T∕CACM 1027.104-2018 鐵皮石斛PCR鑒定

準PCRidentificationofDendrobiiOfficinalisCaulis中華中醫(yī)藥學會發(fā)布I III 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 36.2三羥甲基氨基甲烷-鹽酸（Tris- 3 3 3 3 36.710×PCR緩沖液 3 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 5 5 5 6 6 6 6 6 6 6 7 7 8 10 18本標準起草單位：中國中醫(yī)科學院中藥資源中心、浙江省食品藥品檢驗本標準主要起草人：袁媛、黃璐琦、馬臨科、蔣超、李文庭、趙玉洋、祝明、趙維良、周駿輝、1鐵皮石斛PCR鑒定本標準規(guī)定了使用PCR鑒定鐵皮石斛藥材和飲片、種子種苗的通用方法和要求。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗按一定規(guī)則取自某一整體，能反映該整體的相關(guān)信息，可以作為判斷該整體情況的一個或多個部從測試樣本中分離出DNA的方法。聚合酶鏈式反應polymerasechainreacti一種用于擴增特定DNA片段的分子生物學技術(shù)，即DNA片段的特異性體外擴增過程，其特異性依賴于與目的DNA片段兩端互補的寡核苷酸引物。一般使用對照樣品代替送檢樣品同法DNA提取、靶核酸擴增和產(chǎn)物檢測過程。2以水代替送檢樣品同法DNA提取、靶核酸擴增和產(chǎn)物檢測過程。根據(jù)鐵皮石斛與其他石斛近緣種核酸序列的差異位點，設計鐵皮石斛鑒定特異性引物。利用兩步十六烷基三甲基溴化銨法（兩步CTAB法）提取樣品DNA，以提取DNA為模板進行PCR擴增，獲得的5.2金屬浴5.3制冰機5.4渦旋振蕩器5.5超純水發(fā)生器（分子生物學級別）5.9凝膠成像儀5.10核酸蛋白儀35.12連續(xù)可調(diào)微量移液槍5.13低溫冰箱除另有規(guī)定外，實驗試劑為不含DNA和DNA酶的分析純或生化試劑；實驗用水符合GB/T6682的要求；所配制的試劑均應滅菌后保存，并在容器上注明試劑名稱、濃度、配制時間、保存條件、失效在800mL去離子水中溶解12.1g三羥甲基氨基甲烷（Tris冷卻至室溫后用濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至8.0，加水定容至1L，分裝后高壓滅菌。室溫后用氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH值至8.0，加水定容至1L，分裝后高壓滅菌。含有2%（2g/100mL）CTAB，100mmol/LTris-HCl（pH8.020mmol/LEDTA（pH8.040mLEDTA(0.5mol/L,pH8.0)，146.1gNaCl溶解后加滅菌去離子水至900mL，使用氫氧化鈉溶液和鹽酸溶液調(diào)整pH至8.0，加水定容至1L，分裝后高壓滅菌。含有等量dATP、dCTP、dGTP、dTTP，使用時調(diào)整濃度至10mmol/L。依據(jù)不同類型的熱穩(wěn)定性DNA聚合酶（Taq酶）選擇對應的10×PCR緩沖液。4TPSH-AS1F：5'-CTGCTGAGATAAAATCCACCTPSH-AS1R：5'-ATGCACATCCGAGCCTTAA泳后應出現(xiàn)100bp、250bp、500bp、750bp、1000在80mL去離子水中溶解溴酚藍250mg，二甲苯氰FF250mg，蔗糖40g，加水定容至100mL，分裝。作間不同隔離區(qū)域進行，進入各區(qū)域應嚴格按照單一方向進行，即樣品制備區(qū)→核酸制備區(qū)→擴增區(qū)送檢樣品可分成2批，每批可分為同樣的3份，總量不低于100g。收樣并在樣品袋上貼上標簽，填寫采集數(shù)據(jù)表。對商品包裝和送樣說明進行拍照記錄，照片隨樣品一起備送檢樣品抽樣方法參照《中華人民共和國藥典》（四部）藥材和飲片取樣法（通則021樣。去除藥材和飲片表面附著物，依次使用75%乙醇和無菌雙蒸水擦拭表面后晾干。5取測試樣品置乳缽、勻漿機或球磨粉碎儀中稱取經(jīng)預處理的送檢樣品0.05g粉末置2.0mL的微量離心管中，加入已滅菌的前處理緩沖液保溫20min，12000r/min離心10min，棄去上清液；沉淀加入1000μL已高壓滅菌的前處理緩沖液，混勻，再65℃水浴保溫10min，12000r/min離心10min，棄去上清液；重復此步驟一次；沉淀加結(jié)束后取出冷卻至室溫；加入900μL氯仿-異戊醇（體積比24:1充分振蕩混勻，12000r/min離心10min；轉(zhuǎn)移750μL上清液至另一新的2.0mL的微量離心管中，加入750μL氯仿-異戊醇（體積比24：1充分振蕩混勻，12000r/min離心10min；轉(zhuǎn)移500μL上清液至另一新的2.0mL的微量離心管中，加入330μL異丙醇溶液，置–20℃放置1h；取出，12000r/min離心10min，棄去上清液，入無水乙醇500μL漂洗1min，12000r/min離心5min，棄去上清液；將具有DNA沉淀的微量離心管首次使用本方法時，應校對PCR儀溫控準確性，并使用陽性對照和陰性對照以核對使用的Taq酶或PCR預混液的適用性。PCR檢測應重復2次，并設置陽性對照、陰性對照（可選擇金釵石斛DendrobiumnobileLindl.、30s,62℃30s,72℃30s),72℃延伸7min。取出PCR管6PCR反應結(jié)束后在PCR反應體系內(nèi)加入2μL100×SYBRGreenI染料，混勻后于365nm紫外波長下取PCR擴增產(chǎn)物，加入5μL6×上樣緩沖液混勻后于GelRed染色的1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，若送檢樣品PCR產(chǎn)物出現(xiàn)與陽性對照相同的熒光、且空白對照無熒光即為陽性，否則為陰性。