T∕CACM 013-2016 金銀花快速 PCR 鑒定

ICS：11.120.99C10/29團體標(biāo)準(zhǔn)T/CACM0132016金銀花快速PCR鑒定QuicklyPCRidentificationofLoniceraeJaponicaeFlos2016-12-12發(fā)布2016-12-12實施中華中醫(yī)藥學(xué)會發(fā)布前言 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 5儀器設(shè)備 6試劑和溶液配制 7檢驗程序 8結(jié)果判定 9結(jié)果報告 本標(biāo)準(zhǔn)的全部技術(shù)內(nèi)容為推薦性。本標(biāo)準(zhǔn)是對《中華人民共和國藥典》標(biāo)準(zhǔn)的補充。本標(biāo)準(zhǔn)由中華中醫(yī)藥學(xué)會歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位:中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心、國藥種業(yè)有限公司。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人:袁媛、黃璐琦、蔣超、趙玉洋、周駿輝、何雅莉、王繼永。請注意本標(biāo)準(zhǔn)的某些內(nèi)容有可能涉及專利,本標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布機構(gòu)不應(yīng)承擔(dān)識別這些專利的責(zé)任。1金銀花快速PCR鑒定本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了使用快速PCR鑒定金銀花藥材和飲片、種子種苗的通用方法和要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于金銀花藥材和飲片、種子種苗鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件,其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內(nèi)容)或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)。凡是不注日期的引用文件,其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)?！吨腥A人民共和國藥典》GB/T6682《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》GB/T23632《進(jìn)境植物檢疫截獲有害生物鑒定復(fù)核規(guī)程》GB/T27403《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測》3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。按一定規(guī)則取自某一整體的一個或多個部分,并能反映該整體的相關(guān)信息,可以作為判斷該整體的基礎(chǔ)。從樣品中提取出DNA的方法。通過一定技術(shù)使一段特定的DNA片段拷貝數(shù)增加的過程,可通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增技術(shù)實現(xiàn)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)polymerasech模板DNA先經(jīng)高溫變性為單鏈,兩條引物分別與模板DNA兩條鏈上相應(yīng)的一段互補序列發(fā)生退火,在DNA聚合酶的作用下,以四種脫氧核糖核酸(dNTP)為底物,使退火引物得以延伸,然后不斷重復(fù)變性、退火和延伸這一循環(huán),使位于兩段已知序列之間的DNA片段拷貝數(shù)呈幾何倍數(shù)增長。其擴增產(chǎn)物可通過多種特異性和敏感性好的方法進(jìn)行檢測。一般使用對照樣品代替送檢樣品同法DNA提取、靶核酸擴增和產(chǎn)物檢測過程,用于證明鑒定過程可獲得目標(biāo)核酸片段的操作。使用常見偽品藥材代替送檢樣品同法DNA提取、靶核酸擴增和產(chǎn)物檢測過程。2以水代替送檢樣品同法DNA提取、靶核酸擴增和產(chǎn)物檢測過程,用以證明提取過程中沒有核酸污染。對照樣品包括對照藥材和種子種苗對照樣品。種子種苗對照樣品是由中藥材種子種苗標(biāo)準(zhǔn)起草單位提交,經(jīng)全國中藥材種子(種苗)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會認(rèn)定并保存,與品種名稱相符的種子種苗樣品。金銀花快速PCR鑒定應(yīng)采用抽取有代表性的送檢樣品與對照樣品比較的驗證方式,即依據(jù)金銀花特異性DNA位點差異,使用單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記法進(jìn)行鑒定。