木質素降解研究

本科畢業(yè)論文木質素降解的研究LIGINIDEGRADATIONOFRESEARCH學院〔部〕：化學工程學院專業(yè)班級：學生姓名：指導教師：2012年3月26日木質素降解的研究摘要評述了木質生物降解的最新研究進展，主要包括木質素的生物降解機制、降解木質素的微生物種類及其產生的相關酶類、微生物的代謝調控和分子生物學。此外，對木質素降解生物的實際應用和應用前景也進行了評論。關鍵詞：木質素；生物降解；秸桿；白腐真菌；環(huán)境保護LIGINIDEGRADATIONOFRESEARCHABSTRACTThequalityofthewoodthatthesolutionoftheborndownnewgrindinvestigateintotheexhibition,TheLordwillincludingwoodgrainlifequalitythatmachinesystem,dropdownsolutionofgrainofwoodsolutionmicroscopicthingskindofclassanditsproductionwasbornofenzymeinclose,microscopiccontentofthegenerationxthecontrolandpointsthesonborntolearnthings.Theoutside,towoodqualitygraindropsolutionwhichshallbebornofborderwithandshouldbebeforeusingthescenealsointothelineevaluationtheory.KEYWORDS：woodqualitativeelement;Borncontentdropsolution;Strawpole;White-rotfungusreally;Theenvironmentthecare目錄摘要-2-緒論-1-1．簡介-2-1.1根本概念-2-1.2單體與結構-3-1.3開展前景-3-2.木質素的降解簡略-4-2.1概況-4-2.2木質素的結構特點-4-3.木質素降解微生物的種類-5-3.1三種重要木質素降解酶-5-I．木質素過氧化物酶(LiP)-5-II．錳過氧化物酶(MnP)-7-III．漆酶-9-3.2三種木質素降解酶協(xié)同作用-10-4應用全景-10-4.1木質素降解酶的全景-10-4.2木質素降解酶的特性-12-4.3木質素的降解微生物的酶活性調控機理-13-4.4木質素的生物降解的應用-16-結論-17-參考文獻-18-謝辭2緒論木質素資源十分豐富，是植物光合作用制造的總量僅次于纖維素的有機化合物，估計全球的木質素年產量可達1500億t。然而，木質素資源并沒有得到有效的利用，大量的木質素作為造紙工業(yè)的副產物而排放，不僅是資源的一大浪費，而且嚴重污染環(huán)境。采用物理和化學處理法，可減少約50%的木質素排放，但治理本錢高，易造成二次污染。利用生物技術降解木質素，可以減少環(huán)境污染，變廢為寶，實現(xiàn)資源再利用。因此，認識木質素的結構特點和了解其生物降解的研究進展，對于木質素資源的合理化利用將具有一定的指導意義。1．簡介1.1根本概念木質素〔lignin〕是由四種醇單體〔對香豆醇、松柏醇、5-羥基松柏醇、芥子醇〕形成的一種復雜酚類聚合物。木質素是構成植物細胞壁的成分之一，具有使細胞相連的作用。在植物組織中具有增強細胞壁及黏合纖維的作用。其組成與性質比擬復雜，并具有極強的活性。不能被動物所消化，在土壤中能轉化成腐殖質。如果簡單定義木質素的話，可以認為木質素是對羥基肉桂醇類的酶脫氫聚合物。它含有一定量的甲氧基，并有某些特性反響。木質素是由聚合的芳香醇構成的一類物質，存在于木質組織中，主要作用是通過形成交織網(wǎng)來硬化細胞壁。木質素主要位于纖維素纖維之間，起抗壓作用。在木本植物中，木質素占25%，是世界上第二位最豐富的有機物(纖維素是第一位)。1.2單體與結構\o"查看圖片"木質素單體的分子結構木質素是由四種醇單體〔對香豆醇、松柏醇、5-羥基松柏醇、芥子醇〕形成的一種復雜酚類聚合物。