深部真菌的研究進展

關于深部真菌的研究進展

深部真菌感染是指由深部真菌或條件致病性真菌(機會致病性真菌)侵犯內臟引起的感染。

近年來，深部真菌感染的發(fā)病率和死亡率呈持續(xù)上升趨勢，涉及到臨床各個學科，如：肺部真菌感染，消化道真菌感染，血液病伴發(fā)真菌感染，腫瘤伴發(fā)真菌感染，外科燒傷伴發(fā)真菌感染，婦科真菌感染，泌尿系統(tǒng)真菌感染，免疫缺陷患者真菌感染，骨髓移植患者的真菌感染以及艾滋病的真菌感染，。

真菌的概況第2頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

深部真菌的流行因素廣譜抗生素皮質類固醇用免疫抑制劑化療的病人HIV感染病人腫瘤的病人肺部疾病的人手術燒傷病人ICU的病人血液透析病人導管、插管等1．高危人群

對容易感染系統(tǒng)性真菌感染的患者，應及時發(fā)現，及早進行預防，尤其是在住院病人中更應該注意防止院內感染。第3頁,共56頁，2024年2月25日，星期天2、高危因素

深部真菌的流行因素血液腫瘤骨髓移植實質器官移植HIV感染其他免疫障礙第4頁,共56頁，2024年2月25日，星期天骨髓移植：血液腫瘤：2、高危因素的詳解

白血病進行化療而引起粒細胞減少是引起真菌感染的一個重要原因。文獻報導20%-50%并發(fā)有侵襲性真菌感染。其中最常見的致病真菌是白念珠菌和曲霉菌。其次成人易感染光滑念珠菌，兒童易感染近平滑念珠菌。粒細胞減少并發(fā)深部真菌感染是主要致死原因。

易發(fā)生侵襲性曲霉菌感染，主要是因為宿主移植反應而應用免疫抑制劑,皮質類固醇所引起。文獻報導，有84%的病人是死于曲霉菌或其他霉菌（鐮刀菌，毛孢子菌，梨頭霉）感染。第5頁,共56頁，2024年2月25日，星期天實質器官移植：2、高危因素的詳解

由于需要應用免疫抑制劑來防止排斥反應而易于導致真菌感染。如肝臟移植受體發(fā)生侵襲性真菌感染的機率約為7-24%，其中80%以上是由于念珠菌和曲菌感染，常在移植術后頭2個月內發(fā)生，死亡率達50%-70%。HIV感染：

HIV感染的免疫缺陷患者，特別容易發(fā)生真菌感染，如感染莢膜組織胞漿菌，馬爾尼青霉、球孢子菌等，一些嚴重的致死性真菌。第6頁,共56頁，2024年2月25日，星期天2、高危因素的詳解其他免疫障礙：

免疫障礙時常并發(fā)真菌感染的危險，包括院內獲得性真菌感染。以念珠菌,曲霉常見.其中曲菌是最嚴重的真菌感染之一。

曲菌有很多種可由空氣傳播，如可由醫(yī)院的通風設備傳播，醫(yī)務人員的手可傳播念珠菌引起院內感染，這也是一個重要的傳播途徑。所以洗手很重要，但尚未引起足夠的重視。第7頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

深部真菌感染的致病機理列舉1.念珠菌2.曲霉菌

念珠菌是一種芽生的酵母狀真菌，已知可以致病的常見念珠菌有：白念、熱帶、近平滑、克魯斯、星狀、克柔氏、季也蒙、光滑八種。近年來又發(fā)現非白念致病菌株有：都柏林念珠菌，解脂念珠菌，延沫念珠菌。該類病原菌可侵襲內臟系統(tǒng)甚至播散導致深部念珠菌感染。

曲霉菌病是第二大常見的院內真菌感染，曲菌為耐熱菌株，在血液內科可引起醫(yī)源性爆發(fā)感染，一旦感染曲菌常常是致死性的，常見的曲菌有煙曲菌、黃曲菌。其次是土曲菌、黑曲菌等，曲菌致病主要是其分泌某些致病因子有關。第8頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

