生物技術(shù)生物工程植物細(xì)胞工程

關(guān)于生物技術(shù)生物工程植物細(xì)胞工程

第一節(jié)概述掌握植物細(xì)胞工程基本概念及其主要內(nèi)容應(yīng)用了解植物細(xì)胞工程的研究簡(jiǎn)史、現(xiàn)狀及發(fā)展前景熱點(diǎn)第2頁,共103頁，2024年2月25日，星期天植物細(xì)胞工程的發(fā)展歷史第3頁,共103頁，2024年2月25日，星期天德國植物學(xué)家Haberlandt

植物細(xì)胞培養(yǎng)創(chuàng)始人1902年根據(jù)細(xì)胞學(xué)說（celltheory）提出植物體細(xì)胞有再生完整植株的潛在全能性----細(xì)胞全能性（totipotency）植物細(xì)胞全能性是植物細(xì)胞工程的理論基礎(chǔ)第4頁,共103頁，2024年2月25日，星期天

1904年，德國植物胚胎學(xué)家Hanning用蘿卜和辣根的胚進(jìn)行離體培養(yǎng)，提早長(zhǎng)成了小植株，首次獲得胚培養(yǎng)成功。

成熟發(fā)芽

常規(guī)：幼胚―→種子―→植物

培養(yǎng)

組織培養(yǎng)：幼胚―→植株第5頁,共103頁，2024年2月25日，星期天

1922年，Knudson對(duì)蘭花幼胚進(jìn)行培養(yǎng)獲得幼苗，克服了蘭花種子發(fā)芽難的困難。

1925年，Laibach進(jìn)行亞麻種間雜種幼胚培養(yǎng)，成功地得到了雜種植物。

1934年，White等用番茄根尖的組織培養(yǎng)，建立了第一個(gè)活躍生長(zhǎng)的無性繁殖系。

1934年，Gautheret培養(yǎng)山毛柳、黑楊的形成層組織，獲得愈傷組織形成。第6頁,共103頁，2024年2月25日，星期天

1937年，White和Went等分別發(fā)現(xiàn)B族維生素和吲哚乙酸（IAA）對(duì)培養(yǎng)的離體根生長(zhǎng)具有重要作用。

1937-1938年，Gautheret在1934年培養(yǎng)山毛柳、黑楊成功獲得愈傷組織的基礎(chǔ)上，在培養(yǎng)柳樹的培養(yǎng)基中，加入IAA和B族維生素等，使形成層的生長(zhǎng)大為增加。

第7頁,共103頁，2024年2月25日，星期天1937-1938年，Nobecourt培養(yǎng)胡蘿卜根和馬鈴薯的塊莖薄壁組織，獲得愈傷組織。將愈傷組織置于瓊脂培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，可無限發(fā)生細(xì)胞增殖，形成愈傷組織。首次從液泡化的薄壁細(xì)胞建立愈傷組織培養(yǎng)物。第8頁,共103頁，2024年2月25日，星期天

White、Gautheret、Nobecourt等科學(xué)家被譽(yù)為植物組織培養(yǎng)的奠基人。在此基礎(chǔ)上建立了植物組織培養(yǎng)的綜合培養(yǎng)基，包括無機(jī)鹽成分、有機(jī)成分和生長(zhǎng)刺激因素。這是隨后創(chuàng)立的各種培養(yǎng)基的基礎(chǔ)，同時(shí)也建立了植物組織培養(yǎng)的基本方法，成為當(dāng)今各種植物組織培養(yǎng)的技術(shù)基礎(chǔ)。第9頁,共103頁，2024年2月25日，星期天第10頁,共103頁，2024年2月25日，星期天第11頁,共103頁，2024年2月25日，星期天一.植物細(xì)胞工程基本概念：原理和方法：細(xì)胞學(xué)、生理學(xué)、分子生物學(xué)及工程學(xué)原理對(duì)象：植物細(xì)胞設(shè)計(jì)改造：植物細(xì)胞遺傳性目標(biāo)：創(chuàng)造新物種，提供名貴藥品及服務(wù)第12頁,共103頁，2024年2月25日，星期天二.植物細(xì)胞工程研究主要內(nèi)容

：植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)原生質(zhì)體培養(yǎng)和融合技術(shù)植物的快速繁殖和人工種子植物染色體工程轉(zhuǎn)基因技術(shù)第13頁,共103頁，2024年2月25日，星期天

植物細(xì)胞工程熱點(diǎn)1.在無菌和人工控制的條件下，采用植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)植物的細(xì)胞，組織，器官以獲得有藥用價(jià)值的次生代謝產(chǎn)物。2.采用植物的遺傳操作技術(shù)改變植物或植物細(xì)胞的原有性狀和功能，獲得具有優(yōu)良性狀的植株或植物細(xì)胞，生產(chǎn)有藥用價(jià)值的次生代謝產(chǎn)物。第14頁,共103頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)特性及主要培養(yǎng)技術(shù)

