瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)

瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第1頁(yè)血涂片檢驗(yàn)瘧原蟲(chóng)是診療和判定瘧原蟲(chóng)種別主要方法，也是瘧疾流行病學(xué)調(diào)查主要個(gè)別，血涂片制作和染色好壞足以影響檢驗(yàn)結(jié)果，必須把握好“三關(guān)”。瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第2頁(yè)

玻片清潔。清潔玻片無(wú)油脂，無(wú)劃痕，無(wú)灰塵，玻片上有油跡，使厚血膜輕易脫落，薄血膜涂布不均勻。在用手指持玻片時(shí)，只能夾持玻片兩側(cè)邊緣，不要接觸玻片表面，以防止手指上油污染玻片。一、玻片清潔瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第3頁(yè)

新載玻片先用熱肥皂水洗滌，再用清水沖洗，然后用軟而潔凈毛巾擦干待用。(一)新載玻片洗滌瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第4頁(yè)①5%肥皂水煮沸法：

將洗衣肥皂削成小片，加水配成約5%肥皂水，煮沸后將玻片一張一張地平放進(jìn)肥皂水內(nèi)，微火煮約一刻鐘，然后滅火待肥皂水稍冷后，將潔干毛巾擦凈后待用。(二)使用過(guò)載玻片清潔方法有兩種：瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第5頁(yè)②清潔液浸泡法：清潔液配制以下：重鉻酸鉀80g濃硫酸100ml水(清凈水)1000ml瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第6頁(yè)

配制時(shí)須先將重鉻酸鉀研細(xì)放入水中，慢慢加溫到全部溶解為止，然后緩緩加入濃硫酸，待溶液冷卻后倒入有蓋大口玻璃缸內(nèi)。清潔玻片時(shí)，將待洗玻片逐張放入清潔中浸泡一兩天后，取出清水沖洗至完全沒(méi)有黃色為止。浸泡前最好用二甲笨除去鏡油，清潔液顏色變?yōu)槟G色后即失去清潔作用，不能再用。瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第7頁(yè)二、制片1.薄血膜涂制2.厚血膜涂制薄血膜厚血膜標(biāo)識(shí)處瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第8頁(yè)1.薄血膜涂制：1.薄血膜涂制(1)先用75%酒精棉球?qū)⒍瓜?，待酒精干后用采血針快速刺入耳垂近下端邊緣處?2)用左手拇指與食指以及右手中指向相正確方向?qū)⒍馆p輕擠壓出血。(3)取一張潔凈載玻片，將它左1/3表面接觸耳垂上血滴（不要將玻片接觸耳垂上皮膚），使一小滴血在玻片上。血量1-1.5mm3.1/4火柴頭大小。瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第9頁(yè)(4)將推片置于血溶之前與血液相接觸，待血液沿推片邊緣展開(kāi)后，將推片與載玻片保持30角度，用力均勻快速將推片由右向左推出而制成薄血膜。涂制得很好薄血膜只有一層血球，血球分布排列比較均勻，血膜末端突出如舌狀。若取血滴太大，則涂制血膜太寬太厚；若推時(shí)用力不均勻，則易成梯田狀.

若用力太大，則血膜兩端過(guò)厚，若涂片上有油污，則血膜成多孔狀。瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第10頁(yè)

薄血膜涂好后，再輕擠耳垂擠出約火柴頭大一血滴，將這一滴血滴在玻片中心1/3處然后用推片一角由血滴中央向周?chē)D(zhuǎn)涂成直徑約一厘米圓形血膜，旋轉(zhuǎn)涂制時(shí)間不宜過(guò)短，以免形成纖維蛋白束，遮蓋了瘧原蟲(chóng)。

厚血薄涂好后，應(yīng)平放待干，防蒼蠅舔食血膜或灰塵落在上面。受檢者編號(hào)可用鉛筆或鋼筆寫(xiě)在薄血膜邊緣上，也可用蠟筆寫(xiě)在厚血膜一端。2.厚血膜涂制瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第11頁(yè)血片制作和染色質(zhì)量規(guī)范

