經典免疫學技術

經典免疫學技術經典免疫學技術第1頁第一節(jié)沉淀反應第二節(jié)凝集反應第三節(jié)補體參加抗原 抗體反應第四節(jié)中和反應第五章 經典免疫學技術經典免疫學技術第2頁第一節(jié)沉淀反應第二節(jié)凝集反應第三節(jié)補體參加抗原 抗體反應第四節(jié)中和反應第五章 經典免疫學技術經典免疫學技術第3頁第一節(jié)沉淀反應依據抗原與抗體反應條件及附加原因，沉淀反應可分為兩種主要形式：1．溶液中沉淀反應

2．凝膠中沉淀反應經典免疫學技術第4頁第一節(jié)沉淀反應依據抗原與抗體反應條件及附加原因，沉淀反應可分為兩種主要形式：

1．溶液中沉淀反應

2．凝膠中沉淀反應經典免疫學技術第5頁1．溶液中沉淀反應

（Precipitationreactioninsolution）

是指在清徹透明液體中，呈溶解狀態(tài)抗原與抗體在試管內或凹玻片上混勻，可凝聚成為肉眼可見絮狀或顆粒狀不溶性沉淀物。經典免疫學技術第6頁溶液中沉淀反應

鹽溶液抗原+抗體———

沉淀

20~56℃、pH6～8

抗原：沉淀原抗體：沉淀素經典免疫學技術第7頁1．溶液中沉淀反應

（Precipitationreactioninsolution）

（1）環(huán)狀沉淀試驗（2）免疫比濁法（3）免疫沉淀技術經典免疫學技術第8頁（1）環(huán)狀沉淀試驗

環(huán)狀沉淀試驗

（ringprecipitationtest）或毛細管內沉淀反應 （precipitationin capillarytube）經典免疫學技術第9頁經典免疫學技術第10頁（2）免疫比濁法(immunonephelomytry）

可溶性抗原、抗體在液相中特異結合，形成一定大小抗原抗體復合物，使反應液出現(xiàn)渾濁。復合物量與濁度成正比。與標準品比較即可計算出樣品中抗原或抗體含量。經典免疫學技術第11頁經典免疫學技術第12頁免疫沉淀技術經典免疫學技術第13頁經典免疫學技術第14頁免疫共沉淀經典免疫學技術第15頁GSTpull-down技術

經典免疫學技術第16頁第一節(jié)沉淀反應依據抗原與抗體反應條件及附加原因，沉淀反應可分為兩種主要形式：1．溶液中沉淀反應

2．凝膠中沉淀反應經典免疫學技術第17頁2．凝膠中沉淀反應（Precipitationreactioningel）

1968年Ouchterlong創(chuàng)造。即將抗原抗體溶液放在瓊脂凝膠板上小孔中，使它們彼此對向擴散，在抗原抗體相遇地方形成沉淀線。經典免疫學技術第18頁2．凝膠中沉淀反應

此沉淀線突出性質是：特異性抗原抗體不能經過；與沉淀線無關抗原和抗體分子則可自由經過此沉淀線。經典免疫學技術第19頁2．凝膠中沉淀反應（1）單相免疫擴散試驗（2）雙相免疫擴散試驗（3）免疫電泳（4）火箭電泳試驗（5）免疫印跡技術經典免疫學技術第20頁單相免疫擴散試驗經典免疫學技術第21頁經典免疫學技術第22頁雙相免疫擴散試驗經典免疫學技術第23頁（3）免疫電泳（immunoelectrophoresis）經典免疫學技術第24頁經典免疫學技術第25頁（4）火箭電泳試驗經典免疫學技術第26頁經典免疫學技術第27頁經典免疫學技術第28頁又稱Westernblotting電泳印漬及檢測（5）免疫印漬技術（immunoblotting）經典免疫學技術第29頁免疫印漬經典免疫學技術第30頁經典免疫學技術第31頁第一節(jié)沉淀反應第二節(jié)凝集反應第三節(jié)補體參加抗原 抗體反應第四節(jié)中和反應第五章 經典免疫學技術經典免疫學技術第32頁第二節(jié)凝集反應1．直接凝集反應2．間接凝集反應3．橋梁凝集反應4．共同凝集反應