第15頁,共103頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞的全能性:一個(gè)細(xì)胞具有產(chǎn)生完整生物個(gè)體的固有能力。一、重要概念第16頁,共103頁，2024年2月25日，星期天植物干細(xì)胞：植物胚性細(xì)胞（embryogeniccells）即合子。分化的根莖葉中仍保留少數(shù)未分化或分化程度不高的細(xì)胞（遺留的胚性細(xì)胞）一、重要概念第17頁,共103頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞的脫分化（dedifferentiation):特定條件下，分化細(xì)胞被誘導(dǎo)，基因活動(dòng)模式發(fā)生變化，改變?cè)械陌l(fā)育途徑，失去原有的分化狀態(tài)，轉(zhuǎn)變?yōu)榫叻稚芰Φ呐咝约?xì)胞。已分化細(xì)胞要表現(xiàn)全能性，先要脫分化成分生細(xì)胞，后再分化形成胚胎發(fā)育成植株脫分化條件：創(chuàng)傷和外源激素。一、重要概念第18頁,共103頁，2024年2月25日，星期天外植體(explant)：植物體上取出的用于培養(yǎng)和分離細(xì)胞的組織或器官愈傷組織：植物的傷口或外植體的傷口長(zhǎng)出的細(xì)胞團(tuán)，既是組織，又是脫分化細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物：保持植物的抗逆性，抗病性和抗蟲性，及擔(dān)當(dāng)信號(hào)分子。一、重要概念第19頁,共103頁，2024年2月25日，星期天一、重要概念植物組織培養(yǎng)在無菌條件下，將離體的植物器官(如根尖、莖尖、葉、花、未成熟的果實(shí)、種子等)、組織(如形成層、花藥組織、胚乳、皮層等)、細(xì)胞(如體細(xì)胞、生殖細(xì)胞等)、胚胎(如成熟和未成熟的胚)、原生質(zhì)體(如脫壁后仍具有生活力的原生質(zhì)體)，培養(yǎng)在人工培養(yǎng)基上，給予適宜的培養(yǎng)條件，誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織，或潛伏芽等，或長(zhǎng)成完整的植株，又分為植株培養(yǎng)、胚胎培養(yǎng)、器官培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)等。第20頁,共103頁，2024年2月25日，星期天延遲期：細(xì)胞數(shù)恒定，高RNA含量，高蛋白質(zhì)合成能力；加速期：細(xì)胞快速生長(zhǎng)期。細(xì)胞數(shù)、DNA和蛋白質(zhì)濃度增加，有絲分裂活性、RNA含量和蛋白質(zhì)合成能力減少；對(duì)數(shù)期：介于最大生長(zhǎng)率和蛋白質(zhì)合成完全停止期之間。增加細(xì)胞鮮重、干重及RNA酶活性，蛋白質(zhì)合成能力完全減退；穩(wěn)定期：細(xì)胞數(shù)穩(wěn)定。細(xì)胞高液泡化，極度脆弱，高度分化及高濃度有機(jī)化合物。二、培養(yǎng)植物細(xì)胞四個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期第21頁,共103頁，2024年2月25日，星期天

（1）植物細(xì)胞有獨(dú)特的培養(yǎng)時(shí)間及特征：重量的增加在對(duì)數(shù)期，次生代謝產(chǎn)物積累在穩(wěn)定期（2）植物細(xì)胞很少單一細(xì)胞生長(zhǎng)，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期分泌量蛋白和粘多糖，以非均相集合的細(xì)胞團(tuán)懸浮生長(zhǎng)。（3）植物細(xì)胞好氣，培養(yǎng)過程需供氣及攪拌，（4）植物細(xì)胞較微生物細(xì)胞大得多，纖維素細(xì)胞壁，細(xì)胞壁脆弱，抗剪切能力小，傳統(tǒng)的攪拌式反應(yīng)器極易損傷細(xì)胞壁三、植物細(xì)胞的培養(yǎng)特點(diǎn)第22頁,共103頁，2024年2月25日，星期天

（5）具有群體效應(yīng)、無錨定依賴性及接觸抑制性；（6）培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)物滯留于細(xì)胞內(nèi)，且產(chǎn)量較低；（7）培養(yǎng)過程具有結(jié)構(gòu)與功能全能性。經(jīng)過增殖與分化，能發(fā)育成為植株

三、植物細(xì)胞的培養(yǎng)特點(diǎn)第23頁,共103頁，2024年2月25日，星期天（1）必需元素大量元素：氮、磷、鉀、鈣、鎂、硫等微量元素：硼、錳、鋅、鉬、銅、鈷、氯等（2）無機(jī)氮源，硝酸鹽，銨鹽為主。（3）碳源，蔗糖（4）需多種維生素?zé)熕?，B1，B6和植物生長(zhǎng)激素(生長(zhǎng)素，細(xì)胞分裂素，赤霉素，脫落酸，乙烯)。（5）需有機(jī)物：甘氨酸或水解絡(luò)酪蛋白，酵母提取液等。四、植物細(xì)胞營養(yǎng)要求第24頁,共103頁，2024年2月25日，星期天AB

