生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座

第十三章

生化藥品和基因工程藥品分析概念生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第1頁1、了解生化藥品、基因工程藥品定義、種類。2、熟悉質(zhì)量檢驗(yàn)基本程序與方法。3、掌握生化藥品、基因工程藥品特點(diǎn)及慣用化學(xué)定量分析方法。本章學(xué)習(xí)關(guān)鍵點(diǎn)生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第2頁人類用于預(yù)防、治療和診療疾病三大主要藥品第一節(jié)概述化學(xué)藥品生物藥品中藥生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第3頁生物藥品定義：利用生物體、生物組織或器官等成份，綜合利用生物學(xué)、生物化學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)、物理化學(xué)和藥學(xué)原理與方法制得一大類藥品。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第4頁生物藥品分類：生化藥品生物技術(shù)藥品生物制品從生物體分離純化制得生化基本物質(zhì)，以及用化學(xué)合成、微生物合成或當(dāng)代生物技術(shù)制得一類藥品。利用生物體或其組成部分發(fā)展產(chǎn)品技術(shù)體系即當(dāng)代生物技術(shù)研制藥品稱之。應(yīng)用普通或基因工程、細(xì)胞工程、蛋白質(zhì)工程、發(fā)酵工程等生物技術(shù)取得微生物、細(xì)胞及各種動物和人源組織和體液等生物材料制備，用于人類疾病預(yù)防、治療和診療藥品。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第5頁一、生化藥品和基因工程藥品定義1、生化藥品定義從動物、植物及微生物提取，也可用生物－化學(xué)半合成或用當(dāng)代生物技術(shù)制得生命基本物質(zhì)及其衍生物、降解物以及大分子結(jié)構(gòu)修飾物等。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第6頁2、基因工程藥品定義先確定對某種疾病含有預(yù)防和治療作用蛋白質(zhì)，然后將控制該蛋白質(zhì)合成過程基因進(jìn)行分離、純化或人工合成，利用重組DNA技術(shù)加以改造，最終將該基因?qū)肽軌虼罅可a(chǎn)受體細(xì)胞中不停繁殖或表示，并能進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)含有預(yù)防和治療這種疾病蛋白質(zhì)，經(jīng)過這種方法生產(chǎn)藥品稱之。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第7頁1、氨基酸、多肽與蛋白質(zhì)類藥品二、生化藥品和基因工程藥品種類（一）生化藥品種類（1）氨基酸及其衍生物：①單氨基酸：亮氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、色氨酸、賴氨酸、甘氨酸等。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第8頁②氨基酸衍生物：N-乙酰-L-半胱氨酸、S-氨基甲酰半胱氨酸、S-甲基半胱氨酸、谷胺酰胺、S-羥色氨酸。③復(fù)合氨基酸注射液：3S、6S、9S、11S、13S、14S、15S、17S、18S復(fù)合氨基酸注射液。（S代表氨基酸種類）生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第9頁（2）多肽類藥品：①垂體多肽：促腎上腺皮質(zhì)激素、促胃液素、加壓素。②消化道多肽：促胰液素（胰泌素）、胃泌素、抑胃肽。③下丘腦多肽：促甲狀腺素釋放激素、促性腺激素釋放激素、生長激素釋放激素。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第10頁④腦多肽：由人及動物腦和腦脊液中分離出來多肽、蛋氨酸腦啡肽和亮氨酸腦啡肽等。⑤激肽類：血管擔(dān)心肽I、II、III等活性肽。⑥其它肽類：谷脫甘肽、降鈣素、睡眠肽、松果肽、血活素（分子量為3000肽為主成份)。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第11頁（3）蛋白類藥品豬或牛纖維蛋白原、纖維蛋白、胃膜素（糖蛋白）、水蛭素、肝細(xì)胞生長因子；屬蛋白質(zhì)類激素還有生長素、催乳素、促甲狀腺素、促泡激素（FSH）、促黃體激素（LH）；植物起源蛋白類藥品有植物凝集素、天花粉蛋白、蓖麻和相思豆毒蛋白等。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第12頁2、酶類藥品（1）助消化酶類：胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰淀粉酶、麥芽淀粉酶。（2）蛋白水解酶類：溶菌酶、胰DNA酶、木瓜蛋白酶、膠原蛋白酶。（3）凝血酶及抗栓酶：凝血酶（豬、牛血）、纖溶酶、尿激酶、蛇毒凝血酶。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第13頁（4）抗腫瘤酶類：L-天門冬酰胺酶、甲硫氨酸酶、組氨酸酶、谷氨酸胺酶。（5）其它酶類：細(xì)胞色素C、超氧化物歧化酶（SOD）、RNA酶、青霉素酶。（6）輔酶：CoA、黃素單核苷酸（FMN）、黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）。