經典免疫學技術第33頁第二節(jié)凝集反應1．直接凝集反應2．間接凝集反應3．橋梁凝集反應4．共同凝集反應

經典免疫學技術第34頁1．直接凝集反應

（directagglutination）

是將細菌或紅細胞與其對應抗體結合產生細菌凝集或紅細胞凝集現(xiàn)象。經典免疫學技術第35頁1．直接凝集反應（1）微生物凝集反應 如診療傷寒病肥達氏（Widalreaction）反應（2）同種紅細胞凝集反應如檢驗血型血細胞凝集現(xiàn)象經典免疫學技術第36頁經典免疫學技術第37頁第二節(jié)凝集反應1．直接凝集反應2．間接凝集反應3．橋梁凝集反應4．共同凝集反應

經典免疫學技術第38頁2．間接凝集反應

（indirectagglutination）

用可溶性抗原（或抗體）包被在一個與免疫無關、具一定大小不溶性顆粒（即載體顆粒，如：乳膠顆?；蚣t細胞）表面，然后與對應抗體（或抗原）作用，在有適宜電解質存在條件下，結合產生凝集現(xiàn)象。經典免疫學技術第39頁2．間接凝集反應正向間接凝集反應：將抗原先吸附在載體表面，然后與對應抗體結合產生凝集反應。反向間接凝集反應：將特異性抗體先吸附在載體表面，然后與對應抗原結合產生凝集反應。既可檢測抗原，也可檢測抗體；方法簡便、敏感。經典免疫學技術第40頁正向間接凝集反應經典免疫學技術第41頁

此方法對檢測微量抗原含有較高敏感性。而且因為相關病原體抗原成份普通情況下比血清抗體出現(xiàn)早，所以可用于一些傳染病如鉤端螺旋體抗原和乙型肝炎表面抗原(HBsAg)或原發(fā)性肝癌AFP檢測等。反向間接凝集反應經典免疫學技術第42頁經典免疫學技術第43頁第二節(jié)凝集反應1．直接凝集反應2．間接凝集反應3．橋梁凝集反應4．共同凝集反應

經典免疫學技術第44頁3．橋梁凝集反應

又稱Coombs抗球蛋白試驗。此試驗用于檢測不完全抗體。經典免疫學技術第45頁經典免疫學技術第46頁經典免疫學技術第47頁第二節(jié)凝集反應1．直接凝集反應2．間接凝集反應3．橋梁凝集反應4．共同凝集反應

經典免疫學技術第48頁4．共同凝集反應

又稱協(xié)同凝集反應。指由兩種顆粒成份相互作用而發(fā)生凝集反應。經典免疫學技術第49頁4．共同凝集反應（1）細菌抗體與攜帶蛋白A金黃色葡萄球菌CowanⅠ系致敏，即經過其IgGFc段與蛋白A結合，再與對應細菌發(fā)生凝集反應。（2）玫瑰花結試驗：主要用于研究各種淋巴細胞特征。經典免疫學技術第50頁經典免疫學技術第51頁E花環(huán)形成示意圖經典免疫學技術第52頁

B細胞EA、EAC玫瑰花環(huán)形成示意圖

經典免疫學技術第53頁淋巴細胞分離經典免疫學技術第54頁玫瑰花結經典免疫學技術第55頁淋巴細胞與紅細胞形成

玫瑰花結主要模式玫瑰花結類型紅細胞類型及處理淋巴細胞類型E花結綿羊紅細胞T、50%NKEA花結抗體致敏紅細胞B、T、NK、粒細胞、單核細胞及巨噬細胞EAC花結補體致敏紅細胞B經典免疫學技術第56頁第一節(jié)沉淀反應第二節(jié)凝集反應第三節(jié)補體參加抗原 抗體反應第四節(jié)中和反應第五章 經典免疫學技術經典免疫學技術第57頁

第三節(jié)

補體參加抗原抗體反應

1．補體參加直接抗原抗體反應2．補體參加間接抗原抗體反應經典免疫學技術第58頁

第三節(jié)

補體參加抗原抗體反應

1．補體參加直接抗原抗體反應2．補體參加間接抗原抗體反應經典免疫學技術第59頁1．補體參加直接

抗原抗體反應

（1）溶血反應（2）溶菌反應經典免疫學技術第60頁（1）溶血反應

（hemolyticassay）

溶血反應常作為是否存在游離補體指示系統(tǒng)。經典免疫學技術第61頁（1）溶血反應1942年Rutstein和Walker依據補體能使兔抗羊紅細胞抗體致敏羊紅細胞發(fā)生溶血特點，建立了測定血清中總補體活性方法（即50%溶血反應CH50