利用堿裂解法提取金銀花模板DNA,以提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴增,熒光檢測或瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。5儀器設(shè)備所有制備樣品使用的器具在使用前應(yīng)滅菌處理。使用前應(yīng)進(jìn)行溫度校準(zhǔn)。6試劑和溶液配制除另有規(guī)定外,實驗試劑為不含DNA和DNase的分析純或生化試劑;實驗用水符合GB/T6682的要求;所配制的試劑均應(yīng)滅菌后保存,并在容器上注明試劑名稱、濃度、配制時間、保存條件、失效日期和配制者姓名;PCR試劑應(yīng)小量分裝保存以減少污染;材料及試劑的保存都應(yīng)有防污染措施。溶解12郾1g三羥甲基氨基甲烷(Tri溶解12郾1g三羥甲基氨基甲烷(Tri1L,分裝后高壓滅菌。3保存。EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(在),T)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(80mL去),aqDNA)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(離),聚)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(子),合)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(水),酶)時置冰上操作。2EDTA·2H2O,加入醋酸,充分混勻,加去離子水定容至1L,室溫保存,使用時用去離子水50倍稀釋。在80mL去離子水中溶解溴酚藍(lán)250mg、二甲苯青250mg、蔗糖250mg,加水定容至100mL,分裝。7檢驗程序為防止交叉污染,收樣、取樣、粉碎、DNA提取、核酸擴增與產(chǎn)物檢測應(yīng)在不同操作間或在同一操作間不同隔離區(qū)域進(jìn)行,進(jìn)入各區(qū)域應(yīng)嚴(yán)格按照單一方向進(jìn)行,即樣品制備區(qū)寅核酸制備區(qū)寅擴增區(qū)寅檢測區(qū)。送檢樣品應(yīng)可分成2批,每批可分為同樣的3份,總量不低于100g。收樣時應(yīng)檢查包裝的完整性,并在樣品袋上貼上標(biāo)簽,填寫采集數(shù)據(jù)表。對商品包裝和送樣說明進(jìn)行拍照記錄,照片隨樣品一起備檔。送檢樣品抽樣方法參照2015年版《中華人民共和國藥典》四部藥材和飲片取樣法(通則0211)進(jìn)行取樣。去除藥材和飲片表面附著物,依次使用75%乙醇和無菌雙蒸水擦拭表面后晾干。送驗樣品、試樣的抽取、分取應(yīng)有代表性。在生產(chǎn)基地取樣,送驗樣品可以為組織或器官;在加工或銷售地點取樣,送驗樣品為種子或種苗。取送檢樣品置乳缽、勻漿機或球磨粉碎儀中充分研磨粉碎,必要時加適量液氮研磨。800滋L中和緩沖液,充分混勻;12000r/min離心1min800滋L中和緩沖液,充分混勻;12000r/min離心1min或靜置5min;轉(zhuǎn)移500滋L上清液至一新的作為DNA模板待測或-20益保存?zhèn)溆?。每個送檢樣品必須重復(fù)2次作為DNA模板待測或-20益保存?zhèn)溆?。每個送檢樣品必須重復(fù)2次,每1次從送檢樣品提取核酸的過程都必須設(shè)置1個提取空白對照。注:使用堿裂解法提取的金銀花DNA可在4益下保存3天或-20益下保存7天,不宜長期保存。首次使用本方法時,應(yīng)校對PCR儀溫控準(zhǔn)確性,并使用陽性對照和陰性對照以核對使用的Taq聚合酶的適用性。4PCR檢測應(yīng)重復(fù)2次,并設(shè)置陽性對照、陰性對照和空白對照。EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up10(滋L、),雙蒸)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up10(鑒),水)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up10(定引),19郾1)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up10(物),滋L)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up10(各),混)延伸10s,35個循環(huán)。對擴增產(chǎn)物進(jìn)行檢測或置4益下保存。長下檢測熒光,若PCR產(chǎn)物出現(xiàn)與陽性對照相同的熒光即為陽性結(jié)果,反之為陰性結(jié)果。取PCR擴增產(chǎn)物,加入6伊上樣緩沖液混勻,2%瓊脂糖凝膠電泳染色,紫外波長下檢測。陰性對照和空白對照無條帶,且送檢樣品與陽性對照在100~200bp有一條DNA條帶為陽性結(jié)果,否則為陰性結(jié)果。8結(jié)果判定在陰性對照、陽性對照和空白對照結(jié)果符合規(guī)定的情況下,若送檢樣品與陽性對照一致,則判定測試結(jié)果為陽性,否則為陰性。