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NYT1103中華人民共和國農業(yè)行業(yè)標準NY/T1103.3—2006轉基因植物及其產品食用安全檢測抗營養(yǎng)素第3部分：硫代葡萄糖苷的測定SafetyassessmentofgeneticallymodifiedplantandderivedproductsPart3:assayofanti-nutrientsglycosinolate2006-07-10公布2006-10-01實施中華人民共和國農業(yè)部公布

NY/T1103.3—2006前言本標準附錄A為資料性附錄，附錄B為規(guī)范性附錄。本標準由中華人民共和國農業(yè)部提出。本標準由全國農業(yè)轉基因生物安全治理標準化技術委員會歸口。本標準起草單位：中國農業(yè)科學院油料作物研究所、中國疾病預防操縱中心營養(yǎng)與食品安全所、農業(yè)部科技進展中心、中國農業(yè)大學、天津市衛(wèi)生防病中心。本標準首次公布。

NY/T1103.3—2006轉基因植物及其產品食用安全檢測抗營養(yǎng)素第3部分：硫代葡萄糖苷的測定范疇本標準規(guī)定了轉基因油菜籽及其產品中硫代葡萄糖苷的高效液相色譜測定方法。本標準適用于轉基因油菜籽及其產品中硫代葡萄糖苷的高效液相色譜測定。規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，隨后所有的修改單（不包括勘誤的內容）或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓舞按照本標準達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。GB5491糧食、油料檢驗扦樣、分樣法GB/T14488.1油料種籽含油量測定法GB/T14489.1油料水分及揮發(fā)物含量測定法術語和定義下列術語和定義適用于本標準。3.1轉基因油菜籽geneticallymodifiedrapeseed指利用基因工程技術改變基因組構成，用于農業(yè)生產或者農產品加工的油菜籽。3.2轉基因油菜籽產品productsderivedfromgeneticallymodifiedrapeseed指轉基因油菜籽的直截了當加工產品和含有轉基因油菜籽的產品。3.3相對校正系數responsefactors待測硫代葡萄糖苷的摩爾吸光系數與內標的摩爾吸光系數的相對比值。原理NY/T1103.3—2006用70%甲醇水溶液提取硫代葡萄糖苷，然后在陰離子交換樹脂上純化，并酶解脫去硫酸根，反相色譜柱分離，紫外檢測器檢測硫代葡萄糖苷。試驗材料轉基因油菜籽及其產品、受體油菜籽及其產品。如果對轉基因油菜籽產品中的硫代葡萄糖苷進行測定，轉基因油菜籽產品和受體油菜籽產品的處理條件應相同。上述材料的水分含量和種植環(huán)境應差不多一致。試劑除非另有講明，僅使用分析純試劑；水為蒸餾水。6.1硫酸酯酶溶液：HelixpomatiaH1型（EC3.1.6.1），每毫升硫酸酯酶溶液的活性單位不低于0.5，硫酸酯酶溶液應即配即用。6.2葡聚糖凝膠懸浮液：稱取10gDEAESephadexA25葡聚糖凝膠，浸泡在過量的2mol/L醋酸溶液中，靜置沉淀，再加入2mol/L醋酸溶液，直到液體體積是沉淀體積的2倍，于4℃冰箱中存放，待用。6.370%甲醇溶液：取70mL甲醇，加水定容至100mL。6.40.02mol/L醋酸鈉溶液：稱取0.272g醋酸鈉（CH3COONa·3H2O），加入800mL水溶解，用醋酸調劑溶液的pH值至4.0，加水定容至1L。6.56mol/L甲酸咪唑溶液：稱取204g咪唑，溶解于113mL甲酸中，待溶液冷卻后加水定容至500mL。6.6內標：用丙烯基硫代葡萄糖苷（Mr=415.49）作內標，當樣品中含有丙烯基硫代葡萄糖苷時，用苯甲基硫代葡萄糖苷（Mr=447.52）作內標。對硫代葡萄糖苷含量低于20.0mol/g的樣品，可將下述6.6.1至6.6.4中的內標溶液濃度降為1mmol/L至3mmol/L。內標溶液在4℃的冰箱中可存放三周，在-18℃條件下可儲存更長時刻，內標溶液的純度檢定見附錄A。6.6.15mmol/L丙烯基硫代葡萄糖苷溶液：稱取207.7mg丙烯基硫代葡萄糖苷溶解于80mL水中，加水定容至100mL。