細胞工程第一次課

第一節(jié)細胞工程概述一、細胞工程概念

細胞工程是指以細胞作為研究對象，應用細胞生物學和分子生物學原理與方法，在細胞水平上進行操作，按照人們意志設計改造細胞一些遺傳性狀，從而培育出新生物改良品種或經(jīng)過細胞培養(yǎng)取得自然界中難以取得寶貴產(chǎn)品新興生物技術(shù)。1細胞工程第一次課第1頁二、細胞工程發(fā)展史上主要事件1902年，Haherlandt預言了植物細胞全能性；1907，美國Harrison培養(yǎng)了蛙胚神經(jīng)組織；1934，荷蘭溫特發(fā)覺生長素；1960，英國諾丁汗大學科金教授使用酶解方法從番茄幼苗根部制備得到大量原生質(zhì)體；1972，美國卡爾森等用NaNO3為融合誘導劑，未來自不一樣種煙草原生質(zhì)體進行融合，取得世界上第一個體細胞雜種植株；1977，英國胚胎工程技術(shù)，首例試管嬰兒；1997，多莉克隆羊；，首例克隆豬…2細胞工程第一次課第2頁3細胞工程第一次課第3頁4細胞工程第一次課第4頁1927-賽瑟·米爾斯坦CésarMilsteinGeorgesK?hler1946-1995喬治·可雷爾5細胞工程第一次課第5頁第二節(jié)細胞工程基本技術(shù)細胞工程分類①按遺傳操作對象結(jié)構(gòu)層次分6細胞工程第一次課第6頁依據(jù)研究對象不一樣植物細胞工程動物細胞工程微生物細胞工程7細胞工程第一次課第7頁一、細胞培養(yǎng)技術(shù)1.概念

細胞培養(yǎng)是將生物體內(nèi)某一塊組織取出，在體外經(jīng)過表面消毒處理后，用酶消化法將組織塊分散成單個細胞，然后放置在人工配制培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，并使它們在體外生長繁殖技術(shù)。8細胞工程第一次課第8頁2.細胞生長所需培養(yǎng)條件必須供給足夠營養(yǎng)主要包含糖、氨基酸、維生素、無機鹽等；必須確保一定生長環(huán)境，如適當溫度、pH值以及無菌條件。9細胞工程第一次課第9頁10細胞工程第一次課第10頁11細胞工程第一次課第11頁12細胞工程第一次課第12頁13細胞工程第一次課第13頁14細胞工程第一次課第14頁15細胞工程第一次課第15頁16細胞工程第一次課第16頁二、細胞融合技術(shù)1.概念

細胞融合又稱為體細胞雜交，由法國Barski等于1960年首先創(chuàng)建。它是指在離體條件下用人工方法將兩個或多個不一樣種細胞經(jīng)過無性方式融合成一個雜合細胞過程。融合后細胞含有兩個或多個不一樣細胞核，稱為異核體。17細胞工程第一次課第17頁融合過程18細胞工程第一次課第18頁1、病毒誘導融合：仙臺病毒、腺病毒等2、化學誘導融合：PEG、聚賴氨酸等3、物理誘導融合：電場脈沖、激光等細胞融合方法19細胞工程第一次課第19頁細胞融合儀電誘導原生質(zhì)體融合20細胞工程第一次課第20頁三、細胞重組技術(shù)細胞重組就是在體外條件下利用一定試驗技術(shù)從活細胞中分離出各種細胞結(jié)構(gòu)或組成“部件”，再把它們在不一樣細胞之間重新進行裝配，從而得到新生物活性細胞。21細胞工程第一次課第21頁1.核移植技術(shù)核移植技術(shù)是借助顯微操作儀，利用微吸管將一個細胞細胞核吸出并移植到另一個去核細胞中，從而可能創(chuàng)造出新生物品種一項技術(shù)。2.細胞器移植細胞器種類很多，分離與純化也比較輕易，不過研究較多是葉綠體和線粒體移植。