生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第14頁3、多糖類藥品（1）肝素、硫酸軟骨素A和C、硫酸皮膚素（硫酸軟骨素B）、硫酸角質(zhì)素、透明質(zhì)酸等。（2）類肝素（酸性粘多糖）、鹿茸多糖、殼聚多糖、右旋糖苷、靈芝多糖、豬苓多糖、人參多糖、黃芪多糖等。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第15頁4、脂質(zhì)類藥品卵磷脂、腦磷脂、膽固醇、麥角固醇、B谷固醇、膽汁酸（膽酸與甘氨酸或牛黃酸結(jié)合物）、鵝脫氧膽酸、膽紅素、原葉琳、血葉琳、亞油酸、花生四烯酸、五-六烯酸、前列腺素系列（PGE1、PGE2、PGE2a和PG12）。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第16頁5、核酸類藥品RNA（包含iRNA-免疫核糖核酸）、DNA（脫氧核糖核酸）、聚肌苷酸、巰基聚胞苷酸、cAMP、AMP、肌苷。另外，有核酪制劑，6-巰基嘌呤、6-硫代嘌呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、5-碘苷和無環(huán)鳥苷等。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第17頁二、基因工程工藥品種類1、激素類及神經(jīng)遞質(zhì)類藥品（1）人生長激素釋放抑制因子（2）人胰島素（3）人生長激素2、細(xì)胞因子類藥品（1）人干擾素生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第18頁（2）人白細(xì)胞介素（3）集落刺激因子（4）促紅細(xì)胞生長素3、酶類及凝血因子類藥品單克隆抗體、疫苗、基因治療藥品、白介素、生長因子、反義藥品、腫瘤壞死因子等。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第19頁1、共同特點(diǎn)：含有一定生物活性或生理功效，能夠參加、影響和調(diào)控人體代謝和生理功效，對于一些疾病治療含有針對性強(qiáng)、毒副作用小、易為人體所吸收等特點(diǎn)。三、生化藥品和基因工程藥品特點(diǎn)生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第20頁2、分子量不是定值除氨基酸、核苷酸、輔酶及甾體激素等屬化學(xué)結(jié)構(gòu)明確小分子化合物外，大部分為大分子物質(zhì)，其分子量普通幾千至幾十萬。對大分子藥品而言，即使組分相同，往往因?yàn)榉肿恿坎灰粯佣a(chǎn)生不一樣生理活性。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第21頁

3、結(jié)構(gòu)確證難在這類藥品中，因?yàn)橛行ЫY(jié)構(gòu)或分子量不確定，其結(jié)構(gòu)確實(shí)證極難沿用元素分析、IR、UV、NMR、MS等方法加以證實(shí)，往往還要用生化法如氨基酸序列等法加以證實(shí)。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第22頁4、全過程質(zhì)量控制這類藥品對熱、酸、堿、重金屬以及pH較敏感，需對原材料、生產(chǎn)過程和最終產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量控制。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第23頁5、生物活性檢驗(yàn)在制備多肽或蛋白質(zhì)類藥品時，有時因工藝條件改變，造成蛋白質(zhì)失活。所以，除了用通常采取理化法檢驗(yàn)外：尚需用生物檢定法進(jìn)行檢定，以證實(shí)藥品生物活性。

生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第24頁6、安全性檢驗(yàn)因?yàn)檫@類藥品性質(zhì)特殊，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，易引入特殊雜質(zhì)和污染物，故常需做安全性檢驗(yàn)。7、效價測定對酶類藥品需進(jìn)行效價測定或酶活力測定，以表明其有效成份含量高低。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第25頁第二節(jié)質(zhì)量檢驗(yàn)基本程序與方法

一、判別試驗(yàn)（一）理化判別法利用化學(xué)法、物理法及生物學(xué)方法來確證生化藥品真?zhèn)?。用?biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌吩谕粭l件下進(jìn)行對照試驗(yàn)。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第26頁1、化學(xué)反應(yīng)法通常利用藥品與某試劑在一定條件下反應(yīng)，生成有顏色產(chǎn)物或沉淀進(jìn)行判別。比如，溶菌酶判別采取呈色法；胃蛋白酶判別采取沉淀法。2、HPLC法生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第27頁3、UV法三磷酸腺苷二鈉分子中含有共軛系統(tǒng)，能吸收紫外光。本品0.01mol／L鹽酸水溶液（20μg／ml），在（257±1）nm波優(yōu)點(diǎn)有最大吸收。A250nm／A260nm值應(yīng)為0.17～0.27。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第28頁（二）生化判別法

1、酶法：尿激酶是專屬性較強(qiáng)蛋白水解酶，依據(jù)尿激酶能激活牛纖維蛋白溶酶原，而含有相同作用鏈激酶不能激活牛纖維蛋白溶酶原而加以區(qū)分，并用直接觀察溶解纖維蛋白作用氣泡上升法作為判斷指標(biāo)。

生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第29頁2、電泳法肝素判別采取糖凝膠電泳法：肝素是由D-硫酸氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸分子間組成酸性粘多糖，其水溶液帶強(qiáng)負(fù)電荷，于瓊脂凝膠板上，在電場作用下，向正極方向移動，與肝素國家標(biāo)準(zhǔn)品對照，其移動位置應(yīng)相一致。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第30頁3、樣品脫鹽后等電點(diǎn)聚焦法測定測定藥品等電點(diǎn)（為出現(xiàn)多條區(qū)帶多個等電點(diǎn)），同批次同一產(chǎn)品等電點(diǎn)應(yīng)相同，表明其工藝穩(wěn)定。（三）生物判別法：利用生物體進(jìn)行試驗(yàn)來判別藥品。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第31頁二、雜質(zhì)檢驗(yàn)（一）普通雜質(zhì)檢驗(yàn)檢驗(yàn)項(