(高清版)GBT 43650-2024 野生動(dòng)物及其制品DNA物種鑒定技術(shù)規(guī)程

野生動(dòng)物及其制品DNA物種鑒定技術(shù)規(guī)程2024-03-15發(fā)布2024-07-01實(shí)施國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)I前言 l2規(guī)范性引用文件 13術(shù)語、定義和縮略語 13.1術(shù)語和定義 13.2縮略語 24樣品采集與儲(chǔ)存 24.1樣品采集 24.2抽樣 24.3取樣與儲(chǔ)存 24.4運(yùn)輸 35DNA鑒定程序的構(gòu)成 46DNA鑒定程序 46.1樣品前處理 4 56.3DNA純化 56.4DNA質(zhì)量評(píng)估 56.5檢測(cè)方法 67結(jié)果表述 8追溯方法 9污染預(yù)防與處理 10實(shí)驗(yàn)室區(qū)域設(shè)置 11儀器和試劑要求 12實(shí)驗(yàn)室清潔 13安全防護(hù) 14廢棄物處理 附錄A(資料性)電泳檢測(cè)程序 A.1常規(guī)電泳檢測(cè)法 A.2芯片電泳檢測(cè)法 A.3其他電泳檢測(cè)法 附錄B(資料性)通用引物序列信息 B.1Cytb基因通用引物 B.2COI基因通用引物 ⅡGB/T43650—2024B.312SrRNA基因通用引物 B.416SrRNA基因通用引物 附錄C(資料性)通用引物PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)程序 C.1反應(yīng)體系 C.2反應(yīng)程序 附錄D(資料性)特異性PCR的引物、反應(yīng)程序與反應(yīng)體系 C.1高鼻羚羊(Saigatatarica)特異引物 C.2雪豹(Pantherauncia)特異引物 C.3豹(Pantherapardus)特異引物 C.4虎(Pantheratigris)特異引物 C.5黑熊(Ursusthibetanus)特異引物 附錄E(資料性)qPCR反應(yīng)體系與反應(yīng)程序 E.1反應(yīng)體系 E.2反應(yīng)程序 附錄F(資料性)dPCR反應(yīng)體系與反應(yīng)程序 F.1反應(yīng)體系 F.2反應(yīng)程序 參考文獻(xiàn) Ⅲ本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由國家林業(yè)和草原局提出。本文件由全國野生動(dòng)物保護(hù)管理與經(jīng)營利用標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC369)歸口。本文件起草單位：東北林業(yè)大學(xué)、東北林業(yè)大學(xué)司法鑒定所、深圳華大生命科學(xué)研究院、中國海關(guān)科學(xué)技術(shù)研究中心、黑龍江省公安廳、哈爾濱檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證集團(tuán)有限公司、深圳華大法醫(yī)科技有限公司、廣東華大法醫(yī)物證司法鑒定所、黑龍江省野生動(dòng)物研究所、華南動(dòng)物物種環(huán)境損害司法鑒定中心、南寧海關(guān)技術(shù)中心、南京警察學(xué)院、合肥海關(guān)技術(shù)中心、廣西壯族自治區(qū)公安廳、東營市公安局。唐閎凱。1野生動(dòng)物及其制品DNA物種鑒定技術(shù)規(guī)程1范圍本文件規(guī)定了對(duì)野生動(dòng)物及其制品的來源進(jìn)行DNA物種鑒定時(shí)樣品采集與儲(chǔ)存、DNA鑒定程序的構(gòu)成、DNA鑒定程序、結(jié)果表述、追溯方法、污染預(yù)防與處理、實(shí)驗(yàn)室區(qū)域設(shè)置等主要技術(shù)要求。本文件適用于野生動(dòng)物及其制品來源物種的DNA檢驗(yàn)鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求GB/Z31233分立個(gè)體類產(chǎn)品隨機(jī)抽樣實(shí)施指南GB/T34796水溶液中核酸的濃度和純度檢測(cè)紫外分光光度法GA/T383法庭科學(xué)DNA實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)范LY/T2501野生動(dòng)物及其產(chǎn)品的物種鑒定規(guī)范NY/T541—2016獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范3術(shù)語、定義和縮略語3.1術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。