原子力顯微鏡

關(guān)于原子力顯微鏡第一代：光學(xué)顯微鏡16世紀(jì)末，荷蘭人Janssen發(fā)明了第一臺復(fù)式顯微鏡1665年，英國科學(xué)家羅伯特·胡克用他的顯微鏡發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞1680年，列文虎克磨制的單片顯微鏡的放大倍數(shù)將近300倍第2頁,共46頁，2024年2月25日，星期天第一代：光學(xué)顯微鏡列文虎克觀察到的“小動物”羅伯特·虎克觀察到的細(xì)胞第3頁,共46頁，2024年2月25日，星期天第一代：光學(xué)顯微鏡相較于過去兩個世紀(jì)，現(xiàn)在我們使用的普通光學(xué)顯微鏡基本上沒有什么改進(jìn)。原因：光學(xué)顯微鏡已經(jīng)達(dá)到了分辨率的極限。對于使用可見光作為光源的顯微鏡，它的分辨率極限是0.2μm。任何小于0.2μm的結(jié)構(gòu)都沒法識別出來。提高顯微鏡分辨率的途徑是設(shè)法減小光的波長，或者，用電子束來代替光。

第4頁,共46頁，2024年2月25日，星期天第二代：電子顯微鏡1938年，德國工程師MaxKnoll和ErnstRuska制造出了世界上第一臺透射電子顯微鏡（TEM）1952年，英國工程師CharlesOatley制造出了第一臺掃描電子顯微鏡（SEM）掃描式電子顯微鏡SEM透射式電子顯微鏡TEM第5頁,共46頁，2024年2月25日，星期天第二代：電子顯微鏡電子顯微鏡的分辨率可以達(dá)到納米級1.樣品處理過程復(fù)雜2.要在高真空的環(huán)境下操作第6頁,共46頁，2024年2月25日，星期天第三代：掃描探針顯微鏡

1983年，IBM公司兩位科學(xué)家GerdBinnig和HeinrichRohrer發(fā)明了掃描隧道顯微鏡（STM），但只能測導(dǎo)體和部分半導(dǎo)體

1985年，IBM公司Binning和Stanford大學(xué)的Quate研發(fā)出了原子力顯微鏡（AFM），彌補(bǔ)了STM的不足第7頁,共46頁，2024年2月25日，星期天STM基本原理

隧道效應(yīng)：量子力學(xué)認(rèn)為，即使粒子能量小于閾值能量，很多粒子沖向勢壘，一部分粒子反彈，還會有一些粒子能過去，好像有一個隧道，故名隧道效應(yīng)。隧道電流隨探針樣品間距離減小而呈指數(shù)增加．要求樣品導(dǎo)電性要好，所以只能測導(dǎo)體和部分半導(dǎo)體。第8頁,共46頁，2024年2月25日，星期天AFM基本原理AFM是在STM的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。所不同的是，它不是利用電子隧道效應(yīng)，而是利用原子之間的范德華力作用來呈現(xiàn)樣品的表面特性。吸引部分排斥部分Fpaird原子原子排斥力原子原子吸引力第9頁,共46頁，2024年2月25日，星期天AFM基本原理

（1）將一個對微弱力極敏感的微懸臂一端固定，另一端有一微小的針尖，針尖與樣品表面輕輕接觸。（2）由于針尖尖端原子與樣品表面原子間存在極微弱的力，會使懸臂產(chǎn)生微小的偏轉(zhuǎn)。（3）通過檢測出偏轉(zhuǎn)量并作用反饋控制其排斥力的恒定，就可以

獲得微懸臂對應(yīng)于掃描各點的位置變化，從而可以獲得樣品表面形貌的圖像。第10頁,共46頁，2024年2月25日，星期天儀器構(gòu)成力檢測部分位置檢測部分反饋電子系統(tǒng)壓電掃描系統(tǒng)第11頁,共46頁，2024年2月25日，星期天

壓電裝置在X，Y，Z三個方向上精確控制樣品或探針位置。

目前構(gòu)成掃描器的基質(zhì)材料主要是鈦鋯酸鉛制成的壓電陶瓷材料．壓電陶瓷有壓電效應(yīng)，即在加電壓時有收縮特性，并且收縮的程度與所加電壓成比例關(guān)系．壓電陶瓷能將1mV~1000V的電壓信號轉(zhuǎn)換成十幾分之一納米到幾微米的位移。壓電掃描系統(tǒng)壓電轉(zhuǎn)換器——將機(jī)械作用和電信號相互轉(zhuǎn)換的物理器件第12頁,共46頁，2024年2月25日，星期天力檢測部分

