(高清版)GBT 43722.1-2024 皮革 抗菌性能的測(cè)定 第1部分：膜接觸法

皮革抗菌性能的測(cè)定Leather—Determinationofantimicrobialactivity-2024-03-15發(fā)布2024-10-01實(shí)施I本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件是GB/T43722《皮革抗菌性能的測(cè)定》的第1部分。GB/T43722已經(jīng)發(fā)布了以下部分：——第1部分：膜接觸法。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由中國(guó)輕工業(yè)聯(lián)合會(huì)提出。本文件由全國(guó)皮革工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC252)歸口。本文件起草單位：通標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)(上海)有限公司、浙江通天星集團(tuán)股份有限公司、大康控股集團(tuán)有限公司、深圳市北測(cè)檢測(cè)技術(shù)有限公司、上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)、西南交通大學(xué)、廣東省科學(xué)院微生物研究所(廣東省微生物分析檢測(cè)中心)、天創(chuàng)時(shí)尚股份有限公司、廣東新虎威實(shí)業(yè)投資有限公司、江蘇集萃先進(jìn)纖維材料研究所有限公司、朗盛化學(xué)(中國(guó))有限公司、博富科技股份有限公司、上海市徐匯區(qū)疾病預(yù)防控制中心、上海潤(rùn)河納米材料科技有限公司、中國(guó)皮革制鞋研究院有限公司、中輕檢驗(yàn)認(rèn)證有限公司、中關(guān)村匯智抗菌新材料產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新聯(lián)盟。Ⅱ皮革產(chǎn)品作為皮膠原蛋白質(zhì)的加工產(chǎn)品，加工過程中使用的原輔料中含有大量的油脂、糖類等成分，是細(xì)菌、霉菌生長(zhǎng)的良好營(yíng)養(yǎng)源，再加上皮革結(jié)構(gòu)的多孔性和極性結(jié)構(gòu)使其容易吸濕，從而導(dǎo)致其在保存和使用過程容易受到微生物的侵入，不僅在皮革表面形成白色、藍(lán)色、黃色或黑色的菌斑或色斑，而且還能向革內(nèi)發(fā)展，使皮革的耐磨、強(qiáng)度和彈性等性能降低，嚴(yán)重影響其外觀及使用性能。此外，隨著人們對(duì)于預(yù)防疾病的意識(shí)不斷增強(qiáng)，各類抗菌材料和產(chǎn)品成為人們關(guān)注的對(duì)象，明示或宣傳有抗菌性能的皮革制品也逐漸成為決定市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力的重要因素之一。皮革產(chǎn)品根據(jù)其來源、加工過程等分為不同的類型。如根據(jù)表面吸水性的差異，可分為表面不吸水皮革和表面吸水性較強(qiáng)的皮革；根據(jù)皮革抗菌劑溶出性的不同，可分為非溶出型抗菌皮革和溶出型抗菌皮革等。皮革抗菌性能的測(cè)定可以根據(jù)皮革種類采用適合的檢測(cè)方法。GB/T43722旨在為皮革抗菌性能的測(cè)定提供依據(jù)，擬由四個(gè)部分構(gòu)成。——第1部分：膜接觸法。目的在于確立適用于表面不吸水皮革抗菌性能測(cè)定的定量試驗(yàn)方法。——第2部分：瓊脂平皿擴(kuò)散法。目的在于確立皮革抗菌性能測(cè)定的定性試驗(yàn)和評(píng)價(jià)方法。——第3部分：菌液吸收法。目的在于確立適用于表面吸水性很強(qiáng)的皮革抗菌性能測(cè)定的定量試驗(yàn)方法。——第4部分：振蕩法。目的在于確立其他膜接觸法和菌液吸收法不適用的皮革(尤其適用于使用了非溶出型抗菌劑的皮革)抗菌性能測(cè)定的定量試驗(yàn)方法。