選定的標(biāo)準(zhǔn)區(qū)域的、用于物種鑒定的一段相對(duì)較短的保守DNA片段。DNA物種鑒定DNAspeciesidentification利用DNA檢驗(yàn)技術(shù)對(duì)野生動(dòng)物及其制品進(jìn)行分類地位(科、屬、種)的判定。利用計(jì)算機(jī)算法和程序，確定兩個(gè)或多個(gè)核苷酸序列的相似性以至于同源性。人工合成的兩段互補(bǔ)寡核苷酸片段，一段與靶區(qū)域5'端DNA模板鏈互補(bǔ)；另一段與靶區(qū)域3'端DNA模板鏈互補(bǔ)。2熒光探針fluorescentprobe5'端和3'端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，并與目的DNA序列堿基互補(bǔ)的一段DNA片段。下列縮略語適用于本文件。BOLD:生命條形碼數(shù)據(jù)系統(tǒng)(barcodeoflifedatasystem)Cytb:細(xì)胞色素b(cytochromeb)dPCR:數(shù)字PCR(digitalPCR)PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction)qPCR:實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-timefluorescencequantitativePCR)RFLP:限制性片段長度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism)4樣品采集與儲(chǔ)存4.2.1形態(tài)特征完整、可分類識(shí)別的同類多個(gè)檢材，按照GB/Z31233中的簡單隨機(jī)抽樣或等距抽樣規(guī)4.2.2具有部分形態(tài)特征、可簡單分類的多個(gè)檢材，先分類，再按照GB/Z31233中的簡單隨機(jī)抽樣或等距抽樣規(guī)定執(zhí)行；或按照GB/Z31233中的分層抽樣規(guī)定執(zhí)行。4.2.3不具有可識(shí)別的形態(tài)特征的大批量檢材，先按照GB/Z31233中的簡單隨機(jī)抽樣或等距抽樣規(guī)定執(zhí)行，結(jié)果出現(xiàn)多個(gè)物種時(shí)，再按照GB/Z31233中的分層抽樣規(guī)定執(zhí)行。物種的個(gè)體數(shù)量可按鑒定結(jié)果所占比例核算。昆蟲等小型無脊椎動(dòng)物可整體取樣，取適量或整體粉碎，收集到離心管或密封袋等儲(chǔ)存介質(zhì)中，干應(yīng)先去除易污染的表層，宜采取新鮮潔凈的組織或內(nèi)臟5mm3以上，收集到離心管或密封袋等儲(chǔ)取1cm2以上收集到離心管或密封袋等儲(chǔ)存介質(zhì)中，干燥常溫、冷藏或—20℃保存。3整體送檢或清洗后取不少于0.2g骨粉或牙粉(組織殘留時(shí)宜取組織),收集到離心管或密封袋等整體送檢或清洗后取不少于0.2g粉末等收集到離心管或密封袋等儲(chǔ)存介質(zhì)中，干燥常溫、冷藏收集1根以上置于離心管或密封袋等儲(chǔ)存介質(zhì)中，干燥常溫、冷藏或—20℃保存。4.3.6血液(血痕)宜選新鮮全血采集于EDTA抗凝管或采血卡。血痕宜用采樣拭子等采集?？鼓芎筒蓸邮米拥扔们鍧嵢萜骰蛎芊獯仁占?mL～5mL,密封，冷藏或一20℃保存。用消毒的鑷子或勺等取整顆或在表層和內(nèi)層各取不低于0.2g,收集到離心管或密封袋等儲(chǔ)存介質(zhì)唾液等用消毒的紗布、棉花或拭子等采集，晾干密封常溫保存；或者直接密封，冷藏或一20℃保存；收集足量其他分泌物到離心管或密封袋等儲(chǔ)存介質(zhì)中，冷藏保存，宜盡快于一20℃保存。注：分泌物是指由腺體和組織器官分泌的物質(zhì)。4.4.1樣品宜盡快送檢。干燥樣品常溫運(yùn)輸，鮮軟組織等易腐敗的樣品應(yīng)冷藏(特殊時(shí)干冰冷凍)運(yùn)輸。4.4.2每個(gè)樣品應(yīng)分別包裝，在樣本袋或容器外標(biāo)記清楚，再將各樣品放到統(tǒng)一包裝袋或盒中。4.4.5疑似疫病(如禽流感等)動(dòng)物樣品，應(yīng)先消毒處理后，包裝按照NY/T541—2016中7.2的規(guī)定45DNA鑒定程序的構(gòu)成DNA鑒定程序包括5個(gè)操作步驟，檢材無形態(tài)鑒別特征時(shí)，有4大類方法可選；檢材具有部分形態(tài)鑒別特征或理化鑒別指標(biāo)等時(shí)，可與之結(jié)合進(jìn)行綜合判斷，程序流程圖如圖1所示。1.1.樣品前處理(見6.1)2.DNA提取(見6.2)3.DNA純化(見6.3)4,DNA質(zhì)量評(píng)估(見6.4)具有部分形態(tài)鑒別特征等5.1PCR法(見6.5.1)5.2等溫?cái)U(kuò)增法(見6.5.2)5.5綜合判斷(見6.5.5)5.3基因組測(cè)序法(見6.5.3)5.4其他DNA方法(見6.5.4)5.