檢測的力是原子與原子之間的范德華力該部分是由懸臂和懸臂末端的針尖組成．微懸臂是探測樣品的直接工具，它的屬性直接關(guān)系到儀器的精密度和使用范圍。第13頁,共46頁，2024年2月25日，星期天

(1)極低的Z向彈性系數(shù)，其值為10-2~102N/m。這樣的微懸臂將極其靈敏，能夠檢測出小于1nN的微小力。(2)足夠高的固有頻率（＞10kHz），使AFM掃描時可以跟隨表面輪廓的起伏。(3)足夠小的微懸臂：其長度必須在微米尺度才能符合要求。用光束偏轉(zhuǎn)來測量懸臂的偏轉(zhuǎn)時，其靈敏度反比于懸臂的長度。

(4)足夠高的側(cè)向剛性、以便盡可能地克服由于水平方向摩擦力造成的信號干擾。

力檢測部分

對微懸臂性能的要求第14頁,共46頁，2024年2月25日，星期天

(1)理想針尖的頂端應(yīng)該是單個原子，這樣的針尖能夠靈敏地感應(yīng)出它與樣品表面之間的相互作用力。

(2)較高的縱橫比，盡可能小的曲率半徑。

(3)高的機(jī)械柔軟性，針尖掃描時，即使撞擊到樣品的表面也不會使針尖損壞。

(4)高的彈性形變，可有效地限制針尖在樣品表面上的作用力，從而減小對樣品的損害，對柔軟的生物樣品特別有利。

(5)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。力檢測部分

對針尖性能的要求第15頁,共46頁，2024年2月25日，星期天位置檢測部分當(dāng)針尖與樣品之間有了交互作用之后，會使得微懸臂擺動，產(chǎn)生微小的偏轉(zhuǎn)，位置檢測系統(tǒng)就是檢測該偏轉(zhuǎn)量的大小。懸臂偏轉(zhuǎn)的檢測有四種方法：(1)電容測量法；(2)隧道電流檢測法；(3)光學(xué)干涉測量法；(4)光束偏轉(zhuǎn)測量法；

為了得到高分辨的AFM，對檢測方式一方面要求具有納米級的靈敏度，另一方面還要求檢測時不應(yīng)該對微懸臂產(chǎn)生任何附加的作用力，避免造成信號誤差。第16頁,共46頁，2024年2月25日，星期天電容測量法

微懸臂作為構(gòu)成平行平板電容器的一塊平板之一，而另一塊平板則平行地位于微懸臂上方。微懸臂的偏轉(zhuǎn)值將通過測量該電容器的電容值的變化得到。它的垂直位移檢測精度達(dá)到0.03nm。位置檢測部分第17頁,共46頁，2024年2月25日，星期天

隧道電流檢測法

這種檢測法在微懸臂的上方設(shè)有一個隧道電極，通過測量微懸臂與隧道電極之間隧道電流的變化就可以檢測微懸臂的偏轉(zhuǎn)。位置檢測部分第18頁,共46頁，2024年2月25日，星期天

光學(xué)干涉測量法

利用光學(xué)干涉的方法來探測微懸臂共振頻率的位移(或偏振光的相移)及微懸臂偏轉(zhuǎn)的幅度。位置檢測部分第19頁,共46頁，2024年2月25日，星期天

光學(xué)偏轉(zhuǎn)測量法它在微懸臂上的頂部設(shè)置了一面微小的鏡子，通過檢測小鏡子上反射光束的偏轉(zhuǎn)就可以得到微懸臂偏轉(zhuǎn)的信息。位置檢測部分第20頁,共46頁，2024年2月25日，星期天

光學(xué)偏轉(zhuǎn)測量法二極管激光器發(fā)出的激光束經(jīng)過光學(xué)系統(tǒng)聚焦在微懸臂背面，并從微懸臂背面反射到由光電二極管構(gòu)成的光斑位置檢測器。通過光電二極管檢測光斑位置的變化，就能獲得被測樣品表面形貌的信息。目前的AFM都是采用這種檢測模式。位置檢測部分第21頁,共46頁，2024年2月25日，星期天反饋電子系統(tǒng)控制系統(tǒng)主要有兩個功能：(1)提供控制壓電轉(zhuǎn)換器X-Y方向掃描的驅(qū)動電壓；(2)在恒力模式下維持來自顯微鏡檢測環(huán)路輸入模擬信號在一恒定數(shù)值．計算機(jī)通過A/D轉(zhuǎn)換讀取比較環(huán)路電壓(即設(shè)定值與實際測量值之差)．根據(jù)電壓值不同，控制系統(tǒng)不斷地輸出相應(yīng)電壓來調(diào)節(jié)Z方向壓電傳感器的伸縮，以糾正讀入A/D轉(zhuǎn)換器的偏差，從而維持比較環(huán)路的輸出電壓恒定。