木質素是構成植物細胞壁的成分之一，具有使細胞相連的作用。木質素是一種含許多負電集團的多環(huán)高分子有機物，對土壤中的高價金屬離子有較強的親和力。因單體不同，可將木質素分為3種類型：由紫丁香基丙烷結構單體聚合而成的紫丁香基木質素〔syringyllignin，S-木質素〕，由愈創(chuàng)木基丙烷結構單體聚合而成的愈創(chuàng)木基木質素〔guajacyllignin，G-木質素〕和由對-羥基苯基丙烷結構單體聚合而成的對-羥基苯基木質素〔hydroxy-phenyllignin，H-木質素〕；裸子植物主要為愈創(chuàng)木基木質素〔G〕，雙子葉植物主要含愈創(chuàng)木基-紫丁香基木質素〔G-S〕，單子葉植物那么為愈創(chuàng)木基-紫丁香基-對-羥基苯基木質素〔G-S-H〕。從植物學觀點出發(fā)，木質素就是包圍于管胞、導管及木纖維等纖維束細胞及厚壁細胞外的物質，并使這些細胞具有特定顯色反響〔加間苯三酚溶液一滴，待片刻，再加鹽酸一滴，即顯紅色〕的物質；從化學觀點來看，木質素是由高度取代的苯基丙烷單元隨機聚合而成的高分子，它與纖維素、半纖維素一起，形成植物骨架的主要成分，在數(shù)量上僅次于纖維素。木質素填充于纖維素構架中增強植物體的機械強度，利于輸導組織的水分運輸和抵抗不良外界環(huán)境的侵襲。木質素在木材等硬組織中含量較多，蔬菜中那么很少見含有。一般存在于豆類、麥麩、可可、巧克力、草莓及山莓的種子局部之中。其最重要的作用就是吸附膽汁的主要成分膽汁酸，并將其排除體外。1.3開展前景隨著人類對環(huán)境污染和資源危機等問題的認識不斷深入,天然高分子所具有的可再生、可降解等性質日益受到重視。廢棄物的資源化與可再生資源的利用,是當代經濟與社會開展的重大課題,也是對當代科學技術提出的新要求。在自然界中,木質素的儲量僅次于纖維素,而且每年都以500億噸的速度再生。制漿造紙工業(yè)每年要從植物中別離出大約1.4億噸纖維素,同時得到5000萬噸左右的木質素副產品,但迄今為止,超過95%的木質素仍以“黑液”直接排入江河或濃縮后燒掉,很少得到有效利用?；茉吹娜找婵萁摺⒛举|素的豐富儲量、木質素科學的飛速開展決定木質素的經濟效益的可持續(xù)開展性。木質素本錢較低，木質素及其衍生物具有多種功能性，可作為分散劑、吸附劑/解吸劑、石油回收助劑、瀝青乳化劑，木質素對人類可持續(xù)開展最為重大奉獻就在于提供穩(wěn)定、持續(xù)的有機物質來源，其應用前景十分廣闊。研究木質素性能和結構的關系，利用木質素制造可降解、可再生的聚合物。木質素的物化性能和加工性能、工藝成為目前木質素研究的障礙。2.木質素的降解簡略2.1概況2.2木質素的結構特點木質素是由苯丙烷單元通過醚鍵和碳碳鍵聯(lián)接的復雜的無定形高聚物，，難以被酸水解，是天然高聚物中最難搞清楚的一個領域’其原因有兩個方面，一是木質素的結構單元之間除醚鍵聯(lián)接外還有C—C鍵；另一方面是不可能把整個木質素分子以其完整狀態(tài)別離出來。典型木質素是由松柏醇〔Coniferyalcohol〕，芥子醇〔Sinapylalcohol〕和對—香豆醇〔p-Coumarylalcohol〕〕這3種不同的醇作為先體結構物質組成根本的結構單元，這些木質素結構單元常常以它們的糖苷形式貯存在細胞中，一旦需要合成木質素，它們便從這些糖苷中釋放出來’這些木質素結構單元之間主要是通過醚鍵和碳碳鍵的方式聯(lián)接%醚鍵包括酚醚鍵、烷醚鍵和二芳醚鍵。在酚醚鍵中愈創(chuàng)木基-甘油-β-芳基醚鍵〔β-0-4〕數(shù)量最多，占酚醚鍵的1/2左右，其次是愈創(chuàng)木基-甘油-α-芳基醚鍵〔β-0-4〕。而木質素的C-C鍵的連接類型主要有β-5，β-β，β-1，β-2和5-5.3.木質素降解微生物的種類3.1三種重要木質素降解酶木質素是造紙工業(yè)排放黑液COD和色度形成的主要原因,其結構是由甲氧基取代的對-羥基肉桂酸聚合而成的異質多晶三維多聚體,分子間多為穩(wěn)定的醚鍵、C-C鍵,是目前公認的微生物難降解芳香化合物之一。