1皮革抗菌性能的測(cè)定第1部分：膜接觸法警示——本文件涉及的微生物可感染致病，操作人員應(yīng)采取一切必要的防護(hù)措施，避免對(duì)人員和環(huán)境的危害。試驗(yàn)應(yīng)由經(jīng)過微生物學(xué)培訓(xùn)且具有實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的專業(yè)人員在具備處理微生物技術(shù)條件的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。本文件描述了膜接觸法測(cè)定皮革抗菌性能的定量試驗(yàn)方法。本文件適用于不吸水皮革抗菌性能的測(cè)定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。QB/T2707皮革物理和機(jī)械試驗(yàn)試樣的準(zhǔn)備和調(diào)節(jié)3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。采用化學(xué)或物理方法殺滅或妨礙細(xì)菌和真菌生長(zhǎng)繁殖，以減少其數(shù)量以及活性的能力。對(duì)照樣controlsample未經(jīng)抗菌處理、用于驗(yàn)證試驗(yàn)微生物生長(zhǎng)條件的樣品。4原理通過接種定量微生物至不吸水的皮革試樣表面，用貼膜的方法使微生物均勻接觸試樣表面，經(jīng)一定時(shí)間培養(yǎng)后，測(cè)定試樣表面的活菌數(shù)，計(jì)算抗菌率，以此表示試樣的抗菌性能。5儀器設(shè)備5.1恒溫培養(yǎng)箱，控溫精度為±1℃。5.2冷藏箱，溫度能夠保持在2℃~10℃。5.3二級(jí)生物安全柜。25.4生物光學(xué)顯微鏡。5.5壓力蒸汽滅菌器，溫度能保持在(121±2)℃,壓力能保持在(103±5)kPa。5.6培養(yǎng)皿，直徑為90mm。5.7紫外燈。5.11模刀，符合QB/T2707的規(guī)定，內(nèi)壁為(50±2)mm×(50±2)mm的矩形。6試劑和材料6.1除特殊說明外，所用試劑均為分析純，試驗(yàn)用水應(yīng)為蒸餾水或去離子水。6.4氯化鈉(NaCl)溶液，0.85%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。6.5無水磷酸氫二鈉(Na?HPO?)。6.6磷酸二氫鉀(KH?PO?)。6.7乙醇溶液，70%(體積分?jǐn)?shù))。6.8磷酸緩沖液(PBS),將2.83gNa?HPO?(6.5)和1.36gKH?PO?(6.6)加入至1000mL蒸餾水中，待完全溶解后，用NaOH溶液(6.2)或HCl溶液(6.3)調(diào)節(jié)pH為7.1～7.4,分裝后置于壓力蒸汽滅菌器中，(121±2)℃條件下滅菌15min。6.9洗脫液，采用D/E中和肉湯(Dey-EngleyNeutralizingBroth)作為洗脫液。將5.0g胰蛋白胨、吐溫-80,加入至1000mL蒸餾水中，置于錐形瓶中混合并在沸水浴中充分溶解。然后用NaOH溶液(6.2)或HCl溶液(6.3)調(diào)節(jié)pH為7.0～7.2,分裝后置于壓力蒸汽滅菌器中，(121±2)℃條件下滅菌15min。6.10覆蓋膜，采用聚乙烯薄膜，尺寸為(40±2)mm×(40±2)mm,也可與試樣尺寸相適應(yīng)，厚度為0.05mm～0.10mm。用乙醇溶液(6.7)浸泡10min,再用蒸餾水沖洗，自然晾干。也可使用均質(zhì)袋切下6.11對(duì)照樣，聚乙烯片材質(zhì)，厚度<10mm,尺寸為(50±2)mm×(50±2)mm,與試樣尺寸一致。也可使用均質(zhì)袋切下的膜。7培養(yǎng)基7.1營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(NB)將5.0g牛肉膏、10.0g蛋白胨和5.0g氯化鈉與1000mL蒸餾水混合，加熱溶解，然后用NaOH溶液(6.2)或HCl溶液(6.3)調(diào)節(jié)pH為7.0～7.2,分裝后置于壓力蒸汽滅菌器中，(121±2)℃條件下滅菌15min。