檢測(cè)方法(見6.5)無形態(tài)鑒別特征圖1DNA鑒定程序流程圖6DNA鑒定程序6.1樣品前處理用75%乙醇或去離子水等清洗表面2次～3次，粉碎(必要時(shí)脫鈣)處理。新鮮皮張等去除表層，剪碎或研磨。干燥皮張等應(yīng)先用75%乙醇或去離子水等清洗2次～3次，緩沖液浸泡去除表層，再剪碎或研磨。新鮮干凈組織直接剪碎或研磨。干燥組織應(yīng)先用緩沖液浸泡、去除表層，再剪碎或研磨。5用75%乙醇、去離子水等充分清洗、剪碎。依據(jù)檢材類型和DNA物種鑒定目標(biāo)，確定DNA提取方法，應(yīng)設(shè)置空白對(duì)照并嚴(yán)防交叉污染。6.2.2苯酚氯仿提取法適用于組織、血液等樣品量充足的檢材，按照GA/T383的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。適用于組織、血液等樣品量充足，且需要大片段DNA進(jìn)行全基因組測(cè)序的檢材。適用于組織、血液等樣品量充足的檢材，毛、羽等微量檢材以及糞便等檢材，應(yīng)嚴(yán)格按照說明書操作。6.2.5磁珠法試劑盒適用于毛、羽等微量檢材以及糞便等檢材，應(yīng)嚴(yán)格按照說明書操作。6.2.6全自動(dòng)工作站法適用于大批量樣品，應(yīng)嚴(yán)格按照儀器說明書操作。6.2.7其他提取方法使用等效DNA提取試劑盒，或驗(yàn)證的新方法?？蛇x擇高質(zhì)量純化試劑盒或同行驗(yàn)證的純化方法。6.4DNA質(zhì)量評(píng)估按照GB/T34796方法，測(cè)定DNA濃度，并判定DNA純度。評(píng)估DNA片段大小，判斷DNA完整性(見附錄A)。檢測(cè)樣品目標(biāo)基因的Ct值，分析DNA含量。檢測(cè)與DNA結(jié)合熒光染料的熒光強(qiáng)度，定量目標(biāo)DNA的濃度。66.5檢測(cè)方法應(yīng)嚴(yán)格設(shè)置陰性對(duì)照(不加DNA的空白對(duì)照)與陽性對(duì)照(已知物種的DNA樣品，必要時(shí))。確定目標(biāo)區(qū)域(如DNA條形碼、Cytb基因等),選擇通用引物(見附錄B),按照反應(yīng)體系和反應(yīng)程序(見附錄C)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)見附錄A,有擴(kuò)增產(chǎn)物且與預(yù)期大小一致，則純化(按純化試劑盒操作)或直接測(cè)序(混合樣品克隆測(cè)序)。如無擴(kuò)增產(chǎn)物，分析原因重新試驗(yàn)。使用BLAST或CLUSTAL等軟件，將測(cè)序所得有效DNA序列與候選物種的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行序列比對(duì)，得到序列一致性結(jié)果；或在數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對(duì)，選取一致性最高的序列及其他近緣物種的同注：多個(gè)數(shù)據(jù)庫綜合比對(duì)，包括但不限于自建標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫、國家動(dòng)物核酸數(shù)據(jù)庫以及各專項(xiàng)數(shù)據(jù)庫、國際的BOLD和GenBank數(shù)據(jù)庫等，注意甄別其數(shù)據(jù)的正確性。具體結(jié)果判定如下：a)與單一物種一致性最高，且≥99%,判定與已知物種一致，判定該檢材“來源于×××(物種)”b)與兩個(gè)及以上物種一致性最高，且≥99%,應(yīng)加測(cè)基因，或判定該檢材“來源于×××(物種)或×××(物種)……”或“檢出×××(物種)或×××(物種)DNA成分”;c)與單一物種一致性最高，且在90%～99%之間，應(yīng)加測(cè)基因，如仍未達(dá)到99%,應(yīng)謹(jǐn)慎判定；d)或進(jìn)化樹中，位于同一單系分支且置信值達(dá)80%以上的物種即為檢材所屬物種，判定該檢材e)因?yàn)闄z材質(zhì)量原因，未獲得有效DNA,或缺乏比對(duì)的標(biāo)準(zhǔn)序列，判定“無法判定”或"無法確定應(yīng)嚴(yán)格設(shè)置陽性對(duì)照(已知物種的DNA樣品，即檢材疑似物種的DNA樣品)和陰性對(duì)照(近緣物種的DNA和以無菌去離子水代替DNA模板的空白對(duì)照)。選擇目標(biāo)區(qū)域(如DNA條形碼、Cytb基因等),并選擇根據(jù)物種特異位點(diǎn)設(shè)計(jì)的物種特異性引物，確定反應(yīng)體系和反應(yīng)程序(見附錄D),進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)(見附錄A)。