細胞生物學學時

1細胞生物學學時第1頁課時安排第一章緒論2課時第二章細胞膜與細胞表面3課時第三章物質跨膜運輸與信號傳遞4課時第四章細胞質基質和內(nèi)膜系統(tǒng)4課時第五章細胞能量轉換——線粒體和葉綠體3課時第六章細胞骨架與細胞運動2課時第七章核糖體和蛋白質合成1課時第八章細胞核2課時第九章細胞增殖及其調(diào)控2課時第十章細胞分化與腫瘤2課時第十一章細胞衰老與凋亡1課時總結1課時2細胞生物學學時第2頁第一章緒論（2課時）

細胞生物學研究內(nèi)容和現(xiàn)實狀況

細胞生物學發(fā)展簡史

細胞基本知識概要

細胞生物學研究方法

3細胞生物學學時第3頁細胞生物學研究內(nèi)容和現(xiàn)實狀況

細胞生物學是當代生命科學主要基礎學科細胞生物學主要研究內(nèi)容

當前細胞生物學研究總趨勢與重點領域總趨勢：細胞生物學與分子生物學(包含分子遺傳學與生物化學)相互滲透與交融是總發(fā)展趨勢。重點領域：

染色體DNA與蛋白質相互作用關系—主要是非組蛋白對基因組作用

細胞增殖、分化、凋亡相互關系及其調(diào)控

細胞信號轉導研究

細胞結構體系組裝4細胞生物學學時第4頁細胞生物學

生命體是多層次、非線性、多側面復雜結構體系，而細胞是生命體結構與生命活動基本單位，有了細胞才有完整生命活動。

細胞生物學是研究細胞基本生命活動規(guī)律科學，它是在不一樣層次（顯微、亞顯微與分子水平）上以研究細胞結構與功效、細胞增殖、分化、衰老與凋亡、細胞信號傳遞、真核細胞基因表示與調(diào)控、細胞起源與進化等為主要內(nèi)容。5細胞生物學學時第5頁細胞生物學發(fā)展簡史從研究內(nèi)容來看細胞生物學發(fā)展可分為三個層次，即：顯微水平、超微水平和分子水平。從時間縱軸來看細胞生物學歷史大致能夠劃分為四個主要階段：第一階段：從16世紀末-19世紀30年代，是細胞發(fā)覺及細胞知識積累階段。第二階段：從19世紀30-20世紀中期，細胞學說形成后，主要進行顯微形態(tài)研究。第三階段：從20世紀30年代-50年代，以細胞超微結構、核型等研究為主要內(nèi)容。第四階段：從20世紀50年代，J.Watson和H.CrickDNA雙螺旋模型提出到70年代分子克隆技術成熟到當前，細胞生物學與分子生物學結合愈來愈緊密，基因調(diào)控、信號轉導、細胞分化和凋亡、腫瘤生物學等領域成為當前主要研究內(nèi)容。6細胞生物學學時第6頁主要內(nèi)容

細胞結構與功效、細胞主要生命活動：

細胞核、染色體以及基因表示研究

生物膜與細胞器研究

細胞骨架體系研究

細胞增殖及其調(diào)控

細胞分化及其調(diào)控

細胞衰老與凋亡

細胞起源與進化

細胞工程7細胞生物學學時第7頁美國科學情報研究所（ISI）1997年SCI（ScienceCitationIndex）收錄及引用論文檢索，全世界自然科學研究中論文發(fā)表最集中三個領域分別是：細胞信號轉導（signaltransduction）；細胞凋亡（cellapoptosis）；基因組與后基因組學研究（genomeandpost-genomicanalysis）。8細胞生物學學時第8頁

美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）在1988年底發(fā)表一份題為《什麼是當今科研領域熱門話題？》（“Whatispopularinresearchtoday？”）調(diào)查匯報中指出，當前全球研究最熱門是

三種疾?。?/p>

癌癥（cancer）

心血管?。╟ardiovasculardiseases）

愛滋病和肝炎等傳染病

（infectiousdiseases：AIDS，hepatitis）

五大研究方向：

細胞周期調(diào)控（cellcyclecontrol）；

細胞凋亡（cellapoptosis）；

細胞衰老（cellularsenescence）；

信號轉導（signaltransduction）；

DNA損傷與修復（DNAdamageandrepair）9細胞生物學學時第9頁細胞發(fā)覺是和顯微鏡創(chuàng)造分不開。1665英國人RobertHook用自己設計與制造顯微鏡（放大倍數(shù)為40-140倍)觀察了軟木（櫟樹皮)薄片，第一次描述了植物細胞結構，并首次用拉丁文cellar（小室)這個詞來稱呼他所看到類似蜂巢極小封閉狀小室（實際上只是觀察到到纖維質細胞壁)。