自1934年Boruff和Buswell首次發(fā)現(xiàn)能降解木質素的微生物種群,人們對木質素的生物降解進行了大量研究,1983年和1984年發(fā)現(xiàn)了木質素過氧化物酶(LiP)和錳過氧化物酶(MnP),由日本吉田首次在生漆中發(fā)現(xiàn)的漆酶(Laccase),也始終引起著人們的關注。這三種酶被公認為是木質素重要的降解酶。=1\*ROMANI.木質素過氧化物酶(LiP)=1.1\*ROMANI.=1.1\*ROMANI分布及種類LiP是第一個從黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)發(fā)現(xiàn)的木質素降解酶,在木質素降解中起關鍵性作用。LiP的產生菌在自然界分布相當廣泛,許多腐朽木材的白腐菌、褐腐菌都可以產生LiP,主要產生菌見表1=1.1\*ROMANI.=2\*ROMANII結構及特點LiP代表一系列含F(xiàn)e3+、卟啉環(huán)(IX)和血紅素附基的同工酶,由不同微生物產生的酶的種類和理化性質各不相同。LiP是一種帶有糖基的胞外血紅蛋白,晶體結構已有報道,確定血紅素(heme)埋在蛋白質內,可連接至少一個VA。木質素大分子不能接近該酶的活性中心,其結合位點是一段有序的糖殘基,位于接近活性中心通道外表的裂縫中。光譜學研究說明LiP有五種氧化狀態(tài),自然狀態(tài)LiP含有高自旋Fe3+,被H2O2氧化兩個電子后形成LiP=1\*ROMANI(氧帶鐵卟啉環(huán)自由基含+Fe4+),LiP=1\*ROMANI經單電子復原形成LiP=2\*ROMANII(氧帶鐵卟啉環(huán)含F(xiàn)e4+),再經一次單電子復原,回到自然狀態(tài),His82在活性中心通道外表的裂縫的開口處,Trp170在酶蛋白外表,其電子傳遞可能有兩個不同的途徑:底物-His82-Ala83-Asn84-His47-Heme或底物-Trp170-Leu171-Heme。LiP的特點是能氧化富含電子的酚型或非酚型芳香化合物,在通過電子傳遞體攻擊木質素時,它能從苯酚或非酚類的苯環(huán)上奪取一個電子,將其氧化成自由基,繼而以鏈式反響產生許多不同的自由基,導致木質素分子中主要鍵斷裂。此過程需要H2O2的驅動,反響如下:LiP+H2O2→LiP=1\*ROMANI+H2OLiP=1\*ROMANI+SH2→SH+LiP=2\*ROMANIILiP=2\*ROMANII+SH2→SH+LiP2SH·+2木質素→2木質素自由基+2SH2其中,SH2為專一電子傳遞體。H2O2可由白腐菌胞內H2O2產生酶系產生,且其胞內還存在過氧化物水解酶,保證其不會受到毒害。=1.1\*ROMANI.=3\*ROMANIII作用機制木質素分子間主要鍵型是β-O-4,β-O-4模式復合物中有A,B兩個苯環(huán),均可被LiP氧化。LiP催化β-O-4模型物的主要反響是Cα-Cβ斷裂形成VA和2-甲氧基苯酚。另一個重要的分支反響是Cα-氧化產物的形成,結果說明:Cα-氧化產物是酚型Cα-氧合芳香化合物時,可由漆酶催化,酚氧化酶介導的氧化反響降解;當Cα-氧化產物是非酚型Cα-氧合芳香化合物時,由于其非各種氧化酶的底物,氧化降解非常困難。VA是LiP的誘導劑,還可以保護LiP不受H2O2的損害。對VA的氧化目前認為主要是由LiP催化,過氧化氫離子和H2O同時參與芳香環(huán)的開裂。開環(huán)產物可被進一步代謝CO2。整個反響中生成的甲氧基酚衍生物,由LiP和漆酶共同氧化,形成醌,在纖維二糖/醌復原酶系、芳香環(huán)開裂酶系的協(xié)同作用下,生成酚,最后形成環(huán)開裂產物,進入Kerb循環(huán),或者纖維二糖酸內脂的形式進入磷酸戊糖途徑,最終代謝為CO2。而非酚型的芳香醛酸,由于其氧化復原電位太高,需先被芳香醛酸復原酶復原成相應的醇,然后才能被LiP氧化成開環(huán)產物或醌。