具體結(jié)果判定如下：7a)檢材與陽性對(duì)照有擴(kuò)增產(chǎn)物，產(chǎn)物的大小與DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)時(shí)與預(yù)期大小一致，且陰性對(duì)照無擴(kuò)增產(chǎn)物，則表示結(jié)果陽性，判定該檢材“來源于×××(物種)”或“檢出×××(物種)DNA成分”。若存在疑問可測(cè)序驗(yàn)證。b)陽性對(duì)照有擴(kuò)增產(chǎn)物，且產(chǎn)物的大小與DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)時(shí)與預(yù)期大小一致，檢材和陰性對(duì)照均無擴(kuò)增產(chǎn)物；或者檢材擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期大小不一致，則表示結(jié)果陰性，判定為“未檢出×××(物種)DNA成分”。陰性結(jié)果謹(jǐn)慎判別，可更換方法驗(yàn)證。c)檢材、陽性對(duì)照和陰性對(duì)照均有擴(kuò)增產(chǎn)物且產(chǎn)物的大小與DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)時(shí)，與預(yù)期大小一致，則表示試驗(yàn)污染，應(yīng)分析原因，重新試驗(yàn)。檢材、陽性對(duì)照和陰性對(duì)照均無擴(kuò)增產(chǎn)d)因?yàn)闄z材質(zhì)量原因無法獲得有效DNA,判定“無法判定”或“無法確定具體物種”。應(yīng)嚴(yán)格設(shè)置陽性對(duì)照(已知物種的DNA樣品，即檢材疑似物種的DNA樣品)、陰性對(duì)照(非疑似物種的DNA)和空白對(duì)照(提取時(shí)設(shè)置的提取空白對(duì)照和以無菌去離子水代替DNA模板的PCR空白對(duì)根據(jù)選擇的目標(biāo)區(qū)域(如DNA條形碼、Cytb基因等),選擇物種特異性引物和熒光探針，確定反應(yīng)體系和反應(yīng)程序(見附錄E),進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。qPCR反應(yīng)結(jié)束后，應(yīng)設(shè)置無效基線范圍。基線范圍選擇在3個(gè)～15個(gè)循環(huán)，如果有強(qiáng)陽性樣本，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整基線范圍。閾值設(shè)置原則以基線剛好超過正?？瞻讓?duì)照擴(kuò)增曲線(無規(guī)則的噪聲線)的最高點(diǎn)，且Ct值不出現(xiàn)任何數(shù)值為準(zhǔn)。以下條件有一條不滿足時(shí)，試驗(yàn)視為無效，應(yīng)重做qPCR擴(kuò)增：a)提取空白對(duì)照無特異性擴(kuò)增曲線；b)PCR空白對(duì)照無特異性擴(kuò)增曲線；c)陰性對(duì)照無特異性擴(kuò)增曲線；d)陽性對(duì)照Ct值<35。具體結(jié)果判定如下。a)待測(cè)樣品DNA物種特異性擴(kuò)增的Ct值<35并有明顯擴(kuò)增曲線，陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照擴(kuò)增正常(含內(nèi)參基因時(shí)，檢測(cè)結(jié)果也為陽性),判定該樣品“檢出×××(物種)DNA成b)待測(cè)樣品DNA物種特異性擴(kuò)增的Ct值>40,陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照擴(kuò)增正常(含內(nèi)參基因時(shí)，檢測(cè)結(jié)果也為陽性),判定該樣品“未檢出×××(物種)DNA成分”。陰性結(jié)果謹(jǐn)慎判別，可更換方法驗(yàn)證。c)待測(cè)樣品DNA成分的物種特異性擴(kuò)增的Ct值介于35～40之間，陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照擴(kuò)增正常(含內(nèi)參基因時(shí)，檢測(cè)結(jié)果也為陽性),可加倍DNA模板量，重復(fù)試驗(yàn)，如果Ct值減小并擁有明顯擴(kuò)增曲線，陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照依然擴(kuò)增正常(含內(nèi)參基因時(shí)，檢8測(cè)結(jié)果也為陽性),判定該樣品“檢出×××DNA成分”。否則判為“未檢出×××(物種)d)陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照皆陰性(含內(nèi)參基因時(shí)，檢測(cè)結(jié)果也為陰性),試驗(yàn)無效。