項(xiàng)目血膜好中差血片制作

厚血量位置直徑外觀(guān)4.0～5.0mm3玻片右1/38～1.0cm圓形厚膜均勻，邊緣整齊略多或略少稍偏右0.7～0.8或1.0～1.2cm圓形稍不均不整齊過(guò)多或過(guò)少偏右過(guò)多＜0.7或＞1.2cm厚薄不勻影響著色薄血量位置長(zhǎng)寬外觀(guān)1.5～2.0mm3玻片1/2～1/3處1.5×2.0cm舌狀厚薄均勻略多或略少稍偏右或偏左稍大或稍小舌狀稍不勻過(guò)多或過(guò)少偏右或偏左過(guò)多過(guò)大或過(guò)小厚薄不勻呈波浪型染色外觀(guān)鏡下蘭紫色白細(xì)胞瘧原蟲(chóng)漿呈蘭色，核深紅深蘭色胞漿淡蘭或深蘭，核紅色紅色或灰白色胞漿不易見(jiàn)，核淡紅或蘭色清潔度外觀(guān)鏡下光潔無(wú)油灰無(wú)沉渣稍有油污稍有沉渣油灰粘連沉渣多或有雜菌瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第12頁(yè)血片制作和染色質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn)1.血片制作質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn)：好：厚薄血膜均好，或薄血膜好，厚血膜中。中：薄血膜中，厚血膜好或中。差：薄血膜差，或厚薄血膜均差。瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第13頁(yè)2.血片制作和染色合格率要求：分別以血片制作、染色和清潔度好、中、差合并計(jì)算合格率。(1)血片制作合格率應(yīng)在85%以上。(2)染色合格率應(yīng)在85%以上。(3)清潔度合格率應(yīng)在80%以上。瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第14頁(yè)三、染色常見(jiàn)染色方法有姬姆薩氏和瑞氏兩種(一)吉氏染色法：吉氏染劑是最可靠血膜染劑，其優(yōu)點(diǎn)是易于掌握極少染色過(guò)分，染好后血膜褪色較慢.

瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第15頁(yè)吉氏染劑粉0.5g甘油（中性）25ml甲醇（純，分析純）25ml將吉氏染劑粉0.5置于乳缽中，加少許甘油充分研磨，再加甘油研磨，直至25ml甘油加完為止。將充分研磨吉氏甘油液倒入無(wú)水，潔凈棕色玻塞瓶中，然后分次加甲醇于乳缽洗出染劑倒入瓶中，直至25甲醇將乳缽洗凈并全部倒入瓶中，塞緊，充分搖勻，放置室內(nèi)一星期，天天搖動(dòng)數(shù)次，以后即可使用.1.吉氏染劑配制：瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第16頁(yè)

為了確保染色良好，使瘧原蟲(chóng)紅核和蘭胞漿分明，感染紅血球上薛氏小點(diǎn)清楚，在稀釋染劑原液時(shí)，所用蒸餾水必須加緩沖液（緩沖蒸餾水）。新鮮蒸餾水可能靠近中性，但貯存在一個(gè)時(shí)期后，因?yàn)槲樟丝諝庵卸趸级優(yōu)樗嵝?，所以蒸餾水中必須加緩沖液，使其到達(dá)咱們需要酸堿度。

2.緩沖液配制;瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第17頁(yè)

磷酸氫二鈉（無(wú)水）9.5g

蒸餾水1000ml

磷酸二氫鉀9.07g

蒸餾水1000ml

將上二液分別貯存于緊塞玻瓶中。

緩沖液配制：瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第18頁(yè)稀釋染劑所用蒸餾水ph以7.0-7.2為最適宜，現(xiàn)用現(xiàn)配，可按下表配制：緩沖蒸餾水配制（ml）

ph磷酸二氫鈉液磷酸二氫鉀液蒸餾水6.6

37

63

9006.8

49

51

9007.0

63

37

9007.2

73

27

9007.4

81

19

900在無(wú)條件地方，此時(shí)也可用當(dāng)?shù)仫嬘盟蠓羞^(guò)濾后試染，試染結(jié)果如淋巴細(xì)胞胞漿呈蘭色紅血球染色不很蘭就可使用。

瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第19頁(yè)3.染色步驟：①固定：用吉氏染液染色須先將薄血膜用甲醇或無(wú)水酒精固定。滴于薄血膜上，也可用玻棒沾取甲醇涂在薄血膜上，防止甲醇流至厚血膜，誤將其固定，可用蠟筆劃一條線(xiàn)，或者是斜放玻片，玻片上甲醇蒸發(fā)干后即可染色。②溶解血紅蛋白，在厚血膜上加2-3滴蒸餾水，待血紅蛋白充分溶解后傾去玻片上水，待血膜干后即可染色。瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第20頁(yè)③染色：快染：5：1(20%)，5滴水，1滴染液(原液)，染5分鐘清水沖洗即成。慢染：20：1(5%)，20滴水，1滴染液(原液)，染30分鐘用清水沖洗。待片水干后鏡檢。瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第21頁(yè)(二)瑞氏染色法：瑞氏染色法優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便快速，缺點(diǎn)是染液在熱環(huán)境中易變質(zhì)，且染色時(shí)間不易掌握，血膜上有染劑沉淀；用本法染色血膜退色較快，不宜作長(zhǎng)久保留標(biāo)本。瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第22頁(yè)

瑞氏染劑粉0.2g

甘油(中性)3ml(無(wú)中性也可)

甲醇(中性)97ml

將瑞氏染粉放入乳缽中，加入甘油充分研磨，然后加入甲醇10ml，混合后倒入干燥、清潔棕色玻璃瓶?jī)?nèi)，分次將甲醇倒入乳缽內(nèi)，至乳缽內(nèi)染劑洗凈為止，配制好染液充分搖勻即可使用。1.瑞氏染劑配制瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第23頁(yè)（1）先用蠟筆在厚薄血膜間劃一界限，然后用緩沖蒸留水滴2-3滴在已干厚血膜上，溶血后傾去水滴。

（2）加瑞氏染液5-8滴于薄血膜上，染色1-2分鐘。

（3）加5-8滴緩沖蒸留水于薄血膜上，用吸管混合均勻后把染液引到厚血膜上，使厚薄血膜同時(shí)染色約10分鐘。

（4）用清水輕輕沖去染液，將玻片直立待干后鏡檢2.染色步驟瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第24頁(yè)四、鏡檢(1)間日瘧原蟲(chóng)薄血片形態(tài)①被寄生紅細(xì)胞形態(tài)改變大?。猴@著脹大色澤：褪色斑點(diǎn)：紅色薛氏小點(diǎn)，細(xì)小數(shù)目多，重復(fù)感染：不多見(jiàn)瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第25頁(yè)②小滋養(yǎng)體胞漿：淡藍(lán)色，較大，稍粗厚，有一個(gè)空泡。核：紅色，通常一個(gè)，圓形。體積：較大，約占紅細(xì)胞直徑三分之一。瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第26頁(yè)③大滋養(yǎng)體胞漿：阿米巴樣，含數(shù)個(gè)空泡，體積較大，淺藍(lán)色核：一個(gè)，呈點(diǎn)狀或桿狀，瘧色素：短桿狀，細(xì)小，棕黃色瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第27頁(yè)胞漿：阿米巴樣，體積很大，空泡甚小或消失，蘭色核：2-10個(gè)團(tuán)塊，不規(guī)則，瘧色素：細(xì)桿狀，棕黃色，分布不均勻④早期裂殖體瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第28頁(yè)⑤裂殖體裂殖子：12-24個(gè)，多為16-18個(gè)，排列不規(guī)則，瘧色素：棕黃色，常集中于一側(cè)。瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第29頁(yè)

形狀：圓形，較小胞漿：淡蘭色，核：疏松，較大，常位于中央瘧色素：棕色，桿狀，均勻散在，⑥小配子體瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第30頁(yè)⑦大配子體形狀：圓形，較大胞漿：深蘭色核：致密，位于一側(cè)瘧色素：棕黃色，均勻散在，數(shù)很多。瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第31頁(yè)(2)間日瘧厚血片形態(tài)①小滋養(yǎng)體胞漿：大多呈“感嘆號(hào)”，“問(wèn)號(hào)”，飛鳥(niǎo)等形狀。核：較大，多數(shù)是一個(gè)，瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第32頁(yè)