A：6-BA(0mg/L)，芽（減少），根（增多）愈傷組織（一定量）

B：6-BA(0.1mg/L)，芽（適量），根（適量）愈傷組織（一定量）

第25頁,共103頁，2024年2月25日，星期天A：NAA0mg/L，芽（少），根（無）

B：NAA0.1mg/L，芽（少），根（無），愈傷組織（少量）

C：NAA5.0mg/L，芽（少），根（多），愈傷組織（一定量ABC

第26頁,共103頁，2024年2月25日，星期天常用培養(yǎng)基MS、N6、B6、RM-1964、KM-8p等。MS培養(yǎng)基是目前應(yīng)用最多最普遍的培養(yǎng)基。無機(jī)鹽的濃度較高，能保證組織培養(yǎng)生長(zhǎng)所需的礦物營養(yǎng)。五、植物細(xì)胞培養(yǎng)基第27頁,共103頁，2024年2月25日，星期天

貯備液（母液）的配制

為什么要配制母液？

1）、方便

2）、準(zhǔn)確（有些成分量太?。?/p>

以MS培養(yǎng)基配制為例：第28頁,共103頁，2024年2月25日，星期天1、大量元素母液的配制

各成分按照表1培養(yǎng)基濃度含量擴(kuò)大10倍，按順序逐步混合。后用蒸餾水定容到1000ml的容量瓶中，即為10倍的大量元素母液。倒入細(xì)口瓶，貼好標(biāo)簽保存于冰箱中。配制培養(yǎng)基時(shí)，每配1L培養(yǎng)基取此液100ml。

第29頁,共103頁，2024年2月25日，星期天注意：(1)某些無機(jī)成分如Ca2+、SO42一、Mg2十和H2PO4一等在一起可能發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生沉淀物。為避免此現(xiàn)象發(fā)生，母液配制時(shí)要用純度高的重蒸餾水溶解，藥品采用等級(jí)較高的分析純，各種化學(xué)藥品必須先以少量重蒸餾水使其充分溶解后才能混合，混合時(shí)應(yīng)注意先后順序。特別應(yīng)將Ca2+、SO42一、Mg2十和H2PO4一等離子錯(cuò)開混合，速度宜慢，邊攪拌邊混合。

(2)CaCl2·2H2O要在最后單獨(dú)加入，在溶解CaCl2·2H2O時(shí)，蒸餾水需加熱沸騰，除去水中的CO2，以防沉淀。另外，CaCl2·2H2O放入沸水中易沸騰，操作時(shí)要防止其溢出。

第30頁,共103頁，2024年2月25日，星期天２、微量元素母液的配制

MS培養(yǎng)基的微量元素?zé)o機(jī)鹽由7種化合物（除Fe）組成。微量元素用量較少，特別是

CuSO4·5H2O、

CoCl2·6H2O

，因此在配制中分微量Ⅰ、Ⅱ配制。按照表2，表3配方，用感量為0.0001g的分析天平稱量，其它同大量元素。配制培養(yǎng)基時(shí)，每配制1L培養(yǎng)基，取微量Ⅰ10ml，微量Ⅱ１ml

第31頁,共103頁，2024年2月25日，星期天第32頁,共103頁，2024年2月25日，星期天3、鐵鹽母液的配制

鐵鹽不是都需要單獨(dú)配成母液，如檸檬酸鐵，只需和大量元素一起配成母液即可。目前常用的鐵鹽是硫酸亞鐵和乙二胺四乙酸二鈉的螯合物，必須單獨(dú)配成母液。這種螯合物使用起來方便，又比較穩(wěn)定，不易發(fā)生沉淀。配制方法同上，直接用蒸餾水加熱攪拌溶解。配制培養(yǎng)基時(shí)，配制1L取此液10ml。

第33頁,共103頁，2024年2月25日，星期天在配制鐵鹽時(shí)，如果加熱攪拌時(shí)間過短，會(huì)造成FeS04和Na2EDTA鰲合不徹底，此時(shí)若將其冷藏，F(xiàn)eS04會(huì)結(jié)晶析出。為避免此現(xiàn)象發(fā)生，配制鐵鹽母液時(shí)，F(xiàn)eS04和Na2EDTA應(yīng)分別加熱溶解后混合，并置于加熱攪拌器上不斷攪拌至溶液呈金黃色(約加熱20-30min)，調(diào)pH值至5.5，室溫放置冷卻后，再冷藏。第34頁,共103頁，2024年2月25日，星期天4、有機(jī)母液的配制