電子線路

計算機(jī)系統(tǒng)

為壓電陶瓷管提供電壓、接收位置敏感器件傳來的信號，并構(gòu)成控制針尖和樣品之間距離的反饋系統(tǒng)?！B接計算機(jī)與掃描系統(tǒng)第22頁,共46頁，2024年2月25日，星期天AFM的三種工作模式

1.接觸模式（ContactMode）

2.非接觸模式（Non-ContactMode）

3.輕敲模式（TappingMode）第23頁,共46頁，2024年2月25日，星期天接觸式工作模式

在接觸模式中，探針的針尖部分保持與樣品表面接觸，其主要作用力是庫侖排斥力。

微懸臂探針緊壓樣品表面，探針尖端和樣品做柔軟性的“實際接觸”，當(dāng)針尖輕輕掃過樣品表面時，接觸的力量引起懸臂彎曲，進(jìn)而得到樣品的表面圖形。

vanderWaalsforcecurve第24頁,共46頁，2024年2月25日，星期天接觸式工作模式的特點（1）該方式可以穩(wěn)定地獲得高分辨率試樣表面微觀形貌圖像，有可能達(dá)到原子級的測量分辨率。（2）檢測彈性模量低的軟質(zhì)試樣時，試樣表層在針尖力的作用下會產(chǎn)生變形，甚至劃傷，這將使測出的表面形貌圖像出現(xiàn)假象。（3）針尖和試樣接觸并滑行，容易使探針尖磨損甚至損壞。第25頁,共46頁，2024年2月25日，星期天非接觸式工作模式

針尖在樣品表面的上方振動，始終不與樣品接觸，測量的作用力是以范德華力為主的吸引力。

探針回到當(dāng)前行掃描的開始點，增加探針與樣品之間的距離，根據(jù)第一次掃描得到的樣品形貌，始終保持探針與樣品之間的距離，進(jìn)行第二次掃描。在這個階段，可以通過探針懸臂振動的振幅和相位的變化，得到相應(yīng)的長程力的圖像。vanderWaalsforcecurve范德華吸引力第26頁,共46頁，2024年2月25日，星期天非接觸式工作模式的特點（1）探針和試樣不接觸，針尖測量時不會使試樣表面變形，適用于彈性模量低的試樣。（2）因針尖和試樣不接觸，測量不受毛細(xì)力的影響，同時針尖也不易磨損。（3）非接觸掃描測量模式測量靈敏度要低些。第27頁,共46頁，2024年2月25日，星期天輕敲工作模式

一個外加的振蕩信號驅(qū)動微懸臂在其共振頻率附近做受迫振動，振蕩的針尖輕輕的敲擊表面，間斷地和樣品接觸。

用處于共振狀態(tài)、上下振蕩的微懸臂探針對樣品表面進(jìn)行掃描，樣品表面起伏使微懸臂探針的振幅產(chǎn)生相應(yīng)變化，從而得到樣品的表面形貌。vanderWaalsforcecurve第28頁,共46頁，2024年2月25日，星期天輕敲工作模式的特點（1）輕敲模式的分辨率和接觸模式一樣好。（2）對于一些與基底結(jié)合不牢固的樣品，輕敲模式與接觸模式相比，很大程度地降低了針尖對表面結(jié)構(gòu)的“搬運(yùn)效應(yīng)”。（3）樣品表面起伏較大的大型掃描比非接觸式的更有效。（4）較軟及粘性較大的樣品，應(yīng)盡量選擇輕敲模式。第29頁,共46頁，2024年2月25日，星期天AFM假象

在所有顯微學(xué)技術(shù)中，AFM圖像的解釋相對來說是容易的。光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡成像都受電磁衍射的影響，這給它們辨別三維結(jié)構(gòu)帶來困難．AFM可以彌補(bǔ)這些不足，在AFM圖像中峰和谷明晰可見．AFM的另一優(yōu)點是光或電對它成像基本沒有影響，AFM能測得表面的真實形貌．盡管AFM成像簡單，AFM本身也有假象存在．相對來說，AFM的假象比較容易驗證．下面介紹一些假象情況：第30頁,共46頁，2024年2月25日，星期天

1.針尖成像：AFM中大多數(shù)假象源于針尖成像．針尖比樣品尖銳時，樣品特征就能很好地顯現(xiàn)出來。相反，當(dāng)樣品比針尖更尖時，假象就會出現(xiàn)，這時成像主要為針尖特征．高表面率的針尖可以減少這種假象發(fā)生．AFM假象第31頁,共46頁，2024年2月25日，星期天