在木質素的模式復合物中,已被深入研究的還有β-1型,LiP氧化其它鍵型如β-5、β-O-4模式復合物,產物尚未被證實。=1.1\*ROMANI.=4\*ROMANIV基因結構及表達在分子生物學領域,研究較多的是P.chrysosporium、Trametesversicolor、Bjerkanderaadusta等。在P.chrysosporium中已經克隆出至少7個相近的LiP基因家族,定名為LiPA-LiPJ,同源性很高。核型分析說明,異源真核菌株約含10個染色體,而LiP基因至少被分布在兩個染色體上。LiP序列排列緊密且高度保守,氨基酸相似性53%~98%,每個LiP基因編碼一個由343~345個氨基酸組成的成熟蛋白質,分子量約36360~36607Da。N端有一個21個氨基酸的信號肽,且有6或7個氨基酸的前體肽。已測序的LiP基因均含有8或9個內含子,大小49~78bp,5'端非編碼區(qū)包含一個TATA框(-66~-81bp)和一個CAAT框(-107~-228bp)的調節(jié)序列。在基因表達方面,其轉錄明顯受到C,N水平的影響,LiP的同工酶種類和數(shù)目隨培養(yǎng)條件變化而改變,至少有五種:H1、H2、H6、H8、H10。其分子量大小、等電點、光譜特性、穩(wěn)定性均有差異,N端氨基酸序列也不相同。非限制性N源條件下,H8是主要的同工酶,其cDNA序列被命名為ML-1,H2的表達也稍占優(yōu)勢,但H6的表達較限制性N源條件下大大下降。在異源表達上,已得到許多重組LiP,但重組LiP的功能有所改變,如催化能力改變,不再受Mn2+抑制等。=2\*ROMANII錳過氧化物酶(MnP)=2\*ROMANII.=1\*ROMANI分布及種類MnP與LiP一樣,都是代表一系列帶有糖基的胞外過氧化物酶,因二者都含有血紅素,又稱血紅素過氧化物酶。MnP的主要產生菌見表2,主要是一些白腐真菌,多屬擔子菌亞門,無隔擔子菌亞綱,無褶菌目的多孔菌科。=2\*ROMANII.=2\*ROMANII結構及特點MnP的晶體結構中包括17%的中性糖類和大量酸性氨基酸,血紅素上僅有一個Mn2+的結合位點,MnP能將其氧化,消耗一分子的H2O2,產生兩分子的Mn3+。Mn3+從MnP上脫離后,如果沒有適宜的螯合物與其結合,保證其穩(wěn)定性,其可以在溶液中發(fā)生反響,生成MnO2。在木質素降解過程中,MnO2可保護LiP免受H2O2的損傷。而在LiP-MnP組合酶體系中,高濃度的Mn2+或Mn3+,加上適宜的螯合物,會導致LiP的抑制,MnP的誘導?？梢?Mn對LiP和MnP都具有重要的作用,且作用大小與猛離子的濃度及添加時間有關。MnP的特點是只能氧化酚型木質素。氧化苯酚的過程中,MnP和H2O2的啟動下,氧化Mn2+為Mn3+,然后,Mn3+氧化苯酚生成苯氧殘基。這與LiP氧化苯酚的方式有明顯不同。=2\*ROMANII.=3\*ROMANIII作用機制MnP降解木質素的作用機制尚不清晰,目前認為是一個循環(huán)催化過程見圖1,AH代表酚型底物。隨著研究的逐漸深入,它在木質素降解過程中的作用越來越受到重視。=2\*ROMANII.=4\*ROMANIV基因結構及表達從P.chrysosporium的胞外液中別離出至少六種MnP的同工酶,均由多基因編碼。通過全部RNA的反轉錄PCR,能得到MnP的三個不同基因的mRNA:MnP1、MnP2、MnP3。靜置培養(yǎng)條件下,MnP2是主要的MnP表達基因,而攪拌培養(yǎng)時,MnP1是主要的表達基因,MnP3的表達較穩(wěn)定。MnP基因有6或7個內含子,N端有21或24個氨基酸的信號肽,但無前體肽。活性位點附近的序列非常保守,MnP的5非編碼區(qū)包括1個TATAA單元(-81bp)及3個反向的CCAAT單元。啟動區(qū)包括大量熱休克元件和序列,這些元件與哺乳動物金屬硫蛋白基因中的金屬調節(jié)元件相同[4~5]。在基因表達方面,MnP的產生明顯依賴Mn2+濃度、培養(yǎng)基、熱休克、C和N源變化,且調節(jié)是在轉錄水平上。