間日瘧大滋養(yǎng)體相當(dāng)大，形狀不一，改變很多，胞漿蘭色，分散斷裂成為大小數(shù)目不等、邊緣不清楚圓塊，這是間日瘧原蟲(chóng)大滋養(yǎng)特征，核一個(gè)，大而顯著，呈不整齊圓形，位于胞漿中央或邊緣。瘧色素短桿狀，棕黃色，分布于胞漿上中。②大滋養(yǎng)體瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第33頁(yè)

胞漿多，形態(tài)改變很大，有分布斷裂成塊現(xiàn)象，核分裂成數(shù)個(gè)，較大，呈圓形或不規(guī)則圓形，零亂地分布在胞漿中，棕黃色短桿狀瘧色素較多。

③裂殖體前期瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第34頁(yè)瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第35頁(yè)

胞漿多，形態(tài)改變很大，有分布斷裂成塊現(xiàn)象，核分裂成數(shù)個(gè)，較大，呈圓形或不規(guī)則圓形，零亂地分布在胞漿中，棕黃色短桿狀瘧色素較多。

③裂殖體前期瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第36頁(yè)裂殖子12-24個(gè)不等，色素集中，位于中央或一側(cè)。④成熟裂殖體瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第37頁(yè)

間日瘧原蟲(chóng)配子體很大，幾乎同中性白細(xì)胞一樣大小，胞漿完整致密呈圓形或橢圓形，雌雄配子體形態(tài)與薄片上形態(tài)完全相同，配子體有時(shí)易與晚期滋養(yǎng)體相混同，但配子體胞漿比較固實(shí)，色素顆粒多而分散并有沿邊緣分布現(xiàn)象。⑤配子體瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第38頁(yè)間日瘧雄配子體間日瘧雌配子體瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第39頁(yè)1惡性瘧原蟲(chóng)薄血膜--環(huán)狀體環(huán)纖細(xì),約為RBC直徑1/5核1個(gè)，但2個(gè)常見(jiàn)紅細(xì)胞常含2個(gè)以上原蟲(chóng)蟲(chóng)體常位于紅細(xì)胞邊緣，呈“鳥(niǎo)飛狀”瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第40頁(yè)2惡性瘧原蟲(chóng)—大滋養(yǎng)體

普通不出現(xiàn)在外周血體小堅(jiān)固，圓形，不活動(dòng)瘧色素集中一團(tuán)，黑褐色原蟲(chóng)此時(shí)開(kāi)始集中在內(nèi)臟毛細(xì)血管瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第41頁(yè)3惡性瘧早期裂殖體瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第42頁(yè)4惡性瘧原蟲(chóng)成熟裂殖體

裂殖子8～36個(gè)，通常18～24個(gè)，排列不規(guī)則瘧色素集中成一團(tuán)蟲(chóng)體占紅細(xì)胞體積2／3至3／4瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第43頁(yè)5惡性瘧原蟲(chóng)雌配子體新月形，兩端較尖核致密，深紅色，常位于中央瘧色素黑褐色，分布于核周?chē)懺x(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第44頁(yè)5惡性瘧原蟲(chóng)雄配子體臘腸形，兩端鈍圓胞質(zhì)色藍(lán)而略帶紅核疏松，淡紅色，位于中央瘧色素黃棕色，小桿狀，在核周?chē)^多

瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第45頁(yè)惡性瘧厚血片形態(tài)環(huán)狀體核1-2個(gè)，常呈“!”、飛鳥(niǎo)等形狀。大滋養(yǎng)體常呈圓形、瘧色素集成1-2個(gè)團(tuán)。裂殖體較小，裂殖子8-26個(gè)。?配子體新月形，雄配子體臘腸形。瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第46頁(yè)瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第47頁(yè)五、是非區(qū)分1.生物物質(zhì)血液內(nèi)有性成份，白血球殘塊、血小板碎塊、紅血球內(nèi)何杰-喬氏點(diǎn)、卡玻氏環(huán)，水生阿米巴、細(xì)菌、滴蟲(chóng)等。特點(diǎn)：①無(wú)瘧色素②湊合常不完善③大小與瘧色素不符。瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第48頁(yè)染料雜質(zhì)、灰塵。

特點(diǎn)：

①無(wú)生物體死亡自如感覺(jué)

②常折光

③有湊合痕跡。2.無(wú)生命物質(zhì)瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)第49頁(yè)3.厚薄血膜之差薄血膜：用血少，瘧原蟲(chóng)形態(tài)完整，