力。（細胞核）

20世紀80年代，每一個植物細胞具有該植物的全部遺傳信息，在適當條件下可表達出該細胞的所有遺傳信息，分化出植物有機體所有不同類型細胞，形成不同類型的器官甚至胚狀體，直至形成完整再生植株。一、植物細胞的全能性（Totipotency）第3頁,共43頁，2024年2月25日，星期天從一個細胞發(fā)育成一個植株繼代魚雷球形心形第4頁,共43頁，2024年2月25日，星期天植物細胞全能性的證明

1958年，美國斯圖爾德（Steward）等人，用胡蘿卜根韌皮部的細胞進行培養(yǎng)，得到了完整植株，并且這一植株能夠開花結(jié)實，首次證實細胞全能性；1964年印度Guha和Maheshwari成功地在毛葉曼陀羅花藥培養(yǎng)中，由花粉誘導得到單倍體植株。第5頁,共43頁，2024年2月25日，星期天細胞全能性的相對性細胞全能性并不意味著任何細胞均可以直接產(chǎn)生植物;

植物細胞全能性的表現(xiàn)程度存在明顯的差異。細胞按照分裂能力分為3類第一類：始終保持分裂能力，如莖尖、根尖分生組織及形成層細胞；第二類：永久失去分裂能力的終端分化細胞，如篩管、導管、氣孔保衛(wèi)細胞等特化細胞；第三類：在通常情況下不分裂，但在受到外界刺激后可重新啟動分裂的細胞，如表皮細胞及各種薄壁細胞。第6頁,共43頁，2024年2月25日，星期天一個植物細胞向分生狀態(tài)回復過程所能進行的程度，

取決于它在自然部位上所處位置和生理狀態(tài)。

營養(yǎng)生長中心

>形成層>薄壁細胞

>厚壁細胞（木質(zhì)化細胞）>特化細胞（篩管、導管細胞）第7頁,共43頁，2024年2月25日，星期天細胞全能性脫分化個體再生再分化細胞分裂細胞全能性的表達是通過細胞脫分化（dedifferentiation）和再分化（redifferentiation）實現(xiàn)的，在大多數(shù)情況下，脫分化是細胞全能性表達的前提，再分化是細胞全能性表達的最終體現(xiàn)。第8頁,共43頁，2024年2月25日，星期天二、植物細胞分化1.

定義

分化（differentiation）植物體各個部分出現(xiàn)異質(zhì)性的現(xiàn)象，體現(xiàn)在細胞分化、組織分化、器官分化三個水平上。細胞分化導致細胞形成不同結(jié)構(gòu)，引起功能改變或潛在的發(fā)育方式改變的過程。是基因選擇性活化或阻遏的結(jié)果。細胞分化是組織分化和器官分化的基礎，是離體培養(yǎng)再分化和植株再生得以實現(xiàn)的基礎。第9頁,共43頁，2024年2月25日，星期天2.植物細胞分化的某些規(guī)律和機理（1）細胞分化分為形態(tài)結(jié)構(gòu)分化和生理生化分化兩類，生理生化分化在形態(tài)結(jié)構(gòu)分化之前。（2）植物中細胞發(fā)育的途徑一旦被“決定”（determination），通常不易改變。而離體培養(yǎng)可以通過脫分化而喪失這種“決定”。（3）分化與極性（Polarity）關系密切。

第10頁,共43頁，2024年2月25日，星期天（4）細胞分裂對細胞分化具有重要作用。

特定環(huán)境條件下進行的細胞分裂可以導致特定的細胞分化，由不均等分裂形成的分化細胞說明了細胞質(zhì)在細胞分化中的作用。

（5）植物生長調(diào)節(jié)劑有明顯調(diào)節(jié)作用。如生長素類與細胞分裂素類比值，高，促進生根；低，促進長芽。（6）染色體和DNA的變化對細胞分化影響比較大。如核內(nèi)多倍體的形成。細胞不分裂，只有遺傳物質(zhì)復制所導致的染色體組倍性增加的現(xiàn)象。第11頁,共43頁，2024年2月25日，星期天1.