22細胞工程第一次課第22頁第三節(jié)植物細胞工程植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物細胞培養(yǎng)與次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)植物原生質(zhì)體培養(yǎng)植物原生質(zhì)體融合技術(shù)人工種子單倍體植物誘發(fā)與利用體細胞遺傳變異及其利用23細胞工程第一次課第23頁一、植物組織培養(yǎng)技術(shù)1.概念植物細胞全能性細胞分化和脫分化植物細胞和組織培養(yǎng)外植體愈傷組織形態(tài)發(fā)生24細胞工程第一次課第24頁細胞全能性指植物體每個細胞在離體條件下都含有誘導生長分化形成完整植株潛在能力，這是因為每個細胞都含有一套完整基因組。細胞全能性是植物細胞和組織培養(yǎng)主要依據(jù)。細胞全能性25細胞工程第一次課第25頁細胞分化（differentiation），是指造成細胞形成不一樣結(jié)構(gòu)，引發(fā)功效改變或潛在發(fā)育方式改變過程。細胞脫分化(dedifferentiation)培養(yǎng)條件下使一個已分化細胞回復到原始無分化狀態(tài)或分生細胞狀態(tài)過程。細胞分化和脫分化26細胞工程第一次課第26頁植物細胞和組織培養(yǎng)植物細胞和組織培養(yǎng)是指將植物器官、組織、細胞或細胞器進行離體、無菌培養(yǎng)，并重新生成細胞或植物過程。植物器官培養(yǎng)植物細胞培養(yǎng)離體胚胎培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)花粉培養(yǎng)27細胞工程第一次課第27頁外植體植物組織培養(yǎng)中，作為離體培養(yǎng)材料器官或組織片段統(tǒng)稱為外植體（explant)，如植物根、莖、葉、花、果、穗、胚珠、胚乳、花藥、花粉等均可作為外植體。外植體脫分化因植物種類、器官起源及其生理情況不一樣而有很大差異。比如，煙草、胡蘿卜等植物脫分化比較輕易，禾本科植物脫分化比較難；花脫分化比較輕易，莖、葉脫分化比較難；幼嫩組織脫分化比較輕易，成熟老組織脫分化比較難。外植體選取合理是否，不但影響培養(yǎng)難易，而且有時甚至影響分化程度和器官類型。28細胞工程第一次課第28頁愈傷組織外植體經(jīng)過培養(yǎng)所形成脫分化植物細胞團稱為愈傷組織。在植物組織培養(yǎng)中，主要目標是誘導愈傷組織形成和形態(tài)發(fā)生，使一個離體細胞、一塊組織或一個器官細胞，經(jīng)過脫分化形成愈傷組織，并由愈傷組織再分化形成植物體。29細胞工程第一次課第29頁形態(tài)發(fā)生植物離體器官發(fā)生是指培養(yǎng)條件下組織或細胞團（愈傷組織）分化形成不定根、不定芽等器官過程。植物離體體細胞胚胎發(fā)生指各種外植體、培養(yǎng)細胞、原生質(zhì)體在培養(yǎng)條件下形成胚類似物（不論培養(yǎng)細胞是體細胞還是生殖細胞統(tǒng)稱為體細胞胚或胚狀體）過程。30細胞工程第一次課第30頁2.植物細胞全能性實現(xiàn)條件與過程條件：使植物細胞處于體外條件下（解除植株其余部分影響）一定營養(yǎng)物質(zhì)和培養(yǎng)條件，適當刺激31細胞工程第一次課第31頁外植體愈傷組織生長點根、芽或胚狀體小植株脫分化再分化器官發(fā)生營養(yǎng)生長過程胚胎發(fā)生32細胞工程第一次課第32頁3.植物組織/細胞培養(yǎng)營養(yǎng)要求和培養(yǎng)條件（1）培養(yǎng)基成份無機鹽碳源和能源維生素氮源生長調(diào)整劑誘導子33細胞工程第一次課第33頁MS組成配制1升（1000毫升）培養(yǎng)基硝酸銨1.65克硝酸鉀1.9克氯化鈣0.44克硫酸鎂0.37克磷酸二氫鉀0.17克碘化鉀0.83毫克硼酸5.2毫克硫酸鎂22.3毫克硫酸鋅3.6毫克鉬酸鈉0.25毫克硫酸銅0.025毫克氯化鈷0.025毫克硫酸鐵27.8毫克蔗糖30克瓊脂7克。