7.2營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)將5.0g牛肉膏、10.0g蛋白胨、5.0g氯化鈉和15.0g瓊脂與1000mL蒸餾水混合，加熱溶解，然后用NaOH溶液(6.2)或HCl溶液(6.3)調(diào)節(jié)pH為7.0～7.2,分裝后置于壓力蒸汽滅菌器中，(121±2)℃條件下滅菌15min。37.3馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)將5.0g馬鈴薯浸粉、20.0g葡萄糖、20.0g瓊脂和0.1g氯霉素與1000mL蒸餾水混合，加熱煮沸至完全溶解，然后用NaOH溶液(6.2)或HCl溶液(6.3)調(diào)節(jié)pH為5.8～6.2,分裝后置于壓力蒸汽滅菌器中，(121±2)℃條件下滅菌15min。7.4平板計(jì)數(shù)瓊脂(PCA)將2.5g酵母粉、5.0g胰蛋白胨、1.0g葡萄糖和15.0g瓊脂與1000mL蒸餾水混合，加熱溶解，然后用NaOH溶液(6.2)或HCl溶液(6.3)調(diào)節(jié)pH為7.0～7.2,分裝后置于壓力蒸汽滅菌器中，(121±2)℃條件下滅菌15min。8試驗(yàn)菌種8.1菌種試驗(yàn)菌種通常至少采用3種，如下所示。——革蘭氏陽性菌：金黃色葡萄球菌(細(xì)菌，ATCC6538或CGMCC1.2465)?！咨钪榫?真菌，ATCC10231或CGMCC2.2086)。也可根據(jù)客戶要求選用其他菌種，應(yīng)至少包括細(xì)菌和真菌，其中細(xì)菌種類至少含有1種革蘭氏陽性和1種革蘭氏陰性菌種，并在報(bào)告中注明試驗(yàn)菌種及編號(hào)。所有菌種均應(yīng)由國(guó)家相應(yīng)菌種保藏管理中心提供。選用其他菌種時(shí)，培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)方法可根據(jù)需要調(diào)整。8.2菌種保存對(duì)于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，將菌種接種于NA(7.2)斜面上，在(37±1)℃下培養(yǎng)18h～24h;對(duì)于白色念珠菌，將菌種接種于PDA(7.3)斜面上，在(28±1)℃下培養(yǎng)24h～48h。然后置于5℃~10℃下保存(不應(yīng)超過1個(gè)月),作為斜面保存菌。9試驗(yàn)菌液的制備9.1接種液的制備用NaCl溶液(6.4)稀釋NB培養(yǎng)基，用于金黃色葡萄球菌培養(yǎng)的NB質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%,用于大腸桿菌培養(yǎng)的NB質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%,白色念珠菌采用磷酸緩沖液(PBS)配制。用NaOH溶液(6.2)或HCl溶液(6.3)調(diào)節(jié)pH為7.0～7.2,分裝后置于壓力蒸汽滅菌器中，(121±2)℃條件下滅菌15min。為便于菌種分散可加入少量表面活性劑(如吐溫-80等)。9.2菌種活化對(duì)于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，將斜面保存菌轉(zhuǎn)接至NA(7.2)平板上，在(37±1)℃下培養(yǎng)18h～24h,再連續(xù)轉(zhuǎn)接1次后(在5代以內(nèi))的新鮮菌種培養(yǎng)物(24h內(nèi)培養(yǎng)物)用于菌懸液的制備；對(duì)于白色念珠菌，將斜面保存菌轉(zhuǎn)接到馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)平板上，在(28±1)℃下培養(yǎng)24h～48h,再連續(xù)轉(zhuǎn)接1次后(在5代以內(nèi))的新鮮菌種培養(yǎng)物(48h內(nèi)培養(yǎng)物)用于菌懸液的制備。