菌株P.chrysosporiumOGC101MnP1編碼一個357個氨基酸的成熟蛋白,內含子6個,大小57~72bp。=3\*ROMANIII漆酶=3\*ROMANIII.=1\*ROMANI分布及種類1883年漆酶被首次發(fā)現(xiàn),一百多年來,人們通過大量研究發(fā)現(xiàn)漆酶廣泛存在于多種植物和菌類的分泌物中。在真菌中,漆酶大多分布在擔子菌(Basidimycetes)、多孔菌(Polyporus)、柄孢殼菌(Podospora)等中。此外,一些動物腎臟和血清中也發(fā)現(xiàn)了漆酶,近來,人們發(fā)現(xiàn)一些細菌也能產生漆酶[6],如生脂固氮螺菌(Azospirillumlipoferum)。漆酶的主要高產白腐真菌王佳玲等曾作過統(tǒng)計。=3\*ROMANIII.=2\*ROMANII結構與特點漆酶的分子量在64~390kD之間,除Podosporaanserina產生的一種漆酶是四聚體外,其它漆酶一般是單一多肽,由約500個氨基酸組成。不同種類的漆酶含銅數(shù)并不相同。一般含有四個銅離子,根據(jù)光譜和磁性特征可分為三類:=1\*ROMANI型Cu2+一個,單電子受體,順磁性,藍色,λ614nm處有特征吸收蜂;=2\*ROMANII型Cu2+一個,單電子受體,順磁性,非藍色,無特征,吸收光譜;=3\*ROMANIII型Cu24+兩個,雙電子受體,反磁性,是偶合的離子對(Cu2+-Cu2+),λ330nm處有寬的吸收帶。漆酶的三維結構尚不清晰,但證實銅離子位于酶的活性部位,在催化氧化過程中起決定性作用。漆酶是單電子氧化復原酶,據(jù)統(tǒng)計它催化氧化的底物達250多個,最重要的是酚及其衍生物,約占其底物總數(shù)的一半。此外漆酶還能催化芳胺、羧酸及其衍生物,甾體激素和其它非酚類底物,如抗壞血酸等。=3\*ROMANIII.=3\*ROMANIII作用機制漆酶是一類以O2為電子受體的蛋白酶,對其作用機理,目前研究較透徹的是其催化多酚化物如氫醌,此過程須經過四次單電子傳遞。首先,底物氫醌向漆酶轉移一個電子,生成半醌-氧自由基中間體。而后,兩分子半醌生成一分子氫醌和一分子苯醌,氧自由基中間體還能轉變成碳自由基中間體,它們可以相互結合或相互偶連,故在菌體內,漆酶與其它氧化木質素酶系協(xié)同降解木質素。而在體外實驗中,木質素單體在Laccase/O2條件下會發(fā)生聚合反響。O2存在條件下,復原態(tài)漆酶被氧化,O2被復原成水,此過程是通過四個銅離子協(xié)同傳遞電子和價態(tài)變化來實現(xiàn)的:Cu2+Cu2+Cu24+→2e底物→Cu+Cu+Cu24+→分子內電子轉移→Cu2+Cu2+Cu22+→2e底物→Cu+Cu+Cu2+→2H+O2H2O快→Cu2+Cu2+(Cu2O)3+→2H+H2O慢→Cu2+Cu2+Cu24+=3\*ROMANIII.=4\*ROMANIV基因結構及表達漆酶是由一個結構相近的基因家族編碼,許多真菌的漆酶基因已被克隆和測序,如Agaricusbisporus、Neurosporacrassa。從Coprinuscinerens中克隆出3個漆酶基因Lcc1、Lcc2和Lcc3。其中Lcc1含7個內含子,大小為54~70bp,成熟蛋白約521個氨基酸,有三個潛在的N-連接糖基化位點,C端有23個氨基酸的延伸序列,富含Arg和Lys,其酶蛋白成熟至少需剔除信號肽、前體肽和C端延伸區(qū)。Lcc2和Lcc3均有13個內含子,表達出的成熟蛋白氨基酸同源性80%。Lcc3和Lcc1的氨基酸同源性58%,Lcc2和Lcc1的氨基酸同源性59%,而Lcc3與Aspergillusnidulan漆酶的氨基酸同源性只有18%。因此,異源真菌漆酶之間的氨基酸同源性較低,但在銅結合區(qū)具有較高保守性。在異源表達上,曲霉是一個很好選擇,A.oryazeTATAamylase和Pichiapasti系統(tǒng)已成功表達假設干不同來源的漆酶,Lcc1在米曲霉中表達成功,90%以上的轉化體表現(xiàn)出漆酶活性,目前,已有許多漆酶基因在酵母菌等真核生物中表達。