1680荷蘭人A.vanLeeuwenhoek成為皇家學會會員，一生中制作了200多臺顯微鏡和500多個鏡頭。他是第一個看到活細胞人，觀察過原生動物、人類精子、鮭魚紅細胞、牙垢中細菌等等。10細胞生物學學時第10頁在1838－1839年，德國植物學家M.Schleidon和動物學家T.Schwann在總結前人工作基礎上提出了細胞學說。“細胞學說”基本內(nèi)容認為細胞是有機體，一切動植物都是由細胞發(fā)育而來,并由細胞和細胞產(chǎn)物所組成；每個細胞作為一個相對獨立單位，現(xiàn)有它“自己”生命,又對與其它細胞共同組成整體生命有所助益；新細胞能夠經(jīng)過老細胞繁殖產(chǎn)生。11細胞生物學學時第11頁1680荷蘭人A.vanLeeuwenhoek成為皇家學會會員，一生中制作了200多臺顯微鏡和500多個鏡頭。他是第一個看到活細胞人，觀察過原生動物、人類精子、鮭魚紅細胞、牙垢中細菌等等。

12細胞生物學學時第12頁13細胞生物學學時第13頁1.1831英國人RobertBrown發(fā)覺植物細胞核。2.1832德國人？C.J.Dumortier觀察了藻類細胞分裂，并認為細胞起源于原來存在細胞。3.1835德國人H.vonMolh仔細觀察了植物細胞分裂，認為是植物根和芽尖極易觀察到現(xiàn)象。4.1835法國人F.Dujardin觀察動物活細胞時發(fā)覺“肉樣質”（Sarcode)。5.1839捷克人J.E.Pukinye用prtoplasm這一術語描述細胞物質，“Protoplast”為神學用語，指人類始祖亞當。6.1841波蘭人R.Remak發(fā)覺雞胚血細胞直接分裂（無絲分裂）。7.1846德國人H.vonMohl研究了植物原生質，發(fā)表了“identifiesprotoplasmasthesubstanceofcells”。14細胞生物學學時第14頁8.1848德國人W.Hofmeister描繪了鴨跖草Tradescantia花粉母細胞，明確表達出染色體，但他沒有認識到之一主要性，40年后德國人H.vonWaldeyer因這一結構可被堿性染料著色而定名為Chromosome。9.1861德國人M.Shultze認為動物細胞內(nèi)肉樣質和植物體內(nèi)原生質含有一樣意義。他給細胞定義是："thecellisanaccumulationoflivingsubstanceorprotoplasmdefinitelydelimitedinspaceandpossessingacellmembraneandnucleus?！?0.1864德國人MaxSchultze觀察了植物胞間連絲。11.1865德國人J.vonSuchs發(fā)覺葉綠體。12.1866奧地利人G.Mendel發(fā)表了對豌豆雜交試驗結果，提出遺傳分離規(guī)律和自由組合規(guī)律。15細胞生物學學時第15頁13.1868英國人T.H.Huxley在愛丁堡作題為“生命物質基礎”（thephysicalbasisoflife）演講匯報時首次把原生質概念介紹給了英國公眾。14.1871德國人F.Miescher從膿細胞中分離出核酸。15.1876德國人O.Hertwig發(fā)覺海膽受精現(xiàn)象，其論文題目為"observethefertilizationofaseaurchinegg"。16.1879德國人W.Flemming觀察了蠑螈細胞有絲分裂，于1882年提出了mitosis這一術語。以后德國人E.Strasburger(1876~80)在植物細胞中發(fā)覺有絲分裂，認為有絲分裂實質是核內(nèi)絲狀物（染色體)形成及其向兩個子細胞平均分配，動植物受精實質上是父本和母本配子核融合，并于1984提出了Prophase和Metaphase概念。17.1882德國人E.Strasburger提出細胞質（cytoplasm）和核質（nucleoplasm）概念。16細胞生物學學時第16頁