深部真菌感染的致病機理

念珠菌致病機理：念珠菌為雙形態(tài)真菌（即酵母相和菌絲相），一般以芽生孢子的形式傳播，不引起臨床癥狀。當機體局部防御能力減退情況下孢子大量繁殖，并轉化為菌絲相黏附于黏膜細胞上使之穿孔，通過所分泌的蛋白酶及水解酶而加重炎癥損傷，并進一步繁殖擴散引起一系列的病理變化。其毒力因子主要是黏附素，它是促進念珠菌黏附于宿主細胞的生物分子。第9頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

深部真菌感染的致病機理

曲霉菌致病機理：231

煙曲菌可產生煙曲菌素，粘帚霉素和煙曲霉酸以及內毒素，通過抑制免疫反應或破壞局部組織引起疾病。這些致病因子主要通過擾亂黏膜防御功能、抑制吞噬細胞功能，降低調理作用，促進曲菌與組織黏附發(fā)揮作用。曲菌病臨床表現，如過敏性曲菌病、肺真菌球空洞、急性或慢性致死性侵入、眼部感染、鼻曲菌病以及皮膚感染。第10頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

真菌的基本知識1、真菌的定義2、真菌的分類及特性3、真菌的形態(tài)分類第11頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

真菌的定義：

真菌的基本知識真菌屬生物界，是微生物學的一個重要組成部分，其種類繁多，數量達上萬種，體積大的如蘑菇、小的幾微米需借助顯微鏡才能看到。醫(yī)學真菌都屬于微小真菌，是由菌絲和孢子組成的。菌絲呈微細的管狀，表面光滑，粗細一致，彎曲自然，菌絲兩端整齊，無色或有色、分隔或不分隔。是由孢壁、孢漿、孢核、多細胞組成的菌絲體。孢子是真菌繁殖的最小單位，為單細胞、可芽生，具有孢壁、孢漿、孢核。第12頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

真菌的基本知識第13頁,共56頁，2024年2月25日，星期天第14頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

真菌的分類及特性：

真菌包括的范圍很廣：醫(yī)學真菌、藥用真菌、工業(yè)真菌、食用真菌。我們接觸的主要是醫(yī)學真菌它包括：

（1）致病性真菌（病原性真菌）：淺部真菌—引起各種皮膚真菌病。深部真菌—引起各種原發(fā)性或繼發(fā)性的深部真菌?。ńM織胞漿菌、條件致病真菌一引起各種深部真菌感染

（2）致敏性真菌：真菌過敏癥—哮喘、過敏性肺炎、過敏性鼻炎、過敏性結膜炎、過敏性皮炎等。第15頁,共56頁，2024年2月25日，星期天（3）致毒性真菌：真菌中毒癥—真菌污染或儲藏在食物內（如甘蔗）產生的代謝產物即真菌毒素，可引起嚴重的急性或慢性中毒。（4）致癌性真菌：黃曲霉菌等多種真菌可產生致癌因子，引起肝癌等。

(5)條件致病性真菌:念珠菌、曲霉菌、毛霉菌、鐮刀菌、青霉菌等。主要引起深部（系統(tǒng)性）真菌感染。

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真菌的的病原學形態(tài)分類：（1）酵母菌：

酵母菌是一些單細胞真菌，并非系統(tǒng)演化分類的單元；酵母菌是人類文明史中被應用得最早的微生物；可在缺氧環(huán)境中生存。目前已知有1000多種酵母。

第17頁,共56頁，2024年2月25日，星期天（2）酵母樣菌（條件致病菌）：

真菌的的病原學形態(tài)分類：

念珠菌屬（白念珠菌、（熱帶念珠菌、克柔氏念珠菌、光滑念珠菌等）

第18頁,共56頁，2024年2月25日，星期天（3）霉菌（條件致病菌）：

真菌的的病原學形態(tài)分類：曲霉屬（煙曲霉、黃曲霉）、青霉屬（馬內菲青霉）、鐮刀菌屬（串珠鐮刀菌、茄病鐮刀菌）第19頁,共56頁，2024年2月25日，星期天第20頁,共56頁，2024年2月25日，星期天（4）雙相菌：

真菌的的病原學形態(tài)分類：

37℃呈酵母或孢子型，25℃呈菌絲型、組織胞漿菌第21頁,共56頁，2024年2月25日，星期天（5）細菌樣真菌：

真菌的的病原學形態(tài)分類：放線菌類（肺放線菌病）第22頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