MS培養(yǎng)基的有機(jī)成分有甘氨酸、肌醇、煙酸、鹽酸硫胺素和鹽酸吡哆素。培養(yǎng)基中的有機(jī)成分原則上應(yīng)分別單獨(dú)配制。配制直接用蒸餾水溶解，注意稱量時(shí)用電子分析天平。并貯存在棕色無菌瓶中。

配制生物素、葉酸，用稀氨水溶解，然后定容。第35頁,共103頁，2024年2月25日，星期天5、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑母液配制

一般植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑母液的配制的終濃度以0.5mg/ml為好，需要注意的是：

（１）配制生長(zhǎng)素類，例如IAA、NAA、2.4-D、IBA，應(yīng)先用少量95%乙醇或無水乙醇充分溶解，或者用1mol/L的NaOH溶解，然后用蒸餾水定容到一定的濃度。以后者效果好。

（２）細(xì)胞分裂素，例如KT，應(yīng)先用少量95%乙醇或無水乙醇加3~4滴1mol/L的鹽酸溶解，或直接用1mol/LHCl溶解，再用蒸餾水定容。

（３）GA3以95%酒精溶解（不耐高溫，過濾滅菌）

保存在棕色試劑瓶中。第36頁,共103頁，2024年2月25日，星期天

注意：

所有母液都要貼上標(biāo)簽，注明名稱、配制倍數(shù)、日期，所有的母液都應(yīng)保存在0~4℃冰箱中，若母液出現(xiàn)沉淀或霉團(tuán)則不能繼續(xù)使用。

第37頁,共103頁，2024年2月25日，星期天

White的無機(jī)鹽含量較低，適于生根培養(yǎng)。KM-8p主要用于原生質(zhì)體培養(yǎng)，含幾乎所有單糖和維生素、呼吸代謝中的主要有機(jī)酸。凡花藥培養(yǎng)中常用培養(yǎng)基，成分較簡(jiǎn)單，且KN03和(NH)2N04含高。第38頁,共103頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)基的配制

1、計(jì)量

根據(jù)配制培養(yǎng)基的量和母液的濃度計(jì)算需要吸取母液的量，計(jì)算公式：吸取量ml=培養(yǎng)基中物質(zhì)的含量（mg/L）×1000ml/母液濃度（mg/L）。

2、移液

取燒杯一只，加入少量的蒸餾水，按照計(jì)算吸取母液的量依次吸取各母液置于燒杯中備用。

第39頁,共103頁，2024年2月25日，星期天3、稱取瓊脂蔗糖備用

4、融化

用量杯量取600～700ml的蒸餾水放在電爐上，加入瓊脂，邊加熱邊用玻璃棒攪拌，直到液體呈半透明狀將其取下，加入蔗糖。

大燒杯底的外表面不能沾水，否則加熱時(shí)燒杯容易炸裂，使溶液外溢，造成燙傷。

第40頁,共103頁，2024年2月25日，星期天5、混合

將融化的瓊脂和母液充分混合，用蒸餾水定容到1000ml，來回混合幾次。

6、調(diào)pH

用滴管吸取物質(zhì)的量濃度為1mol/L的NaOH或HCl溶液，逐滴滴入溶化的培養(yǎng)基中，邊滴邊攪拌，并隨時(shí)用精密的pH試紙(5.4～7.0)測(cè)培養(yǎng)基的pH，一直到培養(yǎng)基的pH達(dá)到要求為止(在調(diào)制時(shí)要比目標(biāo)pH值偏高0.2～0.5個(gè)單位，因?yàn)榕囵B(yǎng)基在滅菌過程中由于糖等物質(zhì)的降解，pH值會(huì)下降0.2～0.5個(gè)單位左右)。

第41頁,共103頁，2024年2月25日，星期天7、分裝

溶化的培養(yǎng)基應(yīng)該趁熱分裝。注意不要讓培養(yǎng)基沾到瓶口和瓶壁上。錐形瓶中培養(yǎng)基的量約為錐形瓶容量的1/5～1/4。每1L培養(yǎng)基，可分裝20～30瓶。

8、包扎

用封口膜封口，外邊可加一層牛皮紙，扎好繩子，用鉛筆或碳素墨水筆在牛皮紙上寫上培養(yǎng)基的代號(hào)。

9、培養(yǎng)基的滅菌

第42頁,共103頁，2024年2月25日，星期天（一）植物細(xì)胞的獲得1.外植體直接分離法：機(jī)械切割、組織破碎2.愈傷組織分離法：制備小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞懸液3.原生質(zhì)體再生法：纖維素和果膠酶混合處理外植體或愈傷組織，分離原生質(zhì)體，再生培養(yǎng)基中培養(yǎng)，原生質(zhì)體細(xì)胞壁再生。六、植物細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)第43頁,共103頁，2024年2月25日，星期天1.單細(xì)胞的培養(yǎng)（1）看護(hù)培養(yǎng)法（nurseculture）：在單細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境里加入愈傷組織同時(shí)培養(yǎng)。愈傷組織提供促細(xì)胞分裂的物質(zhì)等，傳遞生物信息，使細(xì)胞分裂增殖。即愈傷組織看護(hù)單細(xì)胞適用于難于培養(yǎng)的植物種類