9.3菌懸液的制備用接種環(huán)(5.8)從9.2的新鮮菌種培養(yǎng)物上取1環(huán)～2環(huán)新鮮菌種，加入到20mL接種液(9.1)中，用顯4微鏡觀察法或其他合適的方法估計(jì)活菌數(shù)目，10倍梯度稀釋并選擇菌液濃度為2.5×10?CFU/mL~10.0×10?CFU/mL的稀釋液作為試驗(yàn)菌液。該試驗(yàn)菌液冰冷3℃~4℃保存，在4h內(nèi)使用。10試樣的準(zhǔn)備10.1試樣和對(duì)照樣的取樣試樣：用模刀從粒面切取6塊尺寸為(50±2)mm×(50±2)mm的試樣，試樣厚度不應(yīng)大于5mm。3片用于“0”接觸測(cè)試，3片用于規(guī)定時(shí)間的接觸測(cè)試。若試樣尺寸無法滿足切取條件，可切取6塊尺寸不小于(20±1)mm×(20±1)mm的試樣，同時(shí)覆蓋膜聚乙烯薄膜也相應(yīng)減小。對(duì)照樣(6.11):6片，3片用于“0”接觸測(cè)試，3片用于規(guī)定時(shí)間的接觸測(cè)試。10.2試樣和對(duì)照樣的滅菌通常采用紫外燈處理滅菌，將試樣和對(duì)照樣的正反面在紫外燈下分別照射滅菌。也可選用其他適宜的滅菌方法，試樣的滅菌處理應(yīng)以不影響試樣的抗菌性能為原則。如采用其他滅菌方法，應(yīng)在試驗(yàn)報(bào)告中注明。11試驗(yàn)步驟將試樣和對(duì)照樣分別放入滅菌培養(yǎng)皿中，保持待測(cè)面向上，用移液管分別移取0.4mL菌懸液(9.3),緩慢滴加到每個(gè)試樣和對(duì)照樣的待測(cè)面上，然后將聚乙烯薄膜(6.10)覆蓋于菌液上，調(diào)節(jié)使菌液分散到整個(gè)聚乙烯薄膜，注意避免菌液從薄膜邊緣溢出，蓋上培養(yǎng)皿的上蓋。每組試樣做3個(gè)平行若試樣尺寸較小，可移取0.1mL～0.4mL菌懸液，使貼膜后試樣表面的菌液中含菌數(shù)量達(dá)到1.0×10?CFU/片～4.0×10?CFU/片。有些試樣表面很難防止菌液溢出，可通過增加惰性增稠劑(如質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%～0.3%的瓊脂等)以增加菌液的黏度，防止溢出，并在試驗(yàn)報(bào)告中注明。如果因樣品表面的花紋很難防止菌液溢出，可以通過“倒貼膜”的方法進(jìn)行測(cè)試。試樣尺寸調(diào)整為(40±2)mm×(40±2)mm,聚乙烯薄膜(6.10)尺寸為(50±2)mm×(50±2)mm。菌懸液(9.3)中增加惰性增稠劑以增加菌液的黏度，用移液管移取0.4mL菌懸液，緩慢滴加到每個(gè)聚乙烯薄膜(6.10)表面，將試樣待測(cè)面朝下，覆蓋于菌液上，調(diào)節(jié)使菌液分散到整個(gè)試樣，注意避免菌液從試樣邊緣溢出。如采用該方法，應(yīng)在試驗(yàn)報(bào)告中注明。對(duì)于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，將接種后的試樣和對(duì)照樣在(37±1)℃、相對(duì)濕度≥90%的條件下培養(yǎng)24h;對(duì)于白色念珠菌，將接種后的試樣和對(duì)照樣在(28±1)℃、相對(duì)濕度≥90%的條件下培養(yǎng)分別量取20mL洗脫液(6.9)到3個(gè)“0”接觸時(shí)間的試樣和對(duì)照樣中，充分洗脫后，取一定量的洗脫5液，用10倍稀釋法系列稀釋至合適稀釋倍數(shù)。金黃色葡萄球菌和大腸桿菌接種于平板計(jì)數(shù)瓊脂(PCA)中，每個(gè)稀釋倍數(shù)制作兩個(gè)平行樣，在(37±1)℃下培養(yǎng)24h～48h。白色念珠菌接種于馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)中，在(28±1)℃下培養(yǎng)48h～72h,然后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。