儀器分析：第五章 毛細管電泳 基本原理

2024/4/17第五章

毛細管電泳5.1.1概述5.1.2

毛細管電泳基本原理第一節(jié)

毛細管電泳基本原理GeneralizationCapillaryelectrophoresis,CE2024/4/175.1.1

概述

1937年，Tiselius(瑞典)將蛋白質混合液放在兩段緩沖溶液之間，兩端施以電壓進行自由溶液電泳，第一次將人血清提取的蛋白質混合液分離出白蛋白和α、β、γ球蛋白。（動畫）

發(fā)現試樣的遷移速率和方向由其電荷和淌度決定。

第一次的自由溶液電泳；第一臺電泳儀。獲1948年諾貝爾化學獎。2024/4/17經典電泳分析

利用電泳現象對某些化學或生物物質進行分離分析的方法和技術，叫電泳法或電泳技術。

按形狀分類：U形管電泳、柱狀電泳、板電泳；按載體分類：濾紙電泳、瓊脂電泳、聚丙烯酰胺電泳、自由電泳。2024/4/17高效毛細管電泳的出現傳統(tǒng)電泳分析：操作煩瑣，分離效率低，定量困難，無法與其他分析方法相比。1981年，Jorgenson和Luckas，用75

m內徑石英毛細管進行電泳分析，柱效高達40萬/m，促進電泳技術發(fā)生了根本變革，迅速發(fā)展成為可與GC，HPLC相媲美的嶄新的分離分析技術——高效毛細管電泳。2024/4/175.1.2高效毛細管電泳基本原理高效毛細管電泳在技術上采取了兩項重要改進：①采用了0.05mm內徑的毛細管；②采用了高達數千伏的電壓。

毛細管的采用使產生的熱量能夠較快散發(fā)，大大減小了溫度效應，使電場電壓可以很高。電壓升高，電場推動力大，又可進一步使柱徑變小，柱長增加。高效毛細管電泳的柱效遠高于高效液相色譜，理論塔板數高達幾十萬塊/m，特殊柱子可以達到數百萬。2024/4/17（1）雙電層與電滲流在pH溶液中，毛細管內壁與溶液間出現雙電層。管內壁帶負電荷，柱內溶液表面帶正電荷。電場作用下，毛細管柱中出現：電泳現象和電滲流(electroosmotic

flow，EOF

)現象。電滲流現象：柱內溶液整體向負極移動。2024/4/17（2）分離過程

帶電粒子的遷移速率=電泳+電滲流，兩種速度的矢量和。

正離子：兩種效應的方向一致，在負極流出。（動畫）

中性粒子無電泳現象，受電滲流影響，陽離子后流出；

陰離子：兩種效應的運動方向相反。v電滲流<v電泳時，在陽極流出。v電滲流>v電泳時，陰離子隨電滲流在負極流出，在這種情況下，不但可以按類分離，同種類離子由于受到的電場力大小不一樣也同時被相互分離。2024/4/17（3）高效毛細管電泳的特點①儀器簡單、易自動化

電源、毛細管、檢測器、溶液瓶。②分析速度快，分離效率高

在3.1min內分離36種無機及有機陰離子，4.1min內分離了24種陽離子，分離柱效：理論塔板數105～107/m。③操作方便，消耗少

進樣量極少，水介質中進行。④應用范圍極廣

有機物，無機物，生物，中性分子；生物大分子等。分子生物學，醫(yī)學，藥學，化學，環(huán)境保護，材料等。

2024/4/17（4）基本關系式

電泳是指帶電離子在電場中的定向移動，不同離子具有不同的遷移速率。遷移速率與哪些因素有關？

當帶電離子以速度v

在電場中移動時，受到大小相等、方向相反的電場推動力和平動摩擦阻力的作用。電場力：Fe=QE

阻力：F=f

v

e故：

QE=fv

eQ—離子所帶的有效電荷；E—電場強度；v

e—離子在電場中的遷移速率；f—摩擦系數。2024/4/17所以，帶電離子在溶液中的遷移速率：

物質離子在電場中差速遷移是電泳分離的基礎。

淌度μ

：單位電場強度下的平均電泳速度。

被分離組分的保留時間t為：μe

：電泳遷移率（電泳淌度,單位：cm2·V-1

·s-1）；E：電場強度；V：電壓；L：毛細管長度（有效長度為l）。

Q為離子所帶的靜電荷,f為stokes阻力系數2024/4/17對于球形離子：

f=6πηr

Rs

—離子的表觀液態(tài)動力學半徑；η—介質的黏度；從上式可見，當毛細管長度一定時，帶電離子的遷移速度與溶質離子的電荷、施加的電壓、緩沖液黏度及帶電離子的大小有關。電滲流是驅動離子運動的第二種作用力。2024/4/17（1）HPCE中電滲流的大小與方向

電滲流的大小用電滲流速度veo表示，取決于電滲流遷移速度μeo

和電場強度E。即：

veo=μeo

E電滲流遷移速率μeo取決于電泳介質及雙電層的Zeta電位

，即：l

—毛細管有效長度；teo—電滲流標記物（中性物質）的遷移時間。

為溶劑的介電常數；

為雙電層的Zeta電位。實際電泳分析，可在實驗測定相應參數后，按下式計算2024/4/17HPCE中電滲流的方向

電滲流的方向取決于毛細管內表面電荷的性質.內表面帶負電荷，溶液帶正電荷，電滲流流向陰極；石英毛細管：內表面帶負電荷，電滲流流向陰極。改變電滲流方向的方法：

（1）毛細管改性

表面鍵合陽離子基團。

（2）加電滲流反轉劑

內充液中加入大量的陽離子表面活性劑，將使石英毛細管壁帶正電荷，溶液表面帶負電荷。電滲流流向陽極。2024/4/17（2）

HPCE中電滲流的流形

電荷均勻分布，整體移動，電滲流的流動為平流，塞式流動（譜帶展寬很?。瑧苊饷毠軆啥顺霈F高度差而改變流形，降低分離效率；

液相色譜中的溶液流動為層流，拋物線流型，管壁處流速為零，管中心處的速率為平均速率的2倍（引起譜帶展寬較大）。2024/4/17（3）

HPCE中電滲流的作用

電滲流的速率約等于一般離子電泳速率的5～7倍；

各種電性離子在毛細管柱中的遷移速度為：

v+=ve+veo

陽離子運動方向與電滲流一致；

v-=ve-veo

陰離子運動方向與電滲流相反；

v0=veo

中性粒子運動方向與電滲流一致。（1）可一次完成陽離子、陰離子、中性粒子的分離。（2）改變電滲流的大小和方向可改變分離效率和選擇性，如同改變LC中的流速。（3）電滲流的微小變化影響結果的重現性。在HPCE中，控制電滲流非常重要。2024/4/17（4）遷移時間（保留時間）

HPCE兼具有電化學的特性和色譜分析的特性。有關色譜理論也適用。V—外加電壓；L—毛細管總長度；

l—毛細管有效長度；

ap=

ep+

eo

。2024/4/17（5）分離效率（塔板數）在HPCE中，僅存在縱向擴散：σ2=2Dt

從上式可以看出，提高分離電壓是增加分離效率的主要途徑。

擴散系數小的溶質比擴散系數大的分離效率高，分離生物大分子的依據。在理想條件下，理論塔板數可達106塊。2024/4/17（6）分離度

影響分離度的主要因素:工作電壓V；毛細管有效長度與總長度比；有效淌度差。提高毛細管電泳的分辨率有兩條途徑：一是通過增大分離電壓來提高柱效；二是控制電滲流，當電滲流移動