（二）植物細(xì)胞的培養(yǎng)方法第44頁,共103頁，2024年2月25日，星期天

（2）微室培養(yǎng)法：?jiǎn)渭?xì)胞懸液接種到人工制造一個(gè)小室（如凹玻片與蓋玻片組成的微室），內(nèi)含少量培養(yǎng)基，密封培養(yǎng)，使其分裂增殖形成細(xì)胞團(tuán)的方法連續(xù)觀察，通氣性差

1.單細(xì)胞的培養(yǎng)第45頁,共103頁，2024年2月25日，星期天（3）平板培養(yǎng)法：將制備好的單細(xì)胞懸液，按一定的細(xì)胞密度，接種于固體培養(yǎng)基上，或與融化的瓊脂培養(yǎng)基均勻混合，并平鋪一薄層在培養(yǎng)皿底上的培養(yǎng)方法

每個(gè)平板上形成的細(xì)胞團(tuán)數(shù)植板率（%）= -------------------------------×100%該平板上接種的細(xì)胞數(shù)1.單細(xì)胞的培養(yǎng)第46頁,共103頁，2024年2月25日，星期天

（4）條件培養(yǎng)法：接種于條件培養(yǎng)基上形成的細(xì)胞系

條件培養(yǎng)基：培養(yǎng)過細(xì)胞的培養(yǎng)基上清，有植物生長(zhǎng)激素等殘留，用于制備成固體培養(yǎng)基。1.單細(xì)胞的培養(yǎng)第47頁,共103頁，2024年2月25日，星期天指將植物單倍體細(xì)胞花藥培養(yǎng)成單倍體植株或經(jīng)過染色體加倍成純二倍體植株?；ㄋ幣囵B(yǎng)的基本程序是：

外植體(花蕾)選擇預(yù)處理—花蕾消毒—取花藥—接種—誘導(dǎo)培養(yǎng)—分化培養(yǎng)2.單倍體細(xì)胞的培養(yǎng)（花藥培養(yǎng)）第48頁,共103頁，2024年2月25日，星期天3.愈傷組織培養(yǎng)愈傷組織，為脫分化細(xì)胞，具再分化的能力，可培養(yǎng)用于次生代謝物的生產(chǎn)，或再生為植株。第49頁,共103頁，2024年2月25日，星期天

(cell

suspension

culture)游離植物細(xì)胞懸浮于液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，細(xì)胞總數(shù)不斷增加，產(chǎn)量達(dá)最高點(diǎn)后生長(zhǎng)趨于停止，然后進(jìn)行移植繼代培養(yǎng)方法4細(xì)胞懸浮培養(yǎng)法單細(xì)胞懸浮0.25×105~0.5×105細(xì)胞/ml,第50頁,共103頁，2024年2月25日，星期天1、直接篩選法

有新表型或感觀上出現(xiàn)可測(cè)定的差異進(jìn)行選擇的方法2、間接篩選法

用與突變表現(xiàn)型具有某種相關(guān)的特性為指標(biāo)篩選

3、綠島法在植株上使葉面細(xì)胞產(chǎn)生突變并創(chuàng)造選擇壓力，令抗性突變細(xì)胞正常生長(zhǎng)形成綠色斑點(diǎn)，謂之“綠島”，切下綠島即是突變細(xì)胞，經(jīng)分散和培養(yǎng)后即可分化為完整突變植株七、細(xì)胞突變體篩選技術(shù)第51頁,共103頁，2024年2月25日，星期天

干燥保存法、液體石蠟覆蓋法、低溫保存法低壓低氧保存法超低溫深凍保存法

八、種質(zhì)保存

第52頁,共103頁，2024年2月25日，星期天

超低溫深凍保存法

材料：愈傷組織、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、原生質(zhì)體、花粉、花粉胚、體細(xì)胞胚狀體、莖尖分生組織、小植株及莖芽-196℃液氮冰凍保護(hù)劑二甲亞砜（DMSO）、甘油、山梨糖及蔗糖等，復(fù)合成分較單一成分效果佳，5%DMSO+1mol/L山梨醇存活率提高10倍左右。八、種質(zhì)保存

第53頁,共103頁，2024年2月25日，星期天

第三節(jié)原生質(zhì)體培養(yǎng)和融合技術(shù)

第54頁,共103頁，2024年2月25日，星期天指除去細(xì)胞壁的細(xì)胞或一個(gè)被質(zhì)膜所包圍的且具有生活力的裸露細(xì)胞。一、原生質(zhì)體的概念第55頁,共103頁，2024年2月25日，星期天二、原生質(zhì)體培養(yǎng)技術(shù)