脫分化（Dedifferentiation）也稱去分化，指離體條件下生長的細胞、組織或器官經(jīng)過細胞分裂或不分裂逐漸失去原來的結(jié)構(gòu)和功能而恢復分生狀態(tài)，形成無組織結(jié)構(gòu)的細胞團或愈傷組織或不分化細胞的過程。2.脫分化的機理

脫分化誘導期間會導致細胞膜透性改變，細胞核增大，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)范圍擴大，多核糖體形成，過氧化物酶增加，蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)合成活躍等。但目前對于脫分化的機理尚未完全闡明。三、細胞脫分化第12頁,共43頁，2024年2月25日，星期天3.影響脫分化的主要因素（1）損傷。切割損傷的刺激，促使細胞增殖。（2）在誘導愈傷組織時常加入生長素類，但同時配合細胞分裂素的效果可能更好。

（3）弱光或黑暗條件有利于脫分化中的細胞分裂。（4）細胞位置。外植體本身的各類細胞可能對培養(yǎng)條件的刺激有不同的敏感性。（5）外植體的生理狀態(tài)。不同生理年齡和不同季節(jié)都會有不同的培養(yǎng)反應。（6）植物種類的差異。一般雙子葉植物比單子葉植物及裸子植物容易。第13頁,共43頁，2024年2月25日，星期天１.愈傷組織的形成在細胞脫分化過程中，大多數(shù)情況下形成愈傷組織。愈傷組織的細胞往往是異質(zhì)性的，無明顯極性，其形成過程可分為誘導期、分裂期和分化期。

四、愈傷組織（callus）形成黃瓜子房組織經(jīng)脫分化形成胚性愈傷組織第14頁,共43頁，2024年2月25日，星期天愈傷組織形成過程◆誘導期（起動期）：是細胞準備分裂的時期。細胞大小幾乎不變，內(nèi)部發(fā)生生理生化變化，迅速合成蛋白質(zhì)和核酸。◆分裂期：外層細胞分裂，中間細胞常不分裂，形成小芯。細胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，缺少結(jié)構(gòu)，淺而透明。在原培養(yǎng)基上，細胞必然分化，及時轉(zhuǎn)移，其可無限制地進行細胞分裂，維持不分化狀態(tài)?！舴只冢杭毎谛螒B(tài)和生理功能上的分化，出現(xiàn)形態(tài)和功能各異的細胞。第15頁,共43頁，2024年2月25日，星期天概念

指離體培養(yǎng)的植物細胞和組織可以由脫分化狀態(tài)重新進行分化，

形成另一種或幾種類型的細胞、組織、器官，甚至形成完整植株。

組織培養(yǎng)中的再分化包括下面4個水平細胞水平的再分化組織水平的再分化器官水平的再分化（器官發(fā)生）植株水平的分化（植株再生）五、細胞再分化（redifferentiation）第16頁,共43頁，2024年2月25日，星期天細胞水平的再分化

愈傷組織生長、不斷分裂，分化出不同的細胞類群。主要有薄壁細胞、分生細胞、色素細胞、石細胞、纖維細胞等。組織水平的再分化

在高水平生長素條件下，最常見的是微管束（Vasculartissue）的分化。

松散的愈傷組織內(nèi)含大量擬分生組織或瘤狀結(jié)構(gòu)；

致密的愈傷組織內(nèi)組織分化很少，大多由高度液泡化的細胞組成。

第17頁,共43頁，2024年2月25日，星期天器官水平的再分化

由分化出的不同組織形成各種器官，如芽、莖、葉、根等。

根據(jù)起源不同，分為兩種類型：◆直接器官發(fā)生（器官型）直接從外植體的細胞形成器官原基，然后發(fā)育成器官?！糸g接器官發(fā)生（器官發(fā)生型）先形成愈傷組織，再由愈傷組織產(chǎn)生不同的器官原基，后形成不同器官。第18頁,共43頁，2024年2月25日，星期天植株水平的再分化（植株再生）

根、莖或芽器官的發(fā)生可使植株重建。先誘導分化出芽，后形成根較好。離體培養(yǎng)中再生植株的主要途徑有器官發(fā)生胚胎發(fā)生第19頁,共43頁，2024年2月25日，星期天潛力從理論上講，在離體培養(yǎng)條件下經(jīng)過再分化可獲得各種類型的細胞、組織、器官以及再生植株。但是目前，還不能讓所有植物的活細胞都再生植株。主要原因（1）不同植物種類再分化的能力差異很大；（2）對某些植物再生條件還沒有完全掌握。第20頁,共43頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)離體條件下植物器官發(fā)生