18.1883比利時人E.vanBeneden證實馬蛔蟲Ascarismegalocephala配子染色體數(shù)目是體細胞二分之一，而且在受精過程中卵子和精子貢獻給合子染色體數(shù)目相等。19.1883比利時人E.vanBeneden和德國人T.Boveri發(fā)覺中心體。20.1884德國人O.Hertwig和E.Strasburger提出細胞核控制遺傳論斷。21.1886德國人A.Weismann提出種質論。22.1890德國人RichardAltmann描述了線粒體染色方法，他推測線粒體就像細胞內(nèi)共生物，并認為線粒體與能量代謝相關。他還于1889年提出了核酸概念。23.1892德國人T.Boveri和O.Hertwig研究了減數(shù)分裂本質，并描述了染色體聯(lián)會現(xiàn)象。24.1898意大利人C.Golgi用銀染法觀察高爾基體。17細胞生物學學時第17頁25.1900孟德爾在34年前發(fā)表遺傳法則被重新發(fā)覺。26.1905美國人ClarenceMcClungshowsthatfemalemammalshave2XchromosomesandthatmaleshaveanXandaY27.1908美國人T.H.Morgan以Drosophilamelanogaster為材料開始著名遺傳學試驗，19提出遺傳染色體理論，19發(fā)表"遺傳本質"（PhysicalBasisofHeredity）。1926年發(fā)表"基因學說"（TheTheoryoftheGene）28.1910德國人A.Kossel取得諾貝爾生理醫(yī)學獎，他首先分離出腺嘌呤、胸腺嘧啶和組氨酸。29.1935美國人W.M.Stanley首次得到煙草花葉病毒結晶體。

30.1940德國人G.A.Kausche和H.Ruska發(fā)表了世界第一張葉綠體電鏡照片。18細胞生物學學時第18頁31.1941美國人G.W.Beadle和E.L.Tatum提出一個基因一個酶概念。32.1944美國人O.Avery等人經(jīng)過微生物轉化試驗證實DNA是遺傳物質。33.1945美國K.R.Porter、A.Claude和E.F.Fullam發(fā)覺小鼠成纖維細胞中內(nèi)質網(wǎng)。34.1949加拿大人M.Bar發(fā)覺巴氏小體。35.1951美國人JamesBonner發(fā)覺線粒體與細胞呼吸相關。

36.1953美國人J.D.Watson和英國人F.H.C.Crick提出DNA雙螺旋模型。37.1955比利時人C.deDuve發(fā)覺溶酶體和過氧化物酶體。19細胞生物學學時第19頁38.1955美國人VincentDuVigneaud因人工合成多肽而獲諾貝爾獎。39.1957J.D.Robertson用超薄切片技術取得了清楚細胞膜照片，顯示暗-明-暗三層結構。40.1959年，蔣有興（美籍華人）利用徐道覺創(chuàng)造低滲處理技術證實了人2n為46條，而不是48條。41.1961英國人P.Mitchell提出線粒體氧化磷酸化偶聯(lián)化學滲透學說，獲1978年諾貝爾化學獎。42.1961~64美國人M.W.Nirenberg破譯DNA遺傳密碼。43.1968瑞士人WernerArber從細菌中發(fā)覺DNA限制性內(nèi)切酶。44.1970美國人D.Baltimore、R.Dulbecco和H.Temin因為發(fā)覺在RNA腫瘤病毒中存在以RNA為模板，逆轉錄生成DNA逆轉錄酶而獲1975共享諾貝爾生理醫(yī)學獎。20細胞生物學學時第20頁45.1971美國人DanielNathans和HamiltonSmith發(fā)展了核酸酶切技術。46.1973美國人S.Cohen和H.Boyer將外源基因拼接在質粒中，并在大腸桿菌中表示，從而揭開基因工程序幕。47.1975英國人F.Sanger設計出DNA測序雙脫氧法。于1980年獲諾貝爾化學獎。另外Sanger還因為1953年測定了牛胰島素一級結構而取得1958年諾貝爾化學獎。48.1982美國人S.B.Prusiner發(fā)覺蛋白質因子Prion，更新了醫(yī)學感染概念，于1997年獲諾貝爾生理醫(yī)學獎。49.1983美國人K.B.Mullis創(chuàng)造PCR儀，1987年發(fā)表了“SpecificsynthesisofDNAinvitroviaapolymerase-catalyzedchainreaction”，于1993年獲諾貝爾化學獎。21細胞生物學學時第21頁50.1984德國人G.J.F.Kohler、阿根廷人C.Milstein和丹麥科學家N.K.Jerne因為發(fā)展了單克隆抗體技術，完善了極微量蛋白質檢測技術而分享了諾貝爾生理醫(yī)學獎。51.1989美國人S.Altman和T.R.Cech因為發(fā)覺一些RNA含有酶功效（稱為核酶)而共享諾貝爾化學獎。Bishop和Varmus因為發(fā)覺正常細胞一樣帶有原癌基因而分享當年諾貝爾生理醫(yī)學獎。