用酶除去植物體細(xì)胞的細(xì)胞壁，獲得原生質(zhì)體。原生質(zhì)體在良好的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)分裂，細(xì)胞壁再生，形成愈傷組織，誘導(dǎo)愈傷組織分化，長(zhǎng)出莖、葉，根而形成植株。第56頁,共103頁，2024年2月25日，星期天（一）材料準(zhǔn)備無菌試管苗葉片上胚軸和子葉培養(yǎng)細(xì)胞第57頁,共103頁，2024年2月25日，星期天（二）原生質(zhì)體的制備1，酶處理纖維素酶類半纖維素酶果膠酶類酶溶劑：原生質(zhì)體培養(yǎng)基或特殊配制。滲透壓調(diào)節(jié)劑：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。第58頁,共103頁，2024年2月25日，星期天2，原生質(zhì)體的收集和純化飄浮法：常用的飄浮劑有蔗糖沉淀法：常用甘露醇作為滲透壓調(diào)節(jié)劑，先將酶液洗出干凈，再用Percoll飄浮一次。Percoll一種包有乙烯吡咯烷酮的硅膠顆粒。（二）原生質(zhì)體的制備第59頁,共103頁，2024年2月25日，星期天

目測(cè)法：在顯微鏡下觀察，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)、流動(dòng)性確定原生質(zhì)體活力。

FDA法：FDA（二乙酸熒光素）是一種非極性物質(zhì)，能自由地穿越細(xì)胞質(zhì)膜，在活細(xì)胞內(nèi)，F(xiàn)DA被酯酶裂解即發(fā)熒光（熒光素），熒光素不能自由通過質(zhì)膜。

伊凡藍(lán)法：質(zhì)膜受到嚴(yán)重?fù)p壞使細(xì)胞被染色（三）原生質(zhì)體活力檢測(cè)第60頁,共103頁，2024年2月25日，星期天

1.液體淺層培養(yǎng)2.固體培養(yǎng)3.液－固雙層培養(yǎng)4.瓊脂糖珠培養(yǎng)

（四）原生質(zhì)體培養(yǎng)方法等滲培養(yǎng)基第61頁,共103頁，2024年2月25日，星期天或體細(xì)胞種子概念任何一種離體繁殖體包埋在含有營養(yǎng)成分和保護(hù)功能的物質(zhì)中,在適宜條件下發(fā)芽出苗，發(fā)育成完整的植株，均可稱之為人工種子。第一類是裸露的或休眠的繁殖體，適當(dāng)干燥的體細(xì)胞胚、休眠的微鱗莖和微塊莖等

第二類為人工種皮包被的繁殖體，一些體細(xì)胞胚、原球莖等海藻酸鈉作包埋第三類是水凝膠包埋再包被人工種皮的繁殖體，大多數(shù)體細(xì)胞胚、不定芽、莖尖等

人工種子第62頁,共103頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞分裂與細(xì)胞壁再生愈傷組織形成愈傷組織分化植株再生（五）愈傷組織形成和植株再生第63頁,共103頁，2024年2月25日，星期天1.提高變異頻率2.細(xì)胞工程技術(shù)進(jìn)行遺傳重組的材料，細(xì)胞融合和基因轉(zhuǎn)移必需在原生質(zhì)體上進(jìn)行。

三原生質(zhì)體培養(yǎng)意義第64頁,共103頁，2024年2月25日，星期天體細(xì)胞雜交一）類型兩大類：

對(duì)稱融合（asymmetricfusion）－兩個(gè)完整的細(xì)胞原生質(zhì)體融合。

非對(duì)稱融合（symmetricfusion）－利用物理或化學(xué)方法使某親本的核或細(xì)胞質(zhì)失活后再進(jìn)行融合。核失活－X射線，碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸質(zhì)失活－羅丹明（R－6－G，抑制線粒體氧化磷酸化。四、原生質(zhì)體融合技術(shù)第65頁,共103頁，2024年2月25日，星期天

1．材料準(zhǔn)備2．原生質(zhì)體的制備3．融合方法PEG，電融合4．雜種細(xì)胞選擇系統(tǒng)與雜種植株鑒定5.細(xì)胞壁再生愈傷組織形成和植株再生二）融合過程第66頁,共103頁，2024年2月25日，星期天

3．融合方法PEG，電融合二）融合過程按比例混合雙親原生質(zhì)體→滴加

PEG搖勻靜置→滴加高鈣高pH液，搖勻靜置→滴加原生質(zhì)體培養(yǎng)液洗滌數(shù)次→離心得原生質(zhì)體細(xì)胞團(tuán)→篩選再生雜合細(xì)胞。第67頁,共103頁，2024年2月25日，星期天