若陰性對照和空白對照無條帶，送檢樣品PCR擴增條帶的大小與陽性對照擴增條帶一致并位于9結(jié)果報告9.1一般要求9.2鑒定報告樣品經(jīng)檢測后，實驗室應根據(jù)實驗的具體操作程序和結(jié)果做好詳細的實驗記錄，出具檢測報告。h）特定方法取得的結(jié)果；k）其它需要報告的內(nèi)容。7檢測結(jié)果應來自同一實驗室樣品的兩份測試樣品。當一份測試樣品的結(jié)果為陽性，另一份為陰性還需要檢測模板DNA的質(zhì)量，每個樣品應至少制備兩份DNA（提取重復）必要時需檢測模板DNA的質(zhì)量，確保提取的DNA片段大于擴增片段。如果經(jīng)過兩次以上從核酸提取開始的重復檢測，檢測結(jié)果不一致，可在測試報告中表述該實驗室樣品的測試結(jié)果為陰性，并注明定量檢測和定性檢測方法的檢測檢測過程中的廢棄物，收集后在焚燒爐中焚燒處理，有毒有害廢棄物應經(jīng)過除害再進行處理，處8本方法適用于從富含多糖、淀粉的植源性中藥中快速提取DNA。兩步CTAB法：CTAB是一種陽離子去污劑,具有從低離子強度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖，而在能夠去除大部分多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，本方法達到了提高DNA純度和保證得率的雙重效果。A.3試劑和材料A.4儀器A.5DNA提取步驟離心10min；9f）轉(zhuǎn)移上層清液至另一新的2.0mL的微量離心管中，注意不要取到沉淀，加入等體積氯仿-異戊），g）轉(zhuǎn)移上層清液至另一新的2.0mL的微量離心管中，注意不要取到沉淀，加入2/3體積的異丙醇鐵皮石斛為蘭科植物鐵皮石斛DendrobiumofficinaleKimuraetMigo的干燥莖，收載于《中華出現(xiàn)用石斛屬其他物種魚目混珠作為“鐵皮石斛”的現(xiàn)象。文獻調(diào)查表明，鐵皮石斛的偽品主要包括齒瓣石斛、重唇石斛、鼓槌石斛、金釵石斛、美花石斛、細莖石斛、短棒石斛、流蘇石斛等石斛屬近緣物種，其形態(tài)和化學成分相似，尤其鐵皮石斛的加工制品如楓斗、干條等原植物形態(tài)特征已破壞，子標記研究，研究者對中國大陸的石斛屬物種進行了系統(tǒng)收集并研究其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，表明鐵皮石斛行序列比較，找到鐵皮石斛單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點，設計鑒定引物TPSH-AS1F：5'-存于中國中醫(yī)科學院中藥資源中心和中國科學院植物研究所。樣本信息詳見表B.1。1Dendrobiumofficinale2D.officinale3D.officinale4D.officinale45D.officinale46D.moniliforme7D.wilsonii18D.henanense29D.clavatum4D.hookerianum3D.devonianum3D.lohohens1D.loddigesii1D.henryi3D.gratiosissimum2D.capillipes1D.chrysanthum4D.crepidatum6D.falconeri3D.brymerianum3D.harveyanum3D.hancockii2D.pendulum2D.crystallinum2D.hercoglossum1D.christyanum2D.densiflorum7D.fanjingshanense4D.longicornuD.willamsonii8D.salaccense2D.strongylanthum8D.aduncum5D.monticolaSummerh12D.menglaensis1D.exile4D.porphyrochilum4D.acinaciforme3D.sinense6D.bellatulum4D.sino-minutiflorum4D.MyakiiD.myakii1D.thyrsiflorum5D.stuposum1D.okinawense1D.RuckeriD.ruckeri2D.hainanensis3D.trigonopus1D.wangliangii2D.transparens2D.wattii4D.nobile6D.xichouense1D.cucullatum3D.chrysotoxum5D.compactum1D.PulchrumD.pulchrum1D.sulcatum1D.moschatum1D.pachyglossumD.pachyglossum1D.fimbriatum1D.ellipsophyllum1D.heterocarpum1D.senile1D.polyanthum1D.dixanthum3D.cariniferum1D.wardianum1D.pseudotenellum1D.chryseum1D.unicum1D.jenkinsii2選取無霉變的待測干燥藥材標本1g，置于粉碎機中研磨粉碎至可過40目篩；將0.05g粉末轉(zhuǎn)移到2.0mL的微量離心管中，加入1000μL已滅菌的CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）沉淀液（配方：2%溫10min，12000r/min離心10min，棄上層清液；重復此步驟一白對照。陽性對照為經(jīng)過中國科學院植物研究所金效華博士鑒定的正品鐵皮石斛，陰性對照為非鐵皮10mmol·L-1dNTPs，0.5UrTaq酶（5U·μl-11μlDNA模板，加入鐵皮石斛鑒定引物M:DL2000DNA分子量標準圖B.3。為保證結(jié)果的穩(wěn)定性和準確性，后續(xù)選擇35個循環(huán)進行PBiosystem公司)；TC-512得到397bp的亮帶，陰性對照在此范圍內(nèi)