52.1997多利羊在盧斯林研究所誕生，成為世紀末重大新聞。多利是IanWilmut領導研究小組克隆。

22細胞生物學學時第22頁圖1-9多利和邦妮圖片來自http://www.ri.bbsrc.ac.uk/23細胞生物學學時第23頁細胞基本知識概要細胞基本概念

細胞大小非細胞形態(tài)生命體——病毒及其與細胞關系原核細胞與真核細胞

圖植物細胞與動物細胞24細胞生物學學時第24頁各類細胞直徑比較25細胞生物學學時第25頁細胞是生命活動基本單位一切有機體都由細胞組成，細胞是組成有機體基本單位。細胞含有獨立、有序自控代謝體系，細胞是代謝與功效基本單位。細胞是有機體生長與發(fā)育基礎。細胞是遺傳基本單位，細胞含有遺傳全能性。沒有細胞就沒有完整生命。細胞基本概念26細胞生物學學時第26頁細胞基本共性全部細胞表面都有由磷脂雙分子層與鑲嵌蛋白質組成生物膜，即細胞膜。全部細胞都含有兩種核酸：即DNA與RNA作為遺傳信息復制與轉錄載體。作為蛋白質合成機器─核糖體，毫無例外地存在于一切細胞內(nèi)。全部細胞增殖都以一分為二方式進行分裂。

27細胞生物學學時第27頁病毒基本知識

病毒（virus）——核酸分子（DNA或RNA）與蛋白質組成核酸-蛋白質復合體；依據(jù)病毒核酸類型能夠將其分為兩大類：

DNA病毒與RNA病毒

病毒多樣性）

類病毒（viroid）——僅由感染性RNA組成；比如，馬鈴薯錘管類病毒

朊病毒（prion）——僅由感染性蛋白質亞基組成；1982年S．B．Prusiner在患羊瘙癢病羊體內(nèi)發(fā)覺了一個蛋白質因子，證實是羊瘙癢病致病因子，他將其命名為PRION。Prusiner所以項重大發(fā)覺而于1997年取得諾貝爾獎。

對于蛋白質感染因子引發(fā)疾病，當前尚沒有有效治療辦法，據(jù)報道，自1996年以來，共有106人得了瘋牛病，其中僅有七人還活著。28細胞生物學學時第28頁29細胞生物學學時第29頁原核細胞與真核細胞遺傳結構裝置和基因表示比較

30細胞生物學學時第30頁31細胞生物學學時第31頁32細胞生物學學時第32頁植物細胞與動物細胞比較

細胞壁

液泡

葉綠體

33細胞生物學學時第33頁病毒與細胞在起源與進化中關系病毒是非細胞形態(tài)生命體，它主要生命活動必須要在細胞內(nèi)實現(xiàn)。病毒與細胞在起源上關系，當前存在3種主要觀點：

生物大分子→病毒→細胞 病毒

生物大分子細胞

生物大分子→細胞→病毒34細胞生物學學時第34頁細胞生物學研究方法

細胞形態(tài)結構觀察方法

細胞組分分析方法

細胞培養(yǎng)、細胞工程與顯微操作技術35細胞生物學學時第35頁細胞形態(tài)結構觀察方法

光學顯微鏡技術（lightmicroscopy）

電子顯微鏡技術(Electromicroscopy)

掃描探針顯微鏡（ScanningProbeMicroscope）

掃描遂道顯微鏡

(scanningtunnelingmicroscope)

36細胞生物學學時第36頁細胞組分分析方法

離心分離技術

細胞內(nèi)核酸、蛋白質、酶、糖與脂類等顯示方法

特異蛋白抗原定位與定性

細胞內(nèi)特異核酸定位與定性

放射自顯影技術

定量細胞化學分析技術37細胞生物學學時第37頁細胞培養(yǎng)、細胞工程與顯微操作技術

細胞培養(yǎng)