6.6.220mmol/L丙烯基硫代葡萄糖苷溶液：稱取831.0mg丙烯基硫代葡萄糖苷溶解于80mL水中，加水定容至100mL。6.6.35mmol/L苯甲基硫代葡萄糖苷溶液：稱取223.7mg苯甲基硫代葡萄糖苷溶解于80mL水中，加水定容至100mL。6.6.420mmol/L苯甲基硫代葡萄糖苷溶液：稱取895.0mg苯甲基硫代葡萄糖苷溶解于80mL水中，加水定容至100mL。NY/T1103.3—20066.7流淌相A：超聲波脫氣30s的水。6.8流淌相B：取200mL色譜級乙腈，加入800mL水，渾勻，超聲波脫氣30s。儀器和設備7.1通常實驗室儀器設備。7.2研缽或微型研磨機。7.3聚丙烯離子交換微柱：底部篩板為100目。7.50.45μm水溶性微孔濾膜。7.6色譜柱：填料顆粒小于或等于10m的反相C18或C8柱，例如：NovapakC18柱，5m（150mm×3.9mm）；LichrosorbRp18柱，5m（150mm×4.6mm）；SpherisorbC18柱，10m（150mm×4mm）；LichrospherRp8柱，5m（125mm×4mm）。7.7高效液相色譜儀：具備梯度洗脫，柱溫可操縱在30℃，帶紫外檢測器。試樣的制備按照GB5491的規(guī)定對試驗材料進行縮分，將縮分后的試驗材料分成三等份。第一份按GB/T14489.1的規(guī)定測定水分及揮發(fā)物含量，第二份按GB/T14488.1的規(guī)定測定含油量，第三份為硫代葡萄糖苷待測試樣。如果試驗材料的水分及揮發(fā)物含量超過10%，應在45℃條件下通風干燥，并將干燥后的待測試樣在微型粉碎機中粉碎，過40目篩，然后趕忙連續(xù)完成9.1和9.2。操作步驟9.1稱樣分不稱取200.0mg待測試樣至A、B兩支離心管中。9.2硫代葡萄糖苷的提取9.2.1將離心管75℃水浴1min，加入2mL70％沸甲醇溶液后，趕忙加入200L5mmol/L內標溶液至A管中，200L20mmol/L內標溶液至B管中。9.2.275℃水浴10min，其間每隔2min取出離心管在旋渦混合器上旋渦混合，然后取出離心管冷卻至室溫，5000g離心3min，分不轉移上清液至10mL刻度試管A＇、B＇中。9.2.3分不向A、B管中再加入2mL70％沸甲醇溶液，75℃水浴約30s，旋渦混勻后，75℃水浴10min，其間每隔2min取出離心管旋渦混合，然后取出離心管冷卻至室溫，5000gNY/T1103.3—2006離心3min，分不轉移上清液至原刻度試管A＇、B＇中。9.2.4用水調劑A＇、B＇管中的提取液至5mL，混勻。此提取液在-18℃暗處可儲存2周。9.3離子交換微柱的制備每一個試樣提取液預備一支聚丙烯離子交換微柱，垂直置于試管架上。取0.5mL充分混勻的葡聚糖凝膠懸浮液至每一離子交換微柱中，注意不要使懸浮液粘附在柱壁。靜置待液體排干后，取2mL6mol/L甲酸咪唑溶液沖洗樹脂，排干后，再用1mL水沖洗樹脂兩次，每次均讓水排干。9.4純化、脫硫酸根9.4.1取1mL提取液慢慢加入已制備好的離子交換微柱中，注意不能攪動樹脂表面，待液體排干后，分不加入1mL0.02mol/L醋酸鈉溶液兩次，每次加入后均讓液體排干。9.4.2加入100L硫酸酯酶溶液至離子交換微柱，35℃條件下反應16h。9.4.3分不用1mL水沖洗離子交換微柱2次，洗脫液收集于試管中。9.4.4用水將洗脫液定容至5mL，充分混勻后，用0.45m的微孔濾膜過濾，待進樣。洗脫液在-18℃暗處可存放1周。9.5空白試驗用相同的樣品進行相同的前處理，但不加內標物質，以檢定樣品中內標物質是否存在。9.6色譜條件9.6.1儀器條件：流淌相流速為1.0mL/min，柱溫30℃，紫外檢測器檢測波長229nm。9.6.2洗脫梯度9.6.2.1對SpherisorbC18柱，10m（150mm×4mm）和NovapakC18柱，5m（150mm×3.9mm），洗脫梯度見表1。表1SpherisorbC18柱和NovapakC18柱洗脫梯度時刻流淌相A（％）流淌相B（％）0min158510min100012min100015min158520min15859.6.2.2對LichrosorbRP18柱，5m（150mm×4.6mm），洗脫梯度見表2。