植物的離體器官發(fā)生離體培養(yǎng)條件下的組織或細胞團（愈傷組織）分化形成根、芽、莖等器官的過程。不定根、不定芽在一些非正常發(fā)生部位形成的根或芽，離體培養(yǎng)中通常是指從愈傷組織上發(fā)生的根或芽。第21頁,共43頁，2024年2月25日，星期天一、器官發(fā)生再生植株的方式

A.先形成芽，芽的基部產(chǎn)生根；

B.先形成根，根上再出芽；

C.愈傷組織的不同部位形成芽和根；然后形成微管束組織把兩者結(jié)合起來。第22頁,共43頁，2024年2月25日，星期天經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生過程二、器官發(fā)生的過程

分為2種經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生；不經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生。愈傷組織形成生長中心形成器官原基及器官形成第23頁,共43頁，2024年2月25日，星期天不經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生過程

有2種情況

外植體直接發(fā)生芽；

莖尖培養(yǎng)中芽形成。第24頁,共43頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)植物體細胞胚胎發(fā)生

一、什么是植物體細胞胚胎發(fā)生？植物離體培養(yǎng)的細胞、組織、器官產(chǎn)生類似胚的結(jié)構(gòu)，其形成也經(jīng)歷一個類似合子胚胎發(fā)生和發(fā)育過程，這種現(xiàn)象稱為植物體細胞胚胎發(fā)生，形成的類似胚的結(jié)構(gòu)稱為體細胞胚或胚狀體。體細胞胚胎發(fā)生具有普遍性，目前已在200多種被子植物上觀察到體胚發(fā)生過程。第25頁,共43頁，2024年2月25日，星期天1.發(fā)生過程雙子葉植物胚胎發(fā)生

合子－原胚－球形胚－心型胚－魚雷胚－子葉胚。單子葉植物胚胎發(fā)生

合子－原胚－球形胚－盾型胚－子葉胚。體細胞胚胎發(fā)生一般分為5個階段胚性愈傷組織誘導、體細胞胚胎誘導、體細胞胚胎早期分化發(fā)育、體細胞胚胎成熟、體細胞胚胎萌發(fā)和成苗。體細胞胚胎發(fā)生與合子胚發(fā)生階段類似，但體胚形成由體細胞（或小孢子等性細胞）形成。二、體細胞胚胎發(fā)生過程

第26頁,共43頁，2024年2月25日，星期天針葉松體細胞胚及體胚萌發(fā)生長液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的針葉松體細胞胚半固體培養(yǎng)基上針葉松體細胞胚萌發(fā)生長第27頁,共43頁，2024年2月25日，星期天（1）胚性愈傷組織，通常較小，近圓形；具有較大的核和核仁，并高度染色；胞質(zhì)濃厚。典型的胚性愈傷組織外表呈松脆顆粒狀。胚性愈傷——“結(jié)構(gòu)致密，爽脆，顏色嫩黃光澤”，非胚性愈傷——水浸褐化狀。（2）胚性細胞

DNA、RNA以及蛋白質(zhì)的合成更活躍，

淀粉、可溶性糖含量增加，

內(nèi)源多胺含量升高，

同工酶和內(nèi)源激素合成變化明顯。如胡蘿卜胚性愈傷組織淀粉含量高出非胚性愈傷組織的15~40倍。2.胚性和非胚性細胞或愈傷組織生理狀態(tài)的差異第28頁,共43頁，2024年2月25日，星期天3.體細胞胚胎發(fā)生的基因表達機理植物體胚發(fā)生的過程非常復雜，牽涉到4000多個相關基因，體胚發(fā)育后期，表達的基因可達1000多個。在植物體胚發(fā)生過程中，會出現(xiàn)與基因表達有關的一系列生物大分子的有規(guī)律變化。如蛋白質(zhì)含量變化和特異蛋白質(zhì)（胚性蛋白）出現(xiàn)與消失。