細胞工程38細胞生物學學時第38頁一、光學顯微鏡技術（lightmicroscopy)

普通復式光學顯微鏡技術

熒光顯微鏡技術（FluorescenceMicroscopy）

激光共焦掃描顯微鏡技術（LaserConfocalMicroscopy）

相差顯微鏡（phase-contrastmicroscope）

微分干涉顯微鏡（differentialinterferencecontrastmicroscope,DIC）

錄像增差顯微鏡技術（video-enhancemicroscopy）39細胞生物學學時第39頁二、電子顯微鏡技術

電子顯微鏡基本知識

電鏡與光鏡比較

電鏡與光鏡光路圖比較

電子顯微鏡基本結構

主要電鏡制樣技術

負染色技術

冰凍蝕刻技術

超薄切片技術

電鏡三維重構技術

掃描電鏡（Scanningelectronmicroscope，SEM）SPM(Scanningprobemicroscope)40細胞生物學學時第40頁三、掃描遂道顯微鏡

ScanningProbeMicroscope,SPM(80年代發(fā)展起來檢測樣品微觀結構儀器)包含：STM、AFM、磁力顯微鏡、摩擦力顯微鏡等原理：掃描探針與樣品接觸或到達很近距離時，即產(chǎn)生彼此間相互作用力，如量子力學中隧道效應（隧道電流）、原子間作用力、磁力、摩擦力等，并在計算機顯示出來，從而反應出樣品表面形貌信息、電特征或磁特征等。

裝置：掃描壓電陶瓷，迫近裝置，電子學反饋控制系統(tǒng)和數(shù)據(jù)采集、處理、顯示系統(tǒng)。

特點：（1）可對晶體或非晶體成像，無需復雜計算，且分辨本事高。（側分辨率為0.1～0.2nm，縱分辨率可達0.01nm）； （2）可實時得到樣品表面三維圖象，可測量厚度信息；（3）可在真空、大氣、液體等各種條件下工作；非破壞性測量。 （4）可連續(xù)成像，進行動態(tài)觀察

用途：納米生物學研究領域中主要工具,在原子水平上揭示樣本表面結構。41細胞生物學學時第41頁普通復式光學顯微鏡技術光鏡樣本制作顯微鏡物象是否清楚不但決定于放大倍數(shù)，還與顯微鏡分辨力（resolution）相關。分辨率是指區(qū)分開兩個質點間最小距離n=介質折射率；α=鏡口角（聚焦點對物鏡鏡口張角），N.A.=鏡口率（numericaperture）。42細胞生物學學時第42頁熒光顯微鏡技術（FluorescenceMicroscopy）

原理：

細胞中有些物質，如葉綠素等，受紫外線照射后可發(fā)熒光；另有一些物質本身雖不能發(fā)熒光，但假如用熒光染料或熒光抗體染色后，經(jīng)紫外線照射亦可發(fā)熒光，熒光顯微鏡可對這類物質進行定性和定量研究。光源為紫外光，波長較短，分辨力高于普通顯微鏡。是當前在光鏡水平用于特異蛋白質等生物大分子定性定位最有力工具。

應用

直接熒光標識技術

間接免疫熒光標識技術

43細胞生物學學時第43頁激光共焦掃描顯微鏡技術

（LaserScanningConfocalMicroscopy）

原理和應用：激光共聚焦掃描顯微鏡（laserconfocalscanningmicroscope）用激光作掃描光源，逐點、逐行、逐面快速掃描成像，掃描激光與熒光搜集共用一個物鏡，物鏡焦點即掃描激光聚焦點，也是瞬時成像物點。因為激光束波長較短，光束很細，所以共焦激光掃描顯微鏡有較高分辨力，大約是普通光學顯微鏡3倍。系統(tǒng)經(jīng)一次調(diào)焦，掃描限制在樣品一個平面內(nèi)，調(diào)焦深度不一樣時，就能夠取得樣品不一樣深度層次圖像，這些圖像信息都儲于計算機內(nèi)，經(jīng)過計算機重新組合，就能顯示細胞樣品立體結構，給出細胞內(nèi)各部分之間定量關系及各種結構線度。