深部真菌感染的實驗室診斷方法

真菌感染已成為嚴重危及高危患者的并發(fā)癥。艾滋病最常見的感染也是真菌感染，發(fā)病率在80-90%，致死率很高。

深部真菌或條件致病性真菌感染的診斷、治療和預防已引起世界各國醫(yī)學工作者的高度重視，也是我們醫(yī)學領域的重點研究課題。

深部真菌感染的實驗診斷，顯得更加重要，它是治療和預防深部真菌感染的前提。第23頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

深部真菌感染的實驗室診斷方法

真菌學檢查的手段：1.直接鏡檢2.真菌培養(yǎng)3.組織病理學檢查4.血清學方法：具有簡便、快速、敏感性和特異性相對較高的特點。常用方法有半乳甘露聚糖實驗，可以特異、定量檢測曲霉菌。第24頁,共56頁，2024年2月25日，星期天5.PCR技術：近年來隨著分子生物學技術發(fā)展，應用PCR技術對深部真菌病快速診斷已成為關注的焦點。方法有：分子探針、限制性酶切片段長度多態(tài)性分析（RFLP）、DNA指紋圖譜、隨機擴增DNA多態(tài)性（RAPD）用于深部念珠菌感染的診斷研究。

真菌學檢查的手段：第25頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

真菌感染實驗診斷步驟：

深部真菌感染的實驗室診斷方法

標本采集鏡檢培養(yǎng)第26頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

標本采集方法：念珠菌

①痰標本：取清晨的痰液，必須先刷牙，清洗口腔，應取深入氣管或支氣管的分泌物。鼻咽分泌物，唾液或口腔分泌物均不適宜作檢查。所取標本應放在滅菌的容器內。②便標本：取清晨第一次便，挑取不成形及帶有粘液樣的便。③尿標本：外陰清洗后，取中段尿。根據感染累及的部位不同采集不同的標本，血液科—血液，神經內科—腦脊液，或活檢組織。第27頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

曲霉菌感染是由多種曲霉引起，常侵犯肺、腦、眼、耳、鼻、皮膚粘膜、神經系統(tǒng)或骨骼，引起急慢性炎癥或肉芽腫等，嚴重者可發(fā)生曲霉敗血癥，甚至死亡，近年來又證明一些曲霉毒素可引起急性中毒和致癌。曲霉屬有18個群132個種，絕大部分為非致病菌。致病性的曲霉有：煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、土曲霉、構巢曲霉和棒曲霉、雜色曲霉、米曲霉、灰綠曲霉、聚多曲霉、亮白曲霉、日本曲霉、阿姆斯丹曲霉、焦曲霉、局限曲霉、黃柄曲霉、多育曲霉。而以煙曲霉和黃曲霉最多。系統(tǒng)性曲霉菌感染：

標本采集方法：第28頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

直接鏡檢：A、氫氧化鉀法將標本置于在玻片上，加一滴10%KOH浮載液，蓋上蓋玻片放置5~10分鐘后或直接在火焰上快速通過2~3次微加熱，輕壓蓋玻片驅逐氣泡并將標本壓薄后置于顯微鏡下檢查。先在低倍鏡下觀察有無菌絲和孢子，然后用高倍鏡觀察孢子和菌絲的形態(tài)特征、大小和排列等。對于角質標本，必要時可在10%KOH溶液中，加入終濃度為40%二甲亞砜，促進其溶解。此法適用于皮屑、甲屑、毛發(fā)、痂皮、痰、組織、耵聹、糞便等標本的直接涂片檢查。第29頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

直接鏡檢：B、膠帶粘貼法用透明膠帶直接貼于取材部位，數分鐘后揭下，充分展平后，直接置貼于加有一滴浮液的載玻片上此液可以是10%~20%的KOH，也可以采用乳酸酚棉藍染液（易于觀察）。該法常用于花斑癬患處的直接檢查。第30頁,共56頁，2024年2月25日，星期天第31頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

真菌的培養(yǎng)：A、念珠菌培養(yǎng)①沙氏培養(yǎng)法:

取標本接種于沙氏瓊脂培養(yǎng)基上，分別放置于25℃和37℃恒溫箱內48—72h，即有奶油色酵母樣菌落生長。將菌落移種到吐溫瓊脂基（小培養(yǎng)條件下）于25℃24h可產生頂端厚壁孢子,即診斷為白念珠菌。未見厚壁孢子只有假菌絲為念珠菌屬，進一步作發(fā)酵實驗和同化實驗，可鑒定為哪一種念珠菌。

②科瑪嘉顯色培養(yǎng)法：將標本接種于念珠菌顯色培養(yǎng)基(科瑪嘉顯色培養(yǎng)基）的表面，37℃24—48h，可有酵母樣菌落生長，根據菌落產生的不同顏色來鑒定念珠菌。第32頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

真菌的培養(yǎng)：B、系統(tǒng)性曲霉菌培養(yǎng)

?如果鏡檢見到曲霉菌的特點，培養(yǎng)可以直接選用察氏培基，分別放在25℃和37℃恒溫培養(yǎng)箱內，3-5天即可生長出完整的菌落。根據菌落的顏色和分生孢子頭的結構特征，鑒定曲霉菌種。

?

結構特征：分生孢子梗、頂囊、產孢結構（瓶?；蛐」＃?、分生孢子、有性期（殼細胞、閉囊殼、子囊孢子）

第33頁,共56頁，2024年2月25日，星期天白色念珠菌熱帶念珠菌第34頁,共56頁，2024年2月25日，星期天光滑念珠菌克柔念珠菌第35頁,共56頁，2024年2月25日，星期天黃曲霉煙曲霉黑曲霉第36頁,共56頁，2024年2月25日，星期天新型隱球菌墨汁涂片組織相第37頁,共56頁，2024年2月25日，星期天毛霉屬根毛霉毛霉犁頭霉第38頁,共56頁，2024年2月25日，星期天鐮刀菌第39頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

真菌感染，不論淺部真菌或深部真菌感染，幾乎全部依賴于臨床標本的真菌學檢查，病原真菌的鑒定主要依靠其形態(tài)學。

方法：顯微鏡直接檢查（鏡檢）、真菌培養(yǎng)及鑒定、組織學檢查。其他特殊方法，有血清免疫學及分子生物學基因檢測法等。

歸納小結第40頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

真菌藥敏試驗及真菌藥

抗真菌藥敏近年來，深部真菌感染的發(fā)病率明顯增高，新研制的抗真菌藥物也不斷涌現，而耐藥菌株在臨床上也不斷發(fā)生。因此，開展抗真菌藥物敏感實驗，選擇敏感的抗真菌藥物是實驗室中一個重要的工作環(huán)節(jié)?？拐婢幬锩舾袑嶒炛饕菧y定抗真菌藥物對致病真菌的抑菌或殺菌作用。在最低藥物濃度下可抑制全部病原真菌者稱為最低抑菌濃度（MIC），有時還判定MIC50（50﹪真菌的MIC）及MIC90（90﹪真菌的MIC）。在最低濃度下可殺死全部真菌者為最低殺菌濃度（ＭFＣ）。第41頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

真菌藥敏試驗及真菌藥

抗真菌藥敏液基稀釋法：液基稀釋法是美國國家臨床試驗標準委員會（NCCLS）分別于1997年和2003年推出了致病酵母菌抗真菌藥物敏感試驗方案M27-A和產孢絲狀真菌抗真菌藥物敏感試驗方案M38-A。這兩個方案對于致病性真菌的培養(yǎng)基pH值，培養(yǎng)基的成分，接種濃度，孵育溫度，時間，終點判斷等因素作了明確的規(guī)定，使得不同實驗室之間的結果客觀，具有可比性，因此被稱為標準試驗方案。第42頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

抗真菌藥敏

1.酵母樣真菌藥物敏感試驗：

(1)微量液體稀釋法：

美國國家臨床試驗標準委員會推薦方法（ＮＣＣＬＳ）用96孔微孔板(U型)，每板第一排各孔(12孔)內分別加入培養(yǎng)基180ul，第11孔為陰性對照，第12孔為陽性對照；加入系列稀釋濃度的待測藥液10ul依次加入相應藥液于各孔內，陰性對照中加入20ul；加入菌懸液10ul，（陰性對照孔不加）；置于振蕩板上振蕩5分鐘，使各液混勻，放入濕合內，于35℃24h。觀察結果。本方法也可加入指示劑于培養(yǎng)基內，菌生長后由蘭色轉為紫紅色，以無色澤變化為ＭＩＣ。