分別量取20mL洗脫液(6.9)到培養(yǎng)后的試樣和對(duì)照樣(11.2)中，充分洗脫后，取一定量的洗脫液，用10倍稀釋法系列稀釋至合適稀釋倍數(shù)。金黃色葡萄球菌和大腸桿菌接種于平板計(jì)數(shù)瓊脂(PCA)中，每個(gè)稀釋倍數(shù)制作兩個(gè)平行樣，在(37±1)℃下培養(yǎng)24h～48h。白色念珠菌接種于馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)中，在(28±1)℃下培養(yǎng)48h～72h,然后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。如試驗(yàn)菌懸液(9.3)中增加惰性增稠劑以增加菌液的黏度，洗脫時(shí)需要采用機(jī)械攪拌，如均質(zhì)、旋動(dòng)或超聲波振動(dòng)等，需驗(yàn)證這些方法的回收有效性后方可采用。注：對(duì)于厚度較大的皮革，適當(dāng)增加洗脫液的用量，并在試驗(yàn)報(bào)告中注明。用肉眼觀察(必要時(shí)可用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器),記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量，以CFU表示。選取菌落數(shù)在30CFU～300CFU、無蔓延菌落生長(zhǎng)的平板記錄菌落總數(shù)。小于30CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300CFU的可記錄為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋倍數(shù)的菌落數(shù)取兩個(gè)平板的平均數(shù)。若平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，不宜采用，應(yīng)以無片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋倍數(shù)菌落數(shù)；若片狀菌落生長(zhǎng)不到平板的一半，另一半中菌落分布比較均勻，可計(jì)算半個(gè)平板后乘以2,代表該平板中的菌落數(shù)。當(dāng)平板出現(xiàn)菌落間無明顯界限的鏈狀生長(zhǎng)時(shí)，將每條單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù)。12結(jié)果計(jì)算與表示試驗(yàn)結(jié)果以試樣中的活菌數(shù)表示，按公式(1)進(jìn)行計(jì)算：式中：N——每個(gè)試樣的活菌數(shù)，單位為菌落形成單位每片(CFU/片);C—菌落數(shù)平均值，單位為菌落形成單位(CFU);D——稀釋倍數(shù)；V——洗脫液體積與計(jì)數(shù)時(shí)所取洗脫液體積的比值?；罹鷶?shù)N的計(jì)算結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。在V為20的情況下，對(duì)菌落數(shù)小于1的情況活菌數(shù)試驗(yàn)結(jié)果記為小于20。試驗(yàn)結(jié)果取3個(gè)試樣中的活菌數(shù)的算術(shù)平均值，保留兩位有效數(shù)字。當(dāng)活菌數(shù)小于20時(shí)，用20進(jìn)行平均值計(jì)算，保留兩位有效數(shù)字。12.2試驗(yàn)的有效性當(dāng)試驗(yàn)同時(shí)滿足以下3個(gè)條件時(shí)，則試驗(yàn)有效，否則應(yīng)重新取樣進(jìn)行試驗(yàn)：a)3個(gè)對(duì)照樣的“0”接觸時(shí)間的活菌數(shù)應(yīng)符合(最高對(duì)數(shù)值一最低對(duì)數(shù)值)/平均活菌數(shù)值對(duì)數(shù)值≤0.2的要求；b)3個(gè)對(duì)照樣“0”接觸時(shí)間