激光共聚焦掃描顯微鏡既能夠用于觀察細胞形態(tài)，也能夠用于細胞內(nèi)生化成份定量分析、光密度統(tǒng)計以及細胞形態(tài)定量。

優(yōu)點：

排除焦平面以外光干擾，增強圖像反差和提升分辨率(1.4—1.7)，可重構樣品三維結構。44細胞生物學學時第44頁

相差顯微鏡（phase-contrastmicroscope）將光程差或相位差轉換成振幅差，可用于觀察活細胞

微分干涉顯微鏡（differential-interferencemicroscope）

偏振光經(jīng)合成后，使樣品中厚度上微小區(qū)分轉化成 明暗區(qū)分，增加了樣品反差且含有立體感。適于研究活細胞中較大細胞器圖

錄像增差顯微鏡技術（video-enhancemicroscopy）

計算機輔助DIC顯微鏡可在高分辨率下研究活 細胞中顆粒及細胞器運動45細胞生物學學時第45頁電鏡與光鏡比較

顯微鏡分辨本事光源透鏡真空成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可見光（400-700）紫外光（約200nm)電子束（0.01-0.9）玻璃透鏡玻璃透鏡電磁透鏡不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用樣品對光吸收形成明暗反差和顏色改變利用樣品對電子散射和透射形成明暗反差46細胞生物學學時第46頁主要電鏡制樣技術

超薄切片技術用于電鏡觀察樣本制備。通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，以環(huán)氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進方式推進樣品切片，切片厚度20-50。示意圖

負染色技術（Negativestaining）與金屬投影 染色背景，襯托出樣品精細結構

冰凍蝕刻技術（Freezeetching）（技術示意圖） 冰凍斷裂與蝕刻復型：主要用來觀察膜斷裂面蛋白質顆粒和膜表面結構。

電鏡三維重構技術 電子顯微術、電子衍射與計算機圖象處理相結合而形成含有主要應用前景一門新技術。 電鏡三維重構技術與X-射線晶體衍射技術及核磁共振分析技術相結合，是當前結構生物學（StructuralBiology）——主要碩士物大分子空間結構及其相互關系主要試驗伎倆。

47細胞生物學學時第47頁掃描電鏡

（scanningelectronmicroscope，SEM）

原理與應用：

掃描電子顯微鏡于20世紀60年代問世，用來觀察標本表面結構。工作原理是用一束極細電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級電子，次級電子多少與電子束入射角相關，也就是說與樣品表面結構相關，次級電子由探測體搜集，并在那里被閃爍器轉變?yōu)楣庑盘?，再?jīng)光電倍增管和放大器轉變?yōu)殡娦盘杹砜刂茻晒馄辽想娮邮鴱姸龋@示出與電子束同時掃描圖像。圖像為立體形象，反應了標本表面結構。為了使標本表面發(fā)射出次級電子，標本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬微粒，重金屬在電子束轟擊下發(fā)出次級電子信號。CO2臨界點干燥法預防引發(fā)樣品變形表面張力問題。圖48細胞生物學學時第48頁人類血細胞SEM照片圖片來自/49細胞生物學學時第49頁一、離心分離技術

用途：

離心是研究如細胞核、線粒體、高爾基體、溶酶體和微體等細胞器，以及各種大分子基本伎倆。普通認為，轉速為10000-25000r/min離心機稱為高速離心機；轉速超出25000r/min，離心力大于89Kｇ者稱為超速離心機。當前超速離心機最高轉速可達80000r/min，離心力超出500Kg。

差速離心（Differencialcentrifugation）：在密度均一介質中由低速到高速逐層離心，用于分離不一樣大小細胞和細胞器。

密度梯度離心：用一定介質在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)密度梯度，將細胞混懸液或勻漿置于介質頂部，經(jīng)過重力或離心力場作用使細胞分層、分離。這類分離又可分為速度沉降和等密度沉降平衡兩種。密度梯度離心慣用介質為氯化銫，蔗糖和多聚蔗糖。用于精細組分或生物大分子分離。50細胞生物學學時第50頁二、細胞內(nèi)核酸、蛋白質、酶、糖與脂類等顯示方法