3.2三種木質素降解酶協(xié)同作用對上述三種酶的研究主要集中在液體培養(yǎng)方式上,結果顯示采用靜置培養(yǎng),深層培養(yǎng)利于酶的產生。已證明,木質素降解酶活性受C源、N源、微量元素、誘導物、培養(yǎng)溫度和pH值等因素影響。而P.cinnabarinus的漆酶產量卻不受一些小分子芳香化合物的誘導。確定單一一種酶在木質素降解中的功能非常困難,因為每一種白腐菌所產生的都不是一種木質素降解酶,如Laccase和MnP單獨存在都不能很好的降解木質素,而兩種酶同時存在時,木質素卻能得到很好降解,說明兩種酶具有協(xié)同作用。有趣的是當體系中一些條件變化時,體系中的兩種或幾種木質素降解酶會發(fā)生相互抑制現(xiàn)象,如液體培養(yǎng)條件下,Mn2+濃度增加會導致LiP活力大大降低,而MnP和Laccase的活力卻相應增加,這啟示我們這種協(xié)同作用可能存在正負兩種機制。不同白腐菌木質素降解酶系的組成大不相同,可分為四類:LiP-MnP,如P.chrysosporium;LiP_MnP_Laccase,如Trametesgibbosa;MnP_Laccase,如Lentinulaedodes;LiP_Laccase,如Pleurotusostreatus。最新研究說明,不同降解酶系成分之間的比例將直接影響木質素降解效果。各種酶系具體如何分工協(xié)作降解木質素,尚不清楚,將是今后研究的一個熱點。4應用全景4.1木質素降解酶的全景在自然界中，能降解木質素并產生相應酶類的生物只占少數(shù)。木質素的完全降解是真菌、細菌及相應微生物群落共同作用的結果，其中真菌起著主要作用。降解木質素的真菌根據(jù)腐朽類型分為：白腐菌———使木材呈白色腐朽的真菌；褐腐菌———使木材呈褐色腐朽的真菌和軟腐菌。前兩者屬擔子菌綱，軟腐菌屬半知菌類。白腐菌降解木質素的能力尤于其降解纖維素的能力，這類菌首先使木材中的木質素發(fā)生降解而不產生色素。而后兩者降解木質素的能力弱于其降解纖維素的能力，它們首先開始纖維素的降解并分泌黃褐色的色素使木材黃褐變，而后才局部緩慢地降解木質素。白腐菌能夠分泌胞外氧化酶降解木質素，因此被認為是最主要的木質素降解微生物。目前，研究最多的白腐菌有：黃孢厚毛平革菌(Phanerochetechrysosporium)、彩絨草蓋菌〔Coridusversicolor〕、變色栓菌〔Thametesversicolor〕、射脈菌〔Phlebiaradiata〕、鳳尾菇〔Pleurotuspulmononanus〕、朱紅密孔菌〔Pycnoporuscinnabarinus〕等.這些菌多屬于擔子菌亞門，無隔擔子菌亞綱、無褶菌目的多孔菌科.王佳鈴等曾評述過1981～1995年間研究報道過的主要高產漆酶白腐真菌〔表1〕。褐腐菌的軟腐菌中的有些種類也可以分泌一些降解木質素的酶類，但它們分解木質素的能力不是很強，因此，研究報道較少.降解木質素的原核生物以放線菌為主，如鏈霉菌屬〔Streptomyces〕、節(jié)桿菌屬〔Arthrobaeter〕、小單孢菌屬〔Micromonoyticum〕和諾卡氏菌〔Nocardia〕等。細菌中有厭氧梭菌〔Clostridumxylanoyticum〕、假單孢菌〔Pseudomonas〕、不動桿菌〔Acinetobacter〕和芽孢桿菌〔Bacillus〕等原核生物對于在土壤中木質素的轉化和降解具有重要作用，但土壤中木質素的降解據(jù)報導是土壤微生物區(qū)系多種類型微生物協(xié)同進行的結果，而且進程緩慢，單一微生物純培養(yǎng)的商業(yè)用途前景不很清晰，且這類原核生物的多酚氧化酶是胞內酶，這也決定了其在木質素降解菌的研究中處于一個相對附屬的地位.此外，很多植物病原微生物如RhizoctoniasolaniR.praticola等也具有分解木質素的能力，但這類微生物在處理秸稈上的應用前景不大.在木質素降解微生物中，研究得最多最徹底和最具應用前景的是黃孢原毛平革菌。