9結(jié)果報告樣品經(jīng)檢測后,實驗室應(yīng)根據(jù)實驗的具體操作程序和結(jié)果做好詳細(xì)的實驗記錄,出具檢測報告。檢測報告至少包含以下內(nèi)容:送檢樣品的名稱、狀態(tài)和明確的標(biāo)識;檢測依據(jù);取樣方法與日期;儲存條件;檢測開始和結(jié)束日期;檢測負(fù)責(zé)人和實驗人員;陽性對照、陰性對照、送檢樣品;特定方法取得的結(jié)果,結(jié)果使用的單位及計算方法;檢測結(jié)論;檢測過程觀察到的特別情況;其他需要報告的內(nèi)容。檢測結(jié)果應(yīng)來自同一實驗室樣品的兩份送檢樣品。當(dāng)一份送檢樣品的結(jié)果為陽性,另一份為陰性時,要重新測試?？梢赃m當(dāng)增加核酸擴增反應(yīng)體系中DNA模板量,使兩份樣品得到相同結(jié)果。每個樣品應(yīng)至少制備兩份DNA,必要時需檢測模板DNA的質(zhì)量,確保提取的DNA片段大于擴增片段。核酸擴增可設(shè)置PCR抑制劑對照。如果經(jīng)過兩次以上從核酸提取開始的重復(fù)檢測,檢測結(jié)果不一致,5可在檢測報告中注明檢測低限,檢測低限應(yīng)符合最低含量水平。11廢棄物處理檢測過程中的廢棄物,收集后在焚燒爐中焚燒處理,有毒有害廢棄物應(yīng)經(jīng)過除害再進(jìn)行處理,處理要符合環(huán)保要求。6附錄A(資料性附錄)金銀花快速PCR鑒定體系的建立為綠原酸、木犀草苷等酚酸、黃酮類物質(zhì),臨床應(yīng)用非常廣泛。為綠原酸、木犀草苷等酚酸、黃酮類物質(zhì),臨床應(yīng)用非常廣泛。盡管在2005年版《中國藥典》中已明確將忍冬作為金銀花唯一植物來源,但之前各版《中國藥花習(xí)用品,金銀花民間藥用非?；靵y?！吨袊参镏尽肥蛰d有102種忍冬屬植物,其中作為“金銀花冶中藥材商品民間用藥的約有19種(含變種)。民間作為“金銀花冶商品用藥的忍冬屬植物除金銀忍冬,盤葉忍冬、硬毛忍冬外均屬于忍冬組纏繞亞組,形態(tài)學(xué)非常類似《中國藥典》(2015年版)藥材鑒定項下收載了金銀花性狀鑒定和薄層色譜鑒定方法。但破碎的中藥性狀鑒定特征會模糊化甚至消失,導(dǎo)致鑒定效力減弱;而通過薄層色譜對供試品中綠原酸進(jìn)行鑒定存在一定缺陷,主要表現(xiàn)為:淤綠原酸在多種植物中均存在,作為專屬性鑒定成分值得商榷;于該方法無法鑒定金銀花及其近緣種。與傳統(tǒng)中藥鑒定方法相比,中藥分子鑒定具有準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好等特點,且不受樣品形態(tài)的限制,原藥材、飲片、粉末乃至含有生藥原型的中成藥(丸劑、散劑等),以及中藥材種子種苗和種質(zhì)資源均可應(yīng)用,由于其所需檢樣量少,對珍稀藥材及化石標(biāo)本的鑒定更具應(yīng)用價值。建立金銀花快速PCR鑒定標(biāo)準(zhǔn),有利于滿足中藥材和中藥飲片、種子種苗真?zhèn)舞b定的需求,保證中藥質(zhì)量可控。本附錄收集了9種金銀花常見偽品用于設(shè)計特異性PCR引物,具體樣品信息見樣品表。金銀花trnL-trnF序列625位G/T變異可以準(zhǔn)確鑒定金銀花及其同屬偽品,據(jù)此位點設(shè)計快速EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(J),J)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(Y),Y)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(H),H)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(郾),郾)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(F),R)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(:),:)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(5),5)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(AGTCCCTCTATC),TGGATGAGAAA)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(C),T)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(C),A)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(C),T)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(A),A)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(A),A)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(A),C)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(-),GA)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(3),A)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(;),T)7圖A.1金銀花正偽品序列比對及引物設(shè)計結(jié)果A.3實驗樣品選取來自不同產(chǎn)地的8個正品金銀花(忍冬)及忍冬屬9種16個近緣種偽品材料進(jìn)行快速PCR研究。