第43頁,共56頁，2024年2月25日，星期天(2)瓊脂擴散法：

將待測的真菌摻入瓊脂基內，將藥敏片置于培養(yǎng)基表面，孵育48h后，根據紙片周圍真菌生長被抑制的范圍來確定該抗菌劑對此真菌的抑制作用。如同時應用系列濃度藥敏片可測出ＭＩＣ。(3)紙片擴散法：（試劑盒）

似細菌藥敏的方法。將菌株劃線接種于培養(yǎng)基表面，放入不同的藥物紙片，培養(yǎng)48h，觀察抑菌環(huán)的大小。同時用不同濃度的紙片，可觀察ＭＩＣ。此種方法簡單易行，不需要復雜設備，可作為抗真菌藥物的初篩方法。

抗真菌藥敏第44頁,共56頁，2024年2月25日，星期天(4)鑒定藥敏法：（改良法）

采用科瑪嘉念珠菌培養(yǎng)基，將臨床標本用生理鹽水稀釋，用棉拭子將標本稀釋液劃線于培養(yǎng)基表面，再放入藥敏片，48h后，產生不同顏色的菌株，同時出現抑菌環(huán)，根據抑菌環(huán)的大小，確定藥物敏感程度，也可進行ＭＩＣ的測定。

抗真菌藥敏第45頁,共56頁，2024年2月25日，星期天2.霉菌（絲狀真菌）藥敏試驗：

(1)試管藥基法：

將藥物倍比稀釋的方法加入培養(yǎng)基內，然后接種菌種，觀察ＭＩＣ。

(2)紙片法：

將培養(yǎng)出的絲狀菌（曲霉菌）制成菌懸液，劃線接種于培養(yǎng)基表面，放入藥敏片，觀察藥物敏感情況。

抗真菌藥敏第46頁,共56頁，2024年2月25日，星期天藥敏(微量法)第47頁,共56頁，2024年2月25日，星期天藥敏(瓊脂擴散法)第48頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

抗真菌藥物（1）氟康唑：

是三唑類抗真菌藥物，有口服劑，靜脈注射劑。目前治療系統(tǒng)性真菌感染應用最廣的一種藥物，其優(yōu)勢有靜脈注射劑?？咕饔脤湍妇ㄐ滦碗[球菌）、酵母樣菌（念珠菌屬）有抗菌作用，對霉菌組、雙相菌組作用較低。對克柔氏念珠菌、光滑念珠菌無明顯的抗菌作用，雖然對白念珠菌有很好的抗菌作用，但近年來對白念珠菌產生耐藥的菌株也逐漸增多。第49頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

抗真菌藥物（2）伊曲康唑（斯皮仁諾）

是一種具有廣譜活性的三唑類抗真菌藥物，有口服劑，靜脈注射劑。對酵母菌（新型隱球菌）、酵母樣菌（念珠菌屬）、霉菌（曲霉屬）、雙相菌（組織胞漿菌），有廣譜的抗菌作用，廣泛用于治療系統(tǒng)性念珠菌和系統(tǒng)性曲霉菌的感染。

第50頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

抗真菌藥物（3）伏力康唑是新型的廣譜三唑抗真菌藥，對念珠菌的活性比氟康唑高8-13倍，并且對氟康唑耐藥的菌株克柔氏念珠菌和光滑念珠菌有效。在與伏力康唑，氟康唑，伊曲康唑和兩性霉素B對比研究中發(fā)現，伏力康唑具有更廣的抗菌譜，它對新型隱球菌的抗菌活性優(yōu)于氟康唑和伊曲康唑，并且對臨床上的難以治療的煙曲霉感染的患者具有較好的療效。第51頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

抗真菌藥物（4）特比奈芬：

丙稀胺類抗真菌藥物，僅有口服劑，為新型的殺真菌藥物，對霉菌組作用強，療效好，但對念珠菌屬抗菌作用較低。（5）棘白菌素類抗真菌藥

卡泊芬凈（商品名：科賽斯）為殺菌劑，與兩性霉素B相似，對各種曲霉（煙曲霉，黃曲