e)因?yàn)闄z材質(zhì)量原因無法獲得有效DNA,判定“無法判定”或“無法確定具體物種”。根據(jù)選擇的目標(biāo)區(qū)域(如DNA條形碼、Cytb基因等),選擇物種特異性引物和熒光探針，確定反應(yīng)體系和反應(yīng)程序(見附錄F),進(jìn)行dPCR擴(kuò)增。反應(yīng)有熒光信號(hào)為陽性，無熒光信號(hào)為陰性，軟件記錄每個(gè)樣品的陽性和陰性數(shù)。正確度偏差不應(yīng)超過標(biāo)準(zhǔn)值的25%,應(yīng)符合數(shù)字PCR方法操作指南要求。具體結(jié)果判定如下：a)陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照擴(kuò)增正常，檢材陽性，判定該檢材“檢出×××(物種)DNA成分”或“來源于×××(物種)”。若存在疑問可b)陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照擴(kuò)增正常，檢材陰性，判定該檢材“未檢出×××DNA成分”。陰性結(jié)果謹(jǐn)慎判別，可測(cè)序驗(yàn)證物種。c)因?yàn)闄z材質(zhì)量原因無法獲得有效DNA,判定“無法判定”或“無法確定具體物種”。根據(jù)預(yù)判的物種范圍和選擇的目標(biāo)基因，選擇物種特異性引物或通用引物，確定反應(yīng)體系和反應(yīng)程序(見附錄C),進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)，若擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小正確，則進(jìn)行下一步酶切反應(yīng)。根據(jù)特異位點(diǎn)選擇限制性內(nèi)切酶，按該酶說明書反應(yīng)條件酶切。酶解產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，酶切片段數(shù)量和大小與目標(biāo)物種預(yù)期一致，判定該檢材為“檢出×××(物疑問可更換方法驗(yàn)證。因?yàn)闄z材質(zhì)量原因無法獲得有效DNA,巢式PCR、溶解曲線法等PCR方法，以及公開發(fā)表在權(quán)威專業(yè)性期刊上的其他基于PCR的DNA物種鑒定方法，應(yīng)經(jīng)專家組評(píng)估、驗(yàn)證后使用。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行操作。96.5.2等溫?cái)U(kuò)增法環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)等方法，應(yīng)經(jīng)專家組評(píng)估、驗(yàn)證后使用，依據(jù)方法驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行操作。注：等溫?cái)U(kuò)增法是一類分子生物學(xué)技術(shù)的總稱，在某一特定的溫度下，擴(kuò)大核酸的拷貝數(shù)。6.5.3基因組測(cè)序法DNA文庫要基于被行業(yè)內(nèi)廣泛認(rèn)可的測(cè)序平臺(tái)的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行構(gòu)建。基于文庫構(gòu)建方法，選擇使用合適的測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行全基因組測(cè)序。應(yīng)嚴(yán)格把控測(cè)序質(zhì)量。測(cè)序質(zhì)量可以通過多種指標(biāo)來評(píng)估，包括Q20、Q30和N區(qū)比例等。還應(yīng)考慮測(cè)序深度和測(cè)序覆蓋度。一般測(cè)序深度宜大于5倍。注：全基因組測(cè)序是指對(duì)生物檢材進(jìn)行整個(gè)基因組測(cè)序，包括長讀長測(cè)序和短讀長測(cè)序，用以獲得物種完整的基因組序列信息。合適基因組區(qū)域的確定待測(cè)樣本與其他物種進(jìn)行序列的比較分析時(shí)(如構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹等),應(yīng)選取各物種中的同源區(qū)域。一般宜過濾掉性染色體區(qū)域以及基因區(qū)，選擇進(jìn)化中性區(qū)域。全基因組物種鑒定分析選取疑似物種或其近緣物種的高質(zhì)量基因組作為參考基因組，將待測(cè)個(gè)體與其他候選物種的測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到參考基因組上，進(jìn)行遺傳變異的檢測(cè)，篩選出高質(zhì)量SNP(單核苷酸多態(tài)性)位點(diǎn)，通過物種特異位點(diǎn)比較分析，或構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，完成鑒定分析。