微生物遺傳學(xué)實驗專題知識講座

一試驗?zāi)繕?biāo)掌握微生物變異原理了解紫外線誘變篩選突變菌株方法學(xué)習(xí)用梯度平板法分離抗藥性突變株微生物遺傳學(xué)實驗專題知識講座第1頁二試驗原理基因突變可分為自發(fā)突變和誘發(fā)突變。許多物理、化學(xué)、生物原因?qū)ξ⑸锒加姓T變作用。1、自發(fā)突變---（抗藥性突變）1）基因中堿基次序改變可造成微生物細(xì)胞遺傳變異。這種變異有時能使細(xì)胞在有害環(huán)境中存活下來，抗藥性突變就是一個例子。微生物遺傳學(xué)實驗專題知識講座第2頁2）微生物抗藥性突變是DNA分子某一特定位置結(jié)構(gòu)改變所致，與藥品存在無關(guān)，某種藥品存在只是作為分離某種抗藥性菌株一個伎倆，而不是引發(fā)突變誘導(dǎo)物。3）因而在含有一定抑制生長藥品濃度平板上涂布大量細(xì)胞群體，極個別抗性突變細(xì)胞會在平板上生成菌落。微生物遺傳學(xué)實驗專題知識講座第3頁4）將這些菌落挑取純化，深入進(jìn)行抗性試驗，就能夠得到所需要抗藥性菌株。5）抗藥性突變慣用作遺傳標(biāo)識，因而掌握分離抗藥性突變株方法是非常主要。6）為了便于選擇適當(dāng)藥品濃度，分離抗藥性突變株慣用梯度平板法。本試驗用梯度平板法分離大腸桿菌抗氨芐青霉素突變株。微生物遺傳學(xué)實驗專題知識講座第4頁2、紫外線誘發(fā)突變紫外線是一個慣用物理誘變原因，主要作用于DNA，引發(fā)DNA損傷；為防止光修復(fù)，處理后微生物應(yīng)放暗處培養(yǎng)。微生物遺傳學(xué)實驗專題知識講座第5頁三試驗步驟

1、抗藥性菌株篩選(p.167)

（1）取一個已經(jīng)滅菌空大平皿，把培養(yǎng)皿斜放(一邊墊起)，在無菌條件下倒入不含藥品底層培養(yǎng)基（10mLLB培養(yǎng)基,已分裝好，保溫在滅菌鍋中，要快）；(在超凈工作臺做)微生物遺傳學(xué)實驗專題知識講座第6頁（2）待平板中培養(yǎng)基凝固后將平皿放平，再倒入含有鏈霉素上層培養(yǎng)基10mL（含有鏈霉素200u/mL：現(xiàn)配現(xiàn)用，原液20萬單位，吸50微升加入50ML培養(yǎng)基）；2個組做，8個組用。(在超凈工作臺做)

在皿底用箭頭標(biāo)識,示藥品濃度從低到高。注意：抗生素要在培養(yǎng)基冷卻到50度左右再加；微生物遺傳學(xué)實驗專題知識講座第7頁（3）取一支大腸桿菌液體培養(yǎng)物，用移液槍移取200微升菌液到梯度平板上，進(jìn)行涂布。（試驗室做）（4）將平板倒置于37℃培養(yǎng)2天；觀察經(jīng)一次培養(yǎng)梯度平板上大腸桿菌生長情況。微生物遺傳學(xué)實驗專題知識講座第8頁后續(xù)試驗（不做）（5）選擇平板上1～2個生長在梯度平板中部單個菌落，用無菌接種環(huán)接觸單個菌落朝高藥品濃度方向劃線。（6）將平板倒置于37℃培養(yǎng)2天；觀察經(jīng)二次培養(yǎng)梯度平板上大腸桿菌生長情況。微生物遺傳學(xué)實驗專題知識講座第9頁2、紫外線誘變枯草桿菌（在試驗室做）1）取菌懸液5ml，放入無菌空平皿（大平皿），去蓋置于紫外燈下照射3min（15W,距離30cm）；2個組做，8個組用。2）稀釋：用10倍稀釋法把經(jīng)過照射菌懸液在無菌水中（已分裝好，每試管9mL）稀釋成10-1---10-6。一樣將未處理菌液進(jìn)行一樣稀釋做對照；3）分別取10-4，10-5，10-6稀釋菌液150微升各涂一個小平板(3個對照，3個試驗)；需用淀粉培養(yǎng)基4）培養(yǎng)：將上述平板用黑紙包好，置37℃