1）雜種細(xì)胞的選擇系統(tǒng)外觀選擇互補(bǔ)選擇熒光標(biāo)記選擇4.雜種細(xì)胞選擇系統(tǒng)與雜種植株鑒定第68頁,共103頁，2024年2月25日，星期天2）體細(xì)胞雜種的鑒定

形態(tài)鑒定：根據(jù)雙親的形態(tài)學(xué)性狀觀察進(jìn)行鑒定。

細(xì)胞學(xué)鑒定：細(xì)胞器鑒定、染色體鑒定。

生化鑒定：同功酶鑒定。

分子鑒定：RFLP鑒定、RAPD標(biāo)記鑒定。4雜種細(xì)胞選擇系統(tǒng)與雜種植株的鑒定第69頁,共103頁，2024年2月25日，星期天

RFLP基因型之間限制性片段長(zhǎng)度的差異

RAPD建立在PCR基礎(chǔ)之上的一種可對(duì)整個(gè)未知序列的基因組進(jìn)行多態(tài)性分析的分子技術(shù)4雜種細(xì)胞選擇系統(tǒng)與雜種植株的鑒定第70頁,共103頁，2024年2月25日，星期天第71頁,共103頁，2024年2月25日，星期天原生質(zhì)體培養(yǎng)1~3天，細(xì)胞壁再生再生細(xì)胞一旦分裂，繼續(xù)生長(zhǎng)1形成細(xì)胞團(tuán)，發(fā)育成愈傷組織，誘導(dǎo)分化出芽及根再生為完整植株；2形成胚狀體，再產(chǎn)生植株；

5、細(xì)胞壁再生愈傷組織形成和植株再生第72頁,共103頁，2024年2月25日，星期天

1、植物育種中的核質(zhì)替換2、細(xì)胞質(zhì)雜種的獲得3、遠(yuǎn)緣雜交創(chuàng)造新物種4、細(xì)胞器的互作研究三）、融合技術(shù)應(yīng)用第73頁,共103頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)

第74頁,共103頁，2024年2月25日，星期天植物細(xì)胞規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)要點(diǎn)（1）細(xì)胞系的建立和選擇有效成分分析懸浮細(xì)胞系單細(xì)胞培養(yǎng)與篩選細(xì)胞增殖第75頁,共103頁，2024年2月25日，星期天（2）優(yōu)良細(xì)胞系的增殖培養(yǎng)

所選擇的優(yōu)良細(xì)胞系，進(jìn)行大規(guī)模繁殖，得到足夠的細(xì)胞是建立細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)體系的中間環(huán)節(jié)。第76頁,共103頁，2024年2月25日，星期天

（3）大規(guī)模培養(yǎng)體系的建立一步法逐級(jí)放大：對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)與目的產(chǎn)物合成同步的類型，一般采用此方法建立大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)。兩步法：用于目的產(chǎn)物合成在細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育到一定時(shí)期進(jìn)行，細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成需要不同的培養(yǎng)基的類型。先在細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)大批量細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至合成產(chǎn)物的階段后，再將其轉(zhuǎn)入到產(chǎn)物合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)。如果采用固相培養(yǎng)方式生產(chǎn)次生產(chǎn)物，一般均需采用兩步法建立體系。第77頁,共103頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)方式的選擇：分批培養(yǎng)間歇培養(yǎng)－流加間歇培養(yǎng)兩級(jí)或多級(jí)間歇培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)－單級(jí)連續(xù)培養(yǎng)多級(jí)連續(xù)培養(yǎng)回流式連續(xù)培養(yǎng)固定化細(xì)胞培養(yǎng)第78頁,共103頁，2024年2月25日，星期天提高細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物的途徑

（1）明確植物細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成的關(guān)系生長(zhǎng)偶聯(lián)型產(chǎn)物合成與細(xì)胞生長(zhǎng)成正比。如長(zhǎng)春花屬植物中的長(zhǎng)春花堿的合成、煙草細(xì)胞的煙堿合成、薯蕷屬植物中的薯蕷皂甙的合成等；中間型產(chǎn)物僅在細(xì)胞生長(zhǎng)下降時(shí)合成，細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)期或停止生長(zhǎng)產(chǎn)物都不合成。蒽醌類物質(zhì)合成的植物細(xì)胞，托品類生物堿類合成的植物細(xì)胞等屬于此類型；非生長(zhǎng)偶聯(lián)型產(chǎn)物合成在細(xì)胞生長(zhǎng)停止以后。如紫草寧的合成。第79頁,共103頁，2024年2月25日，星期天（2）選擇適宜的起始材料

首先必須選擇能夠高效合成目的產(chǎn)物的植物種類。再此前提下，起始培養(yǎng)材料還應(yīng)考慮器官和組織特異性，通常選取自然狀態(tài)下能夠積累次生產(chǎn)物的部位，這樣的細(xì)胞經(jīng)過培養(yǎng)后常具有合成目的產(chǎn)物的能力，或比較容易誘導(dǎo)合成目的產(chǎn)物。同時(shí)要篩選高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的細(xì)胞株系。