結(jié)果與目標(biāo)物種預(yù)期相符，判定該檢材“檢出×××(物種)DNA成分”或“來源于×××物種”。否則，判定該檢材“未檢出×××(物種)DNA成分”或“非來源于×××物種”。因?yàn)闄z材質(zhì)量原因無法獲芯片法以及利用新技術(shù)開發(fā)的DNA物種鑒定方法，經(jīng)同行專家組評(píng)估、驗(yàn)證后，形成標(biāo)準(zhǔn)程序，可使用。6.5.5綜合判斷具有部分形態(tài)鑒別特征的檢材，上述DNA結(jié)果可以結(jié)合形態(tài)學(xué)特征綜合判斷；還可以結(jié)合地理分布、理化鑒別指標(biāo)等綜合判斷。7結(jié)果表述7.2“×××”檢材“為×××(物種)×××(制品名稱)(結(jié)合形態(tài)或理化指標(biāo)時(shí))。7.3“×××”檢材“來源于×××(物種)或×××(物種)……”或“檢出×××(物種)或×××(物8追溯方法8.1標(biāo)記方法在執(zhí)行4.3和6.1過程中，標(biāo)記的內(nèi)容包括：樣品編號(hào)、取樣日期、樣品類型、其他。在執(zhí)行第6章其他過程中標(biāo)記樣品編號(hào)。在執(zhí)行第6章所規(guī)定的程序過程中，記錄并保持以下內(nèi)容：執(zhí)行各程序的人員姓名、操作日期、執(zhí)行的操作內(nèi)容、操作的結(jié)果或觀察到的現(xiàn)象、其他。9污染預(yù)防與處理按照LY/T2501的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。10實(shí)驗(yàn)室區(qū)域設(shè)置按照LY/T2501的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。11儀器和試劑要求按照LY/T2501的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。12實(shí)驗(yàn)室清潔按照GB/T19495.2的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。13安全防護(hù)按照LY/T2501和GB/T19495.2的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。14廢棄物處理按照GB19489的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。(資料性)電泳檢測(cè)程序A.1.1試劑與儀器A.1.1.3核酸熒光染料。A.1.1.4瓊脂糖。A.1.1.6電泳儀器。A.1.1.7微量移液器。A.1.1.8紫外透射儀或凝膠成像系統(tǒng)。A.1.1.9微波爐。A.1.1.10電子天平。A.1.2.1配制瓊脂糖凝膠A.配制1×TAE緩沖液取50×TAE緩沖液20mL,加水至1000mL,配制成1×TAE稀釋緩沖液，待用。稱取1g瓊脂糖，置于200mL錐形瓶中，加入100mL1×TAE稀釋緩沖液，放入微波爐加熱至瓊脂糖全部溶化，取出搖勻，為1%瓊脂糖凝膠液。膠板制備步驟如下。a)將膠槽置于水平支持物上，插上樣品梳。b)瓊脂糖膠液冷卻至50℃~60℃,加入10μL核酸熒光染料(如SYBRGreen、SYBRGold等)溶液使其終濃度為1/10000(根據(jù)染料不同可調(diào)整),輕輕搖勻(也可取1μL～2μL染料工作液和5μL電泳樣品混勻靜置5min直接上樣)。慢慢地倒入膠槽內(nèi)，使膠液形成均勻的膠層。檢查并排除氣泡。c)室溫下靜置30min～45min,待瓊脂糖溶液完全凝固，垂直拔出樣品梳，注意不要損傷梳底部凝膠；將凝膠放入電泳槽中。d)加入電泳緩沖液(1×TAE)至電泳槽中，使液面高于膠面。取9μL檢測(cè)樣品與1μL(1/10體積)的10×DNA上樣緩沖液混勻，用微量移液器小心加入樣品槽中。避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。A.1.2.3電泳接通電泳儀電源，按照需要調(diào)節(jié)電壓，電泳開始，觀察電流情況或電泳槽中負(fù)極的鉑金絲有氣泡出現(xiàn)。根據(jù)片段大小電泳15min～30min,關(guān)閉電源。取出凝膠，在波長為302nm(或365nm)紫外光下觀察。DNA存在處顯示出肉眼可辨的熒光條帶。觀察時(shí)應(yīng)有防護(hù)，以免損傷眼睛。A.2芯片電泳檢測(cè)法按儀器說明書操作。A.3其他電泳檢測(cè)法按各透射儀的儀器說明書操作。