測定方法）經典免疫學技術第62頁（2）溶菌反應

溶菌反應常作為某血清中是否存在對應抗體檢測方法。經典免疫學技術第63頁

第三節(jié)

補體參加抗原抗體反應

1．補體參加直接抗原抗體反應2．補體參加間接抗原抗體反應經典免疫學技術第64頁2．補體參加間接

抗原抗體反應

（1）補體結合試驗（2）被動紅細胞溶解試驗（3）溶血空斑試驗經典免疫學技術第65頁（1）補體結合試驗（complementfixationtest）

1901年由Bordet和Gengou首先應用溶血反應作為指示系統(tǒng)，建立檢測抗原抗體反應方法。經典免疫學技術第66頁經典免疫學技術第67頁補體結合試驗原理經典免疫學技術第68頁經典免疫學技術第69頁（2）被動紅細胞溶解試驗

即吸附抗原紅細胞在有對應抗體和補體存在時，出現(xiàn)紅細胞溶解反應?？乖旅艏t細胞——加入待測血清和補體——判斷結果（陽性對照：加入對應抗體和補體）

經典免疫學技術第70頁（3）溶血空斑試驗

是測定B淋巴細胞產生和分泌抗體功效一個體外試驗方法。經典免疫學技術第71頁經典免疫學技術第72頁經典免疫學技術第73頁溶血空斑試驗經典免疫學技術第74頁第一節(jié)沉淀反應第二節(jié)凝集反應第三節(jié)補體參加抗原 抗體反應第四節(jié)中和反應第五章 經典免疫學技術經典免疫學技術第75頁第四節(jié)中和反應中和反應（neutralization）：是免疫學和病毒學中常見于檢測中和抗體是否存在及其效價試驗，反應抗體中和病毒感染性或細菌毒素生物學效應。經典免疫學技術第76頁

中和抗體：病原微生物侵入機體后，使之產生能中和對應微生物及其毒性產物（毒素），從而使病原微生物喪失感染能力或毒力抗體。（中和抗體：能與病毒結合，使其失去感染力抗體?？苟舅兀耗芘c細菌外毒素結合，中和其毒性作用抗體。）經典免疫學技術第77頁中和反應原理

即將被檢血清與病原微生物混合，經適當初間作用后，接種于宿主系統(tǒng)（包含動物、雞胚或培養(yǎng)細胞），按照對其產生保護效果差異，可判斷該微生物或毒素是否已被中和，并計算出中和程度（中和指數），即代表中和抗體效價。經典免疫學技術第78頁中和反應特點：

（1）檢測機體內是否存在中和抗體以及中和抗體效價，直接反應機體抗病毒能力，有利于臨床診療；（2）中和抗體在體內存留時間普通較長，可用于流行病學調查；（3）中和反應有嚴格種、型特異性，可對分離病毒進行準確分類判定。缺點：操作麻煩，試驗時間較長。經典免疫學技術第79頁中和反應類型：1．終點法中和反應2．蝕斑降低法中和反應經典免疫學技術第80頁1．終點法中和反應

依據滴定被血清中和后殘余毒力，來判斷血清中中和抗體效價。（1）固定病毒稀釋血清法（2）固定血清稀釋病毒法

經典免疫學技術第81頁（1）固定病毒稀釋血清法

先固定病毒毒價，再與等量遞進稀釋待測血清混合，置37℃1小時，每一稀釋度接種3～6只動物（或雞胚、培養(yǎng)細胞），接種后統(tǒng)計每組動物（或雞胚）存活數和死亡數（或培養(yǎng)細胞破壞程度），然后計算其半數保護率（PD50），即該血清中和效價。

經典免疫學技術第82頁（2）固定血清稀釋病毒法

將病毒原液作10倍遞進稀釋，分別與等量正常血清（對照組）、待測血清（試驗組）混合，置37℃1小時，每一稀釋度接種3～6只動物（或雞胚、培養(yǎng)細胞），接種后統(tǒng)計每組動