2.鈍的或污染的針尖產(chǎn)生假象：當(dāng)針尖污染或有磨損時，所獲圖像有時是針尖的磨損形狀或污染物的形狀．這種假象的特征是整幅圖像都有同樣的特征。AFM假象第32頁,共46頁，2024年2月25日，星期天

3.雙針尖或多針尖假象：這種假象是由于一個探針末端帶有兩個或多個尖點所致．當(dāng)掃描樣品時，多個針尖依次掃描樣品而得到重復(fù)圖像。AFM假象第33頁,共46頁，2024年2月25日，星期天

4.樣品上污物引起的假象：當(dāng)樣品上的污物與基底吸附不牢時，污物可能被正在掃描的針尖帶走．并隨針尖運(yùn)動，致使大面積圖像模糊不清。AFM假象第34頁,共46頁，2024年2月25日，星期天

5.樣品-針尖間的作用力太?。禾结槻荒茼樌貟呙铇悠范霈F(xiàn)橫向拉伸現(xiàn)象。此時可以通過調(diào)節(jié)振幅衰減量來調(diào)節(jié)作用力。AFM假象第35頁,共46頁，2024年2月25日，星期天在核酸研究中的應(yīng)用（1）對DNA分子的成像及其自組裝研究

1992年，Bustamante等利用AFM得到分辨率達(dá)分子級水平的可重復(fù)質(zhì)粒DNA圖像，并可估算分子寬度和高度，這是原子力顯微鏡研究生物大分子的一項重大突破。第36頁,共46頁，2024年2月25日，星期天（2）AFM不僅可以研究整個復(fù)合物分子立體結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象，同時還可以利用某些特殊抗體蛋白或RNA分子在緩沖體系中與DNA相互作用過程中重要結(jié)構(gòu)參數(shù)變化來探究DNA區(qū)域分子構(gòu)型，這是DNA研究的一個熱點。（3）利用AFM可以控制生物大分子，調(diào)整生命的遺傳與死亡規(guī)律，也可以在納米尺度內(nèi)將染色體的單拷貝基因復(fù)制擴(kuò)增，切割剔除異常的堿基對，引起病理變化的逆轉(zhuǎn)。在核酸研究中的應(yīng)用第37頁,共46頁，2024年2月25日，星期天在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用

⑴在蛋白質(zhì)單分子外形上的應(yīng)用

如在質(zhì)子泵和離子泵研究上的應(yīng)用；在與光合作用相關(guān)蛋白質(zhì)研究方面的應(yīng)用等。

⑵在蛋白質(zhì)表面物理特性研究上的應(yīng)用

如對蛋白質(zhì)表面的粘彈性的研究；蛋白質(zhì)靜電特性的測量。⑶對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究

如對蛋白質(zhì)的抗體標(biāo)記或酶消化的鑒定；多肽末端移除的鑒定和多肽環(huán)置換或移出的鑒定等。第38頁,共46頁，2024年2月25日，星期天

⑷在蛋白質(zhì)的功能特性方面的應(yīng)用

例如，Daniel等應(yīng)用AFM在納米分辨率上顯示了膜蛋白的時間依賴性構(gòu)象變化及聚集運(yùn)動，成為經(jīng)典的研究方法。⑸對蛋白質(zhì)單分子操縱

人們通過AFM操縱可以直接檢測到該結(jié)構(gòu)域的力學(xué)穩(wěn)定性。AFM成像與操縱的聯(lián)合使其能夠宏觀地從單分子尺度上對生物系統(tǒng)進(jìn)行精確和可控的修飾和研究。在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用第39頁,共46頁，2024年2月25日，星期天活細(xì)胞與微生物結(jié)構(gòu)動態(tài)研究中應(yīng)用(1)細(xì)胞或各種微生物表面結(jié)構(gòu)成像

AFM現(xiàn)已廣泛用于觀察各種細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)，如血紅細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、上皮細(xì)胞等。(2)對細(xì)胞間的相互作用進(jìn)行觀察

例如可研究動物胚胎移植中細(xì)胞的免疫排斥反應(yīng)，病變細(xì)胞與健康細(xì)胞間的相互作用等。(3)識別正常細(xì)胞和癌細(xì)胞

AFM會賦予一個表明細(xì)胞柔軟度的數(shù)值。研究人員發(fā)現(xiàn)，盡管正常細(xì)胞的硬度各有不同，但癌細(xì)胞比正常細(xì)胞要柔軟得多。第40頁,共46頁，2024年2月25日，星期天AFM與其他技術(shù)聯(lián)用（1）AFM與其他顯微鏡技術(shù)的聯(lián)用①AFM與熒光共聚焦顯微術(shù)結(jié)