這種微生物的特點是培養(yǎng)溫度高〔37℃左右〕，無性繁殖迅速，菌絲生長快且分泌木質素降解酶能力強，它已經成為研究白腐真菌的一種模式微生物’它的培養(yǎng)條件、代謝調控、分子生物學和遺傳學及其在生產實踐上的應用等均已被研究的相當仔細。4.2木質素降解酶的特性目前，關于木質素降解酶的研究工作主要集中在白腐菌所產生的酶系。研究得較多，并認為最為重要的木質素降解酶有3種，即木質素過氧化物酶〔Ligninperoxidases/Lip〕、錳依賴過氧化物酶〔Manganeseperxidases/Mnp〕和漆酶〔Laccase〕.LiP,MnP和Laccase只是分別代表一系列的同功酶。但各種微生物所產生的酶的種類和一些理化特性是有所不同的。其中LiP是第一個從黃孢原毛平革菌發(fā)現(xiàn)的木質素降解酶，以后又分別從射脈菌，彩絨革蓋菌，變色栓菌中發(fā)現(xiàn).Laccase沒有在黃孢原毛平革菌中發(fā)現(xiàn)，而在Phlebia,Trametes,Coriolus等菌中發(fā)現(xiàn)。木質素的降解酶系是非常復雜的一個體系，很多問題至今還不十分清楚.除了上述3種重要的酶外，其它的一些酶如芳醇氧化酶〔AAO〕、酚氧化酶、葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶及一些復原酶、甲基化酶和蛋白酶等都參與或對木質素的降解產生一定的影響.LiP和Mnp都是帶有糖基的胞外血紅素蛋白.又稱血紅素過氧化物酶〔HemePeroxidase〕，它們在反響中從苯酚或非酚類的苯環(huán)上奪取一個電子而使后者形成一個陽離子基團，從而導致木質素分子中主要鍵的斷裂.LiP主要是氧化苯酚使之成為苯氧殘基.Mnp主要是從Mn2+和H2O2的氧化中得到Mn3+，然后Mn3+氧化苯酚使之成為苯氧殘基’而每種酶在木質素降解中的具體作用還不甚清楚.漆酶〔Laccase〕是含銅的多酚氧化酶，主要來源于生漆和真菌。由于Laccase的含糖量高，難得到X-衍射分析用的漆酶單晶，它的三維空間結構尚不清楚.但已經證實，漆酶中的銅離子在催化氧化反響中起決定作用.根據(jù)磁學和光譜性質可將漆酶中的4個銅離子分為3類：=1\*ROMANI型Cu2+和=2\*ROMANII型Cu2+各1個，是單電子受體，呈順磁性，可以用核磁共振控測；=3\*ROMANIII型Cu2+2個，是雙電子受體，反磁性，用核磁共振不能檢測.!=1\*ROMANI型Cu2+呈藍色，在λ614nm特征吸收峰；=2\*ROMANII型Cu2+為非藍色，沒用特征吸收峰；=3\*ROMANIII型Cu24+的離子對〔Cu2+…Cu2+〕，在30處有寬的吸收峰.在木質素降解過程的機制和作用至今人們還不完全清楚。作為一種多酚氧化酶，它可催化氧化酚類或芳胺類等多種底物的氧化作用。氧化酚或芳胺先失去一個電子生成自由基，后者發(fā)生一系列非酶反響，氧化成醌，在有O2存在時，復原態(tài)漆酶被氧化，O2復原成水’底物自由基不穩(wěn)定，可進一步發(fā)生鍵的斷裂或生成，導致裂解或聚合反響。因此，底物分子可進一步合生成復雜的產物，也可催化芳香環(huán)支鏈Cα-Cβ斷裂。GALIANO等發(fā)現(xiàn)，當Laccase和MnP分別單獨存在時，都不能有效地降解木質素，而2種酶同時存在時那么木質素得到有效的降解，這說明2種酶在催化木質素生物降解反響中具有協(xié)同作用.此外還發(fā)現(xiàn)在反響中參加其它的酶，如葡萄糖氧化酶時，可顯著提高木質素的降解程度.他們認為，這是由于Laccase既有解聚，又有聚合木質素的能力，參加葡萄糖氧化酶可原Laccase氧化多酚產生的醌等阻止木質素的聚合作用，從而提高Laccase的降解能力.確定每一種酶在木質素降解過程中的作用和功能是困難的，因為至少目前木質素被微生物所產生的單一胞外酶徹底、完全地催化解聚和降解的情況還沒被發(fā)現(xiàn).