(資料性)通用引物序列信息B.1Cytb基因通用引物mcb398:5'-TACCATGAGGACAAATATCATTCTG-3'mcb869:5'-CCTCCTAGTTTGTTAGGGATTGATCG-3PCR產(chǎn)物472bp,可擴(kuò)增脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物(Verma&.Singh,2003)。L14724:5'-GATATGAAAAACCATCGTTG-3'H15149:5'-CTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3'PCR產(chǎn)物約442bp,可擴(kuò)增脊椎動(dòng)物(Kocheretal.1989)。L14841:5'-AAAAAGCTTCCATCCAACATCTCAGCATGAAA-3'H15149:5'-CTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3'PCR產(chǎn)物約381bp,可擴(kuò)增脊椎動(dòng)物(Kocheretal.1989)。L14724:5'-GATATGAAAAACCATCGTTG-3'H15915:5'-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3'PCR產(chǎn)物約1140bp,可擴(kuò)增脊椎動(dòng)物(Xiaoetal.2001)。B.2COI基因通用引物L(fēng)CO1490:5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'HCO2198:5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'PCR產(chǎn)物約750bp,可擴(kuò)增脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物(Folmeretal.1994)。FishF1:5'-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3'FishR1:5'-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3'PCR產(chǎn)物約710bp,可擴(kuò)增魚類(Wardetal.2005)。B.312SrRNA基因通用引物L(fēng)1091:5'-AAACTGGGATTAGATACCCCACTAT-3'H1478:5'-GAGGGTGACGGGCGGTGTGT-3'PCR產(chǎn)物440bp,可擴(kuò)增脊椎動(dòng)物(Kocheretal.1989;DelPeroetal.2000)。B.416SrRNA基因通用引物16SA:5'-GTGCAAAGGTAGCATAATCA-3'16SB:5'-TGTCCTGATCCAACATCGAG-3'GB/T43650—2024PCR產(chǎn)物約440bp,可擴(kuò)增脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物(Ramadan,2011)。16SAR:5'-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3'16SBR:5'-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3'PCR產(chǎn)物長約572bp,可擴(kuò)增脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物(Inoueetal.2001)。16S-F:5'-TRACTGTRCAAAGGTAGC-3'16S-R:5'-TTAATTCAACATCGAGGTC-3'J12888:5'-CCGGTCTGAACTCARATCATGTA-3'N13889:5'-ATTTATTGTACCTTKTGTATCAG-3'PCR產(chǎn)物1049bp,可擴(kuò)增脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物(Simonetal.2006)。注：根據(jù)發(fā)表文獻(xiàn)等公開信息進(jìn)行驗(yàn)證、補(bǔ)充引物。(資料性)通用引物PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)程序C.1反應(yīng)體系表C.1反應(yīng)體系試劑加樣量(50μL反應(yīng)體系)ddH?OTaqMix(2×)DNA注：預(yù)試驗(yàn)反應(yīng)體系減為20μL。C.2反應(yīng)程序LCO1490/HCO2198:94℃/5min;(94℃/30s,45℃→50℃/30s,72℃/60s)6個(gè)循環(huán)；(94℃/30s,52℃/30s,FishF1/FishR1:L14724/H15149和L14841/H15149:L14724/H15915:C.2.416SrRNA基因(資料性)特異性PCR的引物、反應(yīng)程序與反應(yīng)體系D.1.1引物序列D.1.2反應(yīng)程序D.1.3反應(yīng)體系反應(yīng)體系見表D.1。