目前對體胚發(fā)生的機制了解不多。第29頁,共43頁，2024年2月25日，星期天三、植物體細胞胚胎發(fā)生途徑1.直接途徑從外植體某些部位(如子葉、花序、珠心等外植體)的胚性細胞直接誘導分化出體細胞胚胎。DirectsomaticembryogenesisinBrassicanapus蕓苔第30頁,共43頁，2024年2月25日，星期天外植體先脫分化形成愈傷組織，再由愈傷組織的某些細胞重新“決定”為胚性細胞，進而分化出體細胞胚胎。多數(shù)體細胞胚胎通過該途徑形成的。通常包括2個階段：（1）胚胎發(fā)生叢（Embryogenicclump，EC）是由液泡小、細胞質(zhì)濃的小細胞構(gòu)成。（2）胚狀體的發(fā)育。將EC轉(zhuǎn)入降低或除去生長素、降低還原氮的培養(yǎng)基上培養(yǎng)即可。

2.

間接途徑第31頁,共43頁，2024年2月25日，星期天SomaticEmbryogenesisInductioninRaf(RoyalPoinciana)體細胞胚誘導體細胞胚萌發(fā)第32頁,共43頁，2024年2月25日，星期天1.

體細胞胚胎的起源起源存在爭論，但絕大多數(shù)體細胞胚胎起源于單細胞。細胞胚發(fā)生的實質(zhì)是細胞分化，細胞在離體培養(yǎng)條件下，誘導部分基因開放，實現(xiàn)遺傳信息的表達。四、體細胞胚胎發(fā)生的機理第33頁,共43頁，2024年2月25日，星期天

2.體細胞胚胎發(fā)生機理

體胚特點◆極性單個胚性細胞第一次分裂多為不均等分裂，頂細胞繼續(xù)分裂形成多細胞原胚，基細胞進行少數(shù)幾次分裂形成胚柄。極性獲得的誘因是激素和外界刺激。

◆生理隔離在早期胚性細胞與周圍細胞存在胞間連絲，但是隨著胚性細胞的發(fā)育，細胞壁加厚，胞間連絲消失或被堵塞（類似小孢子發(fā)生）。第34頁,共43頁，2024年2月25日，星期天3.體細胞胚胎發(fā)生過程中的的生理生化（1）蛋白質(zhì)與核酸代謝

胚性細胞DNA、RNA以及蛋白質(zhì)的合成更活躍。（2）多胺代謝變化內(nèi)源多胺含量升高。（3）糖類、礦質(zhì)營養(yǎng)變化淀粉、可溶性糖含量增加，如胡蘿卜胚性愈傷組織淀粉含量高出非胚性愈傷組織的15~40倍（4）內(nèi)源激素變化同工酶和內(nèi)源激素合成變化明顯。（5）活性氧代謝變化第35頁,共43頁，2024年2月25日，星期天1.胚狀體的數(shù)量比不定芽多；2.胚狀體可制成人工種子，便于運輸和貯藏；3.胚狀體的有性后代遺傳性更接近母體植株。

胚狀體形成植株的優(yōu)點第36頁,共43頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)影響植物離體形態(tài)發(fā)生的因素一、植物種類和基因型

1.植物種類不同難易程度不同，被子植物比裸子植物容易。

2.同一物種不同基因型間存在較大差別。二、培養(yǎng)材料的生理狀態(tài)

1.發(fā)育年齡：一般幼態(tài)比老態(tài)組織形態(tài)發(fā)生能力高。

2.培養(yǎng)器官或組織類型：細胞分裂旺盛的器官較好。

3.培養(yǎng)時間和細胞倍性：一般取處于旺盛生長期的愈傷來誘導器官形成。第37頁,共43頁，2024年2月25日，星期天三、培養(yǎng)基1.營養(yǎng)成分

一般認為，培養(yǎng)基中的銨態(tài)氮和K+有利于胚狀體形成，提高無機磷的含量可促進器官發(fā)生。

莖尖培養(yǎng)和芽誘導培養(yǎng)基主要是MS及其修改的培養(yǎng)基和B5培養(yǎng)基，莖尖培養(yǎng)的起始培養(yǎng)基和芽增殖的培養(yǎng)基往往是不同。

碳水化合物種類及濃度對胚狀體發(fā)育有重要作用。缺糖或低糖無法形成胚狀體。第38頁,共43頁，2024年2月25日，星期天2.植物激素及生長調(diào)節(jié)劑

（起主導作用，通過影響內(nèi)源激素的平衡起作用）（1）生長素：促進外植體生長