其它生長調(diào)整物質(zhì)要依據(jù)花卉種類和培養(yǎng)目標而確定34細胞工程第一次課第34頁（2）培養(yǎng)條件要求光照：強度、光質(zhì)和光周期濕度：容器內(nèi)濕度幾乎是100%相對濕度，二是環(huán)境相對濕度普通要求70～80%。溫度：通常24-28℃pH值：5.6-6.0之間氣體滲透壓35細胞工程第一次課第35頁4.植物組織培養(yǎng)五階段預備階段：培養(yǎng)室、培養(yǎng)容器、接種工具準備，培養(yǎng)基制備，選擇適當外植體、表面殺菌。誘導去分化階段：接種，外植體在含有生長素類激素培養(yǎng)基中形成愈傷組織（光照非必需）繼代增殖階段：將愈傷組織移植到含有細胞分裂素培養(yǎng)基中，愈傷組織細胞數(shù)大大擴增生根發(fā)芽階段：將愈傷組織移植到含有細胞分裂素培養(yǎng)基中，使其重新分化成胚狀體，繼而長成小植株（光照必需）移栽成活階段36細胞工程第一次課第36頁37細胞工程第一次課第37頁5.植物組織培養(yǎng)技術(shù)應用（1）植物脫毒植物脫毒：馬鈴薯、大蒜、甘薯、草莓及許多果樹和花卉，因為多代營養(yǎng)繁殖，植株體內(nèi)積累了大量病毒，種性退化嚴重，表現(xiàn)為作物生長受到抑制，形態(tài)畸變，產(chǎn)量下降，品質(zhì)變劣等；而利用莖尖組織培養(yǎng)輔以化學或高溫處理，能夠很好地起到植株脫毒作用，培養(yǎng)出來種苗稱作脫毒苗。38細胞工程第一次課第38頁大田作物：馬鈴薯、甘薯、甘蔗、煙草蔬菜：白菜、大蒜、蔥、番茄、蘿卜。果樹：柑橘、蘋果、草莓、香蕉?；ɑ埽合闶?、各種菊花、天竹葵、紫羅蘭等大蒜：留種量占產(chǎn)量五到八分之一。馬鈴薯：留種量占產(chǎn)量十分之一。貝母：留種量占產(chǎn)量三分之一。39細胞工程第一次課第39頁脫毒技術(shù)在感染病毒植株中，病毒分布是不一致。在老葉片及成熟組織和器官中，病毒含量較高，但幼嫩和未成熟植物部位，病毒含量較低，而在生長點約0.1～1毫米時，則幾乎不含病毒顆粒。這是因為病毒繁殖運輸速度與莖尖細胞生長速度不一樣所致。在莖尖分生組織中，細胞繁殖十分快速，病毒還來不及侵入，所以就成為植物體相對無病毒`特殊區(qū)域。40細胞工程第一次課第40頁植物去病毒技術(shù)，實質(zhì)上就是采取不含病毒顆?；虿《绢w粒含量甚少0.1～0.5毫米帶1～2個葉原基莖尖作為外植體，進行微繁殖，使其培養(yǎng)成完整無病毒小植株技術(shù)。因為所取外植體很小，分離難度大，普通在解剖鏡下操作。培養(yǎng)無病毒所用器具必須嚴格消毒，克服培養(yǎng)中污染也是成敗關(guān)鍵。41細胞工程第一次課第41頁脫毒效果檢測指示植物判定(testplants)所謂指示植物是指含有能夠區(qū)分某種病毒專化性癥狀寄主植物。血清判定(serologictest)試管沉淀反應；免疫雙擴散；酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)。42細胞工程第一次課第42頁（2）快速繁殖技術(shù)快速繁殖技術(shù)：植物一個細胞或很小一塊組織經(jīng)過組織培養(yǎng)就能夠長成一株幼苗。因這些幼苗多在試管里形成，人們又經(jīng)常稱它們?yōu)椤霸嚬苊纭薄Ｅ嘤鲇酌邕€能夠繼續(xù)切割再次進行培養(yǎng)，這么一變十，十變百，就可繁殖出大量幼苗。43細胞工程第一次課第43頁用于加速一些難繁殖或繁殖速度很低植物，或一些需要需要加速繁殖特殊基因型，如名貴花卉、優(yōu)良資源、果樹芽變分離、工程植株等等。用于自然繁殖極易感染病毒植物，如馬鈴薯、甘薯、甘蔗、香蕉、石竹、百合等。用于有性繁殖變異范圍過大而自然條件下