第80頁,共103頁，2024年2月25日，星期天（3）選擇合適的培養(yǎng)基成分

一般來說，增加培養(yǎng)基的N，P、K的濃度能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，而適當(dāng)增加糖濃度有利于次生產(chǎn)物的合成。培養(yǎng)基的成分包括培養(yǎng)條件要通過一定的實(shí)驗(yàn)才能選擇出既有利于細(xì)胞大量生長(zhǎng)繁殖又有利于次生代謝產(chǎn)物大量產(chǎn)生的培養(yǎng)基。

第81頁,共103頁，2024年2月25日，星期天

（4）外因溫度

pH

營養(yǎng)狀況通氣狀況

第82頁,共103頁，2024年2月25日，星期天（5）激發(fā)子的應(yīng)用

植物細(xì)胞次生代謝除了自身的遺傳或發(fā)育基礎(chǔ)外，通常還與誘導(dǎo)因子有關(guān)。在一些不良環(huán)境或有微生物侵入的情況下，細(xì)胞次生代謝活動(dòng)顯著增強(qiáng)。因此，人為合理的應(yīng)用這些誘導(dǎo)因子，就有可能提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。

激發(fā)子也稱誘導(dǎo)子，是指能夠誘導(dǎo)植物細(xì)胞中一個(gè)反應(yīng)，并形成細(xì)胞特征性自身防御反應(yīng)的分子。

A、非生物激發(fā)子，如輻射、金屬離子等

B、生物激發(fā)子，（外源激發(fā)子，多來源于微生物，內(nèi)源激發(fā)子，來源于植物本身的物質(zhì)，如降解細(xì)胞壁的酶類，細(xì)胞碎片、寡聚糖等。

第83頁,共103頁，2024年2月25日，星期天（6）培養(yǎng)技術(shù)的選擇

包括對(duì)反應(yīng)器的選擇和對(duì)培養(yǎng)方式的選擇，就目前的技術(shù)基礎(chǔ)來講，固定化培養(yǎng)是植物細(xì)胞規(guī)模化生產(chǎn)較為理想的系統(tǒng)。

為了同時(shí)滿足細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成的需要，通常需要在不同階段使用不同的培養(yǎng)基，即兩階段培養(yǎng)

為了解決產(chǎn)物對(duì)合成的反饋抑制可以采用兩相培養(yǎng)技術(shù)，

液-液系統(tǒng)：分離相常用的有液體石蠟、烷類化合物、甘油等

液-固系統(tǒng)：常用的有活性炭、硅酸鎂載體、沸石、蠶絲、樹脂等。

一般來說，提取相的選擇目標(biāo)是具有較大的分離能力，同時(shí)對(duì)于沒有毒副作用，不影響產(chǎn)物的化學(xué)穩(wěn)定性。第84頁,共103頁，2024年2月25日，星期天第五節(jié)植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)

第85頁,共103頁，2024年2月25日，星期天TheworldaccordingtoMonsanto第86頁,共103頁，2024年2月25日，星期天將目的基因插入到經(jīng)過改造的T-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染將目的基因穩(wěn)定的整合到植物的基因組中，并在子代中得到有效的表達(dá)，然后通過細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)再生出轉(zhuǎn)基因植株.轉(zhuǎn)基因植物（Transgeneplant）利用植物遺傳工程進(jìn)行DNA重組，將優(yōu)良的目的基因穩(wěn)定的整合到植物的基因組中，并在子代中得到有效的表達(dá)，獲得具有新的遺傳性狀的植物體。

一植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)第87頁,共103頁，2024年2月25日，星期天1生產(chǎn)抗體、重組疫苗和多肽類藥物

2作為生物反應(yīng)器系統(tǒng)大規(guī)模地生產(chǎn)各種蛋白質(zhì)和多肽等藥物，促紅細(xì)胞生成素、表皮生長(zhǎng)因子、生長(zhǎng)激素、單克隆抗體、干擾素和疫苗用抗原蛋白。轉(zhuǎn)基因植物應(yīng)用第88頁,共103頁，2024年2月25日，星期天基因的獲得、載體系統(tǒng)、基因轉(zhuǎn)化、基因的表達(dá)與分析、細(xì)胞和組織培養(yǎng)再生出植株。

二植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)過程：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法第89頁,共103頁，2024年2月25日，星期天基因轉(zhuǎn)化---將外源基因?qū)爰?xì)胞方法第一類：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)，間接轉(zhuǎn)化利用農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒將外源基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞。轉(zhuǎn)基因植物中約80%是此轉(zhuǎn)化而來第二類：直接轉(zhuǎn)化技術(shù)。基因槍法、電激法、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、碳化硅纖維介導(dǎo)法和花粉管通道法等。三基因?qū)爰夹g(shù)第90頁,