植物樣品采自廣西、河南、山東、北京、安徽地區(qū),憑證標(biāo)本保存于中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源A.1丹毒風(fēng)熱毒蘊證可選用的中成藥序號物種拉丁名產(chǎn)地個數(shù)鑒定人1忍冬河南省封丘縣4劉紅彥2忍冬山東省臨沂市4李圣波3紅腺忍冬廣西崇左市2吳慶華4華南忍冬山東省臨沂市1李圣波5灰氈毛忍冬廣西南寧市2吳慶華6黃褐毛忍冬廣西桂林市2余麗瑩7水忍冬廣西桂林市2余麗瑩8金銀忍冬安徽省合肥市1彭華勝9郁香忍冬北京市2郝近大新疆忍冬北京市2郝近大繁果忍冬北京市2郝近大8PCR反應(yīng)程序PCR反應(yīng)程序:94益預(yù)變性1min;94益變性10s,60益退火延伸10s,35個循環(huán),獲得擴增產(chǎn)物。取出PCR管,對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測或置4益下保存。束后,將凝膠置于凝膠成像儀上或紫外透射儀上成像。上述PCR各主要參數(shù)均經(jīng)過系統(tǒng)的考察。束后,將凝膠置于凝膠成像儀上或紫外透射儀上成像。上述PCR各主要參數(shù)均經(jīng)過系統(tǒng)的考察。取20mg干燥材料,使用堿裂解法提取總DNA,所提取DEQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(淆品),DNA)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(均),可)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(獲),以)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(得),滿)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(淆品),DNA)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(均),可)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(獲),以)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(得),滿)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(約),足)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(1050),PCR)bEQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(p大小的擴),反應(yīng)的要求)產(chǎn)物,與trnL-trnF片段大小一致(圖A郾M:DL2000marker;1:忍冬;2:紅腺忍冬;3:灰氈毛忍冬;4:華南忍冬;5:黃褐毛忍冬;6:水忍冬;7:金銀忍冬;8:郁香忍冬;9:新疆忍冬利用金銀花(忍冬)SNP鑒定引物JYH郾F和JYH郾R進(jìn)行位點特異性PCR反應(yīng),并分別考察:型PCR儀(Eppendorf公司)、TC-512型PCR儀(TECHNE公司)對PCR反應(yīng)穩(wěn)定性的影響。對金銀花鑒定結(jié)果進(jìn)行考察,結(jié)果表明,使用快速PCR鑒定引物擴增時,如當(dāng)退火溫度為66益時,偽品也有熒光;當(dāng)退火溫度為70益和72益時,均無熒光;當(dāng)退火溫度為68益時,僅正品有熒減少PCR反應(yīng)時間,在退火溫度為68益時減少PCR反應(yīng)時間,在退火溫度為68益時,逐漸減少循環(huán)數(shù)。當(dāng)循環(huán)數(shù)為27個循環(huán),PCR產(chǎn)物出條帶,故最終選擇循環(huán)數(shù)為30。出現(xiàn)弱熒光(圖A郾3B)。然而,當(dāng)選用27個循環(huán)時,變性-出條帶,故最終選擇循環(huán)數(shù)為30。92362℃23264℃3A30cyle23435cyle23440cyle1234B95℃123491℃1234185℃23487℃23485℃123483℃23410S2345S2343S2341S234HSTaq234ApataTa4234TransTa4234rTa234EPCT-100234ABI9700234TC-51