試劑加樣量(20μL反應(yīng)體系)ddH?OTaqMix(2×)DNA注：變性溫度和退火、延伸時(shí)間根據(jù)不同的TaqMix做調(diào)整。如果調(diào)整退火溫度，需經(jīng)過試驗(yàn)確認(rèn)。D.2雪豹(Pantherauncia)特異引物D.2.1引物序列D.2.2反應(yīng)程序94℃/5min;(94℃/30s,60℃/30s,72℃/30s)35個(gè)循環(huán)；72℃/5min。D.2.3反應(yīng)體系D.3.1引物序列Ppo-CbF:5'-GTAAATTATGGCTGAATTATCCGG-3'Ppo-CbR:5'-CATAACCGTGAACAATAATAD.3.2反應(yīng)程序Pta-CbF:5'-TTTGGCTCCTTACTAGGGGTG-3'Pta-CbR:5'-CCGTAAACAATAGCACAATCCCGATA-3'PCR產(chǎn)物271bp(Sugimotoetal,2006)。D.4.2反應(yīng)程序94℃/5min;(94℃/30s,60℃/45s,72℃/45s)35個(gè)循環(huán)；72℃/5min。D.4.3反應(yīng)體系D.5黑熊(Ursusthibetanus)特異引物D.5.1引物序列Ut172f:5'-GACGCGACTACAGCCTTTTC-3'Ut367r:5'-CTATGAATGCGGTGGCTATAAC-3'PCR產(chǎn)物約217bp(Peppinetal,2008)。D.5.2反應(yīng)程序(資料性)qPCR反應(yīng)體系與反應(yīng)程序E.1反應(yīng)體系滅菌去離子補(bǔ)足反應(yīng)體系總體積至20μL。注1:qPCRmix使用等效品牌試劑。引物和熒光探針的使用量根據(jù)具體物種及靶基因進(jìn)行優(yōu)化、調(diào)整和確認(rèn)注2:每個(gè)樣品設(shè)置2個(gè)平行樣。E.2反應(yīng)程序95℃/10min;95℃/10s,60℃/30s,(40個(gè)～50個(gè))循環(huán)；60℃/min。循環(huán)在退火時(shí)收集熒光信號(hào)。注：不同儀器根據(jù)儀器要求，或根據(jù)不同物種鑒定方法調(diào)整循環(huán)參數(shù)。(資料性)dPCR反應(yīng)體系與反應(yīng)程序F.1反應(yīng)體系20μL體系含2×ddPCRSupermixforpr物種特異熒光探針1μL、DNA模板10ng～100ng,無菌去離子水補(bǔ)足反應(yīng)體系總體積至20μL。注：ddPCRSupermixforprobes,使用等效試劑。F.2反應(yīng)程序95℃/3min;94℃/30s,(55℃~68℃)/30s,(40個(gè)～60個(gè))循環(huán)。注：不同儀器根據(jù)儀器要求或不同物種鑒定方法調(diào)整參數(shù)。[1]陳浩峰.新一代基因組測(cè)序技術(shù)[M].北京：科學(xué)出版社，2016.[2]李金明.實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)：第2版[M].北京：科學(xué)出版社，2016.[3]彭年才.數(shù)字PCR——原理、技術(shù)及應(yīng)用[M].北京：科學(xué)出版社，2017.[4]彭濤.核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)及其應(yīng)用[M].北京：科學(xué)出版社，2018.[5]王廷華，劉佳，夏慶杰.PCR理論與技術(shù)：第3版[M].北京：科學(xué)出版社，2013.[6]張曉璐，白素英，徐艷春.賽加羚羊的分子生物學(xué)鑒別[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006,34(3):forPublicationofQuantitativeReal-TimePCRExperiments[J].ClinChem,55:611-622.fGeneticClassificationinBushBabies[J].IntJPrimatol,21:889-904.Biotechnol,3(5):294-299.SystemforAbsoluteQuantitationofDNACopyNumber[J].AnalChem,83:8604-8610.osteanphylogeny:Resolvinghigher-levelrelationshigenetEvol,20(2):275-285.[14]JaneckaJE,Jackson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