每一種白腐真菌所產生的都不只是一種能降解木質素的酶，在缺陷任一種酶的體系中木質素仍能夠較好的降解，而這些酶之間又相互作用和影響，使其存在于一個協(xié)同作用體系中.雖然現(xiàn)在已能用14C標識的合成木質素來研究木質素降解酶在木質素降解中的作用機理，但由于木質素的結構復雜，木質素的徹底降解需依賴微生物區(qū)系中多種微生物在較長時間內相互交替的生長繁殖才能完成.4.3木質素的降解微生物的酶活性調控機理在白腐菌產酶的培養(yǎng)方式上，研究最多的是液體培養(yǎng).國內外曾利用多種不同有機、無機或復合碳源和氮源來研究它們對微生物的木質素降解能力和產酶能力的影響.還研究了碳源或氮源限制對它們的影響.結果說明，碳源和氮源是微生物降解木質素和產酶的一個極為重要的影響因素.不同的單糖、雙糖作碳源的礦質培養(yǎng)基培養(yǎng)豹斑革菌時，用麥芽糖生物的生長量最高.標準培養(yǎng)條件下，以葡萄糖作對照，甘露糖和麥芽糖使MnP分別增2倍和3.8倍。酵母汁、牛肉膏等復合氮有利于LiP活性的提高，而甘氨酸、檸檬酸銨、乙醇胺等那么抑制LiP的生成和活性.毛平革菌等白腐菌的木質素降解和木質素降解酶的產生是發(fā)生在氮源或其它營養(yǎng)被消耗的次級代謝過程中.而細菌那么與之相反，高濃度的有機或無機氮源都不能抑制木質素降解，所產生的過氧化物酶也具有與生長相聯(lián)和不受高水平氮抑制的特點.我國學者李越中等曾對黃孢原平革菌合成木質素過氧化物酶的營養(yǎng)調控進行過較為詳細的研究報道〔表2、表3〕。微量元素對于白腐菌相關酶類的產生是有較大影響的。漆酶是一種含銅的多酚氧酶，因此，Cu對于漆酶的產生和酶活性是相當重要的Mn對LiP和MnP都具有重要的作用，對漆酶的影響也是顯著的.BINNARME等認為，Mn2+對LiP有抑制作用，而對MnP那么有誘導作用，其作用的大小與Mn2+的濃度及添加時間有關.C.subuermispora在Mn2+濃度為11×10-6mol·L-1時，木質素礦化速率最大，而MnP和Laccase的活性在4.0×10-6mol·L-1時最高.不添加Mn2+可使Agaricuscampestris的Laccase活性顯著降低，但Mn2+對其影響是以Cu2+的存在為前提，如果沒有Cu2+存在，那么Laccase的活性那么與Mn2+濃度無關且酶活性始終很低.有報道，高濃度的Mn2+會提高Phlebiabreispora的Laccase活性，但對Dichomitus來說，Laccas活性都不受Mn2+的影響.結構和木質素有關的低分子芳香化合物或木質素降解的碎片化合物，可誘導Laccase產生并提高其酶產量，這類化合物如香草酸、藜蘆醇、愈創(chuàng)木酚、吐溫、甲苯胺等.在豹斑革耳菌上還發(fā)現(xiàn)了專一的MnP誘導物3-甲基芐醇.培養(yǎng)溫度、通氣狀況，PH值乃至環(huán)境濕度等，也是影響木質素降解酶產生的因素.如黃孢原毛平革菌的最適生長溫度為37℃，最適產酶溫度為30℃豹斑革耳菌增加通氣可使木質素礦化率有所提高，而對于Phlebiaradiata來說，通氧那么抑制其酶活性.培養(yǎng)溫度和PH值對Laccas的影響因具體菌種而異，不同的菌種有不同的適宜培養(yǎng)溫度和PH值.4.4木質素的生物降解的應用木質素的生物降解目前成功地用于生產實踐的實際應用尚不多見，但在有些方面的研究已經顯現(xiàn)出誘人的前景.1)造紙工業(yè)分解木質素的酶類在造紙工業(yè)上的應用有兩個方面，一是用改造舊的造紙工藝，用于生物制漿、生物漂白和生物脫色-黃孢原毛平革菌和P.brevispora等在國外已經得到成功利用-如用P.brevispora進行生物制漿預處理可降低47%的能耗并增加了紙漿的張力，但它們的木質素降解率和產酶量都還是極為有限的，處理時間過長，距大規(guī)模推廣應用尚有一定的距離.二是木質素分解菌或酶類用于造紙廢水的處理，這方面的國內外研究報告已有很多且已取得了一定的實效.2)飼料工業(yè)木質素分解酶或分解菌處理飼料可提高動物對飼料的消化率-實際上，木素酶和分解菌的應用已經突破了秸稈僅用于反芻