NY/T1103.3—2006表2LichrosorbRP18柱洗脫梯度時刻流淌相A（％）流淌相B（％）0min10001min100020min010025min100030min10009.6.2.3對LichrospherRP8柱，5m（125mm×4mm），洗脫梯度見表3。表3LichrospherRP8柱洗脫梯度時刻流淌相A（％）流淌相B（％）0min10002.5min100020min010025min010027min100032min10009.7色譜測定進樣量10L，記錄峰面積。10結果表示10.1單組分硫代葡萄糖苷含量的運算10.1.1以每克干基脫脂油菜籽中所含硫代葡萄糖苷的微摩爾數表示，按式（1）運算：D1=…………（1）式中：D1－干基脫脂油菜籽中硫代葡萄糖苷含量，單位為微摩爾每克（mol/g）；Ag—脫硫硫代葡萄糖苷峰面積；As—內標峰面積；Kg—脫硫硫代葡萄糖苷相對校正系數，見附錄B；NY/T1103.3—2006m—試樣質量，單位為克（g）；n—試樣中加入內標的量，單位為微摩爾（mol）；w—試樣中水分、揮發(fā)物和含油量之和，以質量百分數表示（％）。運算結果表示到小數點后兩位。10.1.2以每克脫脂油菜籽含標準水分及揮發(fā)物時所含硫代葡萄糖苷的微摩爾數表示，按式（2）運算：D2=…………（2）式中：Ag、As、n、m、Kg、w同式（1）；D2－脫脂油菜籽含標準水分及揮發(fā)物時硫代葡萄糖苷的含量，單位為微摩爾每克（mol/g）；Ws—標準水分及揮發(fā)物含量，以質量百分數表示，數值為8.5％或9％。運算結果表示到小數點后兩位。10.1.3以每克干基油菜籽中所含硫代葡萄糖苷的微摩爾數表示，按式（3）運算：D3=………（3）式中：Ag、As、n、m、Kg同式（1）；D3－干基油菜籽中硫代葡萄糖苷含量，單位為微摩爾每克（mol/g）；Wt—試樣中水分及揮發(fā)物含量，以質量百分數表示（％）。運算結果表示到小數點后兩位。10.1.4以每克油菜籽含標準水分及揮發(fā)物時所含硫代葡萄糖苷的微摩爾數表示，按式（4）運算：D4=…………（4）式中：Ag、As、n、m、Kg、wt、Ws同式（1）、（2）和（3）；D4—油菜籽含標準水分及揮發(fā)物時硫代葡萄糖苷的含量，單位為微摩爾每克（mol/g）。NY/T1103.3—2006運算結果表示到小數點后兩位。硫代葡萄糖苷含量的運算硫代葡萄糖苷含量等于單組分硫代葡萄糖苷（單組分峰面積應大于峰面積總和的1%）含量的總和，以每克樣品中所含硫代葡萄糖苷的微摩爾數表示。如果A、B兩管硫代葡萄糖苷含量的測定值滿足11中承諾差的要求，硫代葡萄糖苷的含量為兩測定值的算術平均值。運算結果表示到小數點后兩位。承諾差11.1同一試樣、同一方法、同一操作者、同一儀器、同一實驗室短期內兩次測定值承諾差：如果硫代葡萄糖苷含量低于20.00mol/g，承諾差不大于2.00mol/g；如果硫代葡萄糖苷含量在20.00mol/g－35.00mol/g范疇內，承諾差不大于4.00mol/g；如果硫代葡萄糖苷含量大于35.00mol/g，承諾差不大于6.00mol/g。11.2同一試樣、同一方法、不同操作者、不同儀器、不同實驗室兩次測定值承諾差：如果硫代葡萄糖苷含量低于20.00mol/g，承諾差不大于4.00mol/g；如果硫代葡萄糖苷含量在20.00mol/g－35.00mol/g范疇內，承諾差不大于8.00mol/g；如果硫代葡萄糖苷含量大于35.00mol/g，承諾差不大于12.00mol/g。

NY/T1103.3—2006附錄A（資料性附錄）內標純度的檢定A.1檢定方法內標純度的檢定方法要緊包括：——用本標準規(guī)定的方法進行高效液相色譜分析。——用高效液相色譜的離子對技術分析完整的內標（不脫硫酸根的內標）?！脷庀嗌V分析脫硫酸鹽和硅烷化的內標。——用芥子酶（EC3.2.3.2）水解內標，按照水解產物葡萄糖的濃度檢定內標的純度。A.2結果分析如果用色譜方法檢定內標純度，當色譜圖中主峰面積不小于總峰面積的98％時，表明內標純度符合本標準要求。如果用酶水解方法檢定內標純度，當水解產物葡萄糖的摩爾濃度不小于內標摩爾濃度的98％時，表明內標純度符合本標準要求。

NY/T1103.3—2006附錄B（規(guī)范性附錄）相對校正系數表B.1脫硫硫代葡萄糖苷的相對校正系數序號硫代葡萄糖苷名稱相對校正系數（Kg）中