重組蚊濃核病毒干擾載體的構(gòu)建及初步應(yīng)用的研究的開題報(bào)告

重組蚊濃核病毒干擾載體的構(gòu)建及初步應(yīng)用的研究的開題報(bào)告一、選題的背景及意義蚊媒介傳播的重要病毒包括登革熱病毒、黃熱病病毒和寨卡病毒等，這些病毒對(duì)人類的健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)造成了重大影響。針對(duì)這些病毒的防控策略中，基因治療作為一種新穎的方法備受關(guān)注。而采用基因干擾技術(shù)，在恰當(dāng)?shù)剡x擇靶點(diǎn)基因的前提下，能通過(guò)RNA干擾腺病毒載體抑制病毒復(fù)制等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，發(fā)揮良好的防治效果。本研究選取了重組蚊濃核病毒干擾載體，通過(guò)構(gòu)建靶向三個(gè)不同地區(qū)的登革熱病毒的siRNA序列，實(shí)現(xiàn)基因干擾的目的。該研究的意義在于開發(fā)出針對(duì)登革熱病毒的基因治療新手段，為疫病防控和基因治療技術(shù)的研究提供新的思路和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。二、研究的目的和內(nèi)容本研究的目的是構(gòu)建重組蚊濃核病毒干擾載體，介導(dǎo)登革熱病毒靶點(diǎn)基因表達(dá)的干擾效果，并進(jìn)行初步應(yīng)用的探索性研究。具體研究?jī)?nèi)容包括：1.構(gòu)建蚊濃核病毒干擾載體，并篩選出適合的siRNA序列；2.對(duì)干擾效果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，包括感染細(xì)胞后病毒復(fù)制率的檢測(cè)、基因表達(dá)及蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定等；3.將靶向登革熱病毒不同地區(qū)的siRNA序列整合到干擾載體中，進(jìn)行復(fù)合干擾效果比較；4.初步應(yīng)用該重組干擾載體進(jìn)行病毒防治實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行體外和動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)效果。三、研究的方法及步驟1.蚊濃核病毒干擾載體的構(gòu)建：挑選目標(biāo)siRNA靶點(diǎn)基因后，利用重組技術(shù)將siRNA序列插入載體中，將構(gòu)建出的重組載體進(jìn)行質(zhì)粒抽提和酶切鑒定。2.干擾效果的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：將構(gòu)建完成的蚊濃核病毒干擾載體轉(zhuǎn)染入靶細(xì)胞中進(jìn)行感染，并進(jìn)行RT-PCR、Westernblot等分析方法進(jìn)行干擾效果檢測(cè)。3.蚊濃核病毒復(fù)合干擾的實(shí)驗(yàn)：整合靶向不同地區(qū)的siRNA序列，將構(gòu)建好的重組蚊濃核病毒干擾載體用于不同地區(qū)的登革熱病毒感染模型中，進(jìn)行病毒復(fù)合干擾效果比較。4.初步應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)：將重組干擾載體進(jìn)行體外和動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)，對(duì)其效果進(jìn)行初步檢測(cè)。四、可行性分析本研究利用重組技術(shù)構(gòu)建蚊濃核病毒干擾載體，在適宜的細(xì)胞系中進(jìn)行干擾效果的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本研究基于RNA干擾技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)登革熱病毒的基因干擾，該技術(shù)已經(jīng)得到廣泛的認(rèn)可和實(shí)踐，且相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便，可靠性高。在蚊媒傳播病毒的防治方面，基因干擾技術(shù)能夠發(fā)揮優(yōu)越的效果，因此本研究的可行性較高。五、研究成果的預(yù)期目標(biāo)本研究的成果將主要包括：1.構(gòu)建穩(wěn)定、有效的蚊濃核病毒干擾載體，實(shí)現(xiàn)對(duì)登革熱病毒靶點(diǎn)基因的干擾；2.通過(guò)對(duì)干擾效果的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，確定干擾效果較好的siRNA序列；3.通過(guò)復(fù)合干擾效果的比較，為基因干擾技術(shù)的應(yīng)用提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)；4.在體外和動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中初步驗(yàn)證該重組干擾載體的防治效果，為以后相關(guān)研究提供參考。六、預(yù)計(jì)存在的問題及解決方案1.載體構(gòu)建過(guò)程中可能出現(xiàn)PCR擴(kuò)增或重組過(guò)程中連帶核苷酸的序列錯(cuò)誤，需要嚴(yán)密檢查、測(cè)序確認(rèn)。2.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要適當(dāng)調(diào)整干擾載體的轉(zhuǎn)染量、進(jìn)一步優(yōu)化靶向基因的siRNA序列和其作用方式。3.動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中需要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程進(jìn)行盡量減少傷害的設(shè)計(jì)和實(shí)施。四、論文的結(jié)構(gòu)安排本論文的結(jié)構(gòu)安排將包括：緒論、材料與方法、結(jié)果與分析、結(jié)論和參考文獻(xiàn)。其中緒論將主要講述研究背景和意義，材料與方法將詳細(xì)闡述研究的方法設(shè)計(jì)