原理：利用一些顯色劑與所檢測物質中一些特殊基團特異性結合特征，經(jīng)過顯色劑在細胞中定位及顏色深淺來判斷某種物質在細胞中分布和含量。1.金屬沉淀法：利用金屬化合物在反應過程中生成有色沉淀，借以識別所檢驗物質或酶活性。如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反應產(chǎn)物最終生成CoS或PbS有色沉淀，而顯示出酶活性。2.偶氮偶聯(lián)法：酚類化合物與偶氮染料結合后能夠形成耐曬染料。3.Schiff反應：細胞中醛基可使Schiff試劑中無色品紅變?yōu)榧t色。這種反應通慣用于顯示糖和脫氧核糖核酸（Feulgen反應）。51細胞生物學學時第51頁4.聯(lián)苯胺反應：過氧化酶分解H202。產(chǎn)生新生氧，后者再將無色聯(lián)苯胺氧化成聯(lián)苯胺藍，進而變成棕色化合物。5.普魯士藍反應：三價鐵與酸性亞鐵氰化鉀作用，形成普魯士藍。6.Formazane反應：顯示脫氫酶。7.“Nadi”反應：顯示細胞色素氧化酶。8.脂溶染色法：借蘇丹染料溶于脂類而使脂類顯色。9.茚三酮反應：顯示蛋白質。52細胞生物學學時第52頁三、特異蛋白抗原定位與定性免疫熒光技術：依據(jù)免疫學原理，利用抗體同特定抗原專一結合，并標上標識熒光素，反抗原進行定位測定技術?？焖?、靈敏、有特異性，但其分辨率有限。蛋白電泳(SDS與免疫印跡反應(Western-Blot)免疫電鏡技術：能有效提升樣品分辨率，在超微結構水平上研究特異蛋白抗原定位。免疫鐵蛋白技術免疫酶標技術免疫膠體金技術

應用：經(jīng)過對分泌蛋白定位，能夠確定某種蛋白分泌動態(tài)；胞內(nèi)酶研究；膜蛋白定位與骨架蛋白定位等53細胞生物學學時第53頁四、細胞內(nèi)特異核酸定位與定性光鏡水平原位雜交技術（同位素標識或熒光素標識探針）電鏡水平原位雜交技術（生物素標識探針與抗生物素抗體相連膠體金標識結合）PCR技術聚合酶鏈式反應（polymerasechainreaction，PCR）

54細胞生物學學時第54頁五、放射自顯影技術

（radioautography；autoradiography)）原理及應用：其原理是將放射性同位素（如14C和3H）標識化合物導入生物體內(nèi)，經(jīng)過一段時間后，將標本制成切片或涂片，涂上鹵化銀乳膠，經(jīng)一定時間放射性曝光，組織中放射性即可使乳膠感光。然后經(jīng)過顯影、定影處理顯示還原黑色銀顆粒，即可得知標本中標識物準確位置和數(shù)量，放射自顯影切片還可再用染料染色，這么便可在顯微鏡下對標識上放射性化合物進行定位或相對定量測定。還可實現(xiàn)對細胞內(nèi)生物大分子進行動態(tài)和追蹤研究。

圖55細胞生物學學時第55頁六．定量細胞化學分析技術

細胞顯微分光光度術（Microspectrophotometry）

利用細胞內(nèi)一些物質對特異光譜吸收，測定這些物質 （如核酸與蛋白質等）在細胞內(nèi)含量。 包含：

紫外光顯微分光光度測定法可見光顯微分光光度測定法

流式細胞儀（FlowCytometry）

主要應用：用于定量測定細胞中DNA、RNA或某一特異蛋白含量； 測定細胞群體中不一樣時相細胞數(shù)量； 從細胞群體中分離一些特異染色細胞； 分離DNA含量不一樣中期染色體。

56細胞生物學學時第56頁一、細胞培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)類型：原代培養(yǎng)細胞（primaryculturecell）繼代培養(yǎng)細胞（sub-culturecell）細胞株（cellstrain）正常二倍體，接觸抑制細胞系（cellline）亞二倍體，接觸抑制喪失植物細胞類型：

原生質體培養(yǎng)（體細胞培養(yǎng)）單倍體細胞培養(yǎng)（花藥培養(yǎng)）

57細胞生物學學時第57頁二、細胞工程細胞融合（cellfusion）與細胞雜交（cellhybridization）技術單克隆抗體（monocloneantibody）技術圖細胞顯微操作技術（micromanipulationtechnique）顯微操作技術是指在高倍復式顯微鏡下，利用顯微操作器（micrcmanipulator）進行細胞或早期胚胎操作一個方法。顯微操作技術包含細胞核移植、顯微注射、嵌合體技術、胚胎移植以及顯微切割等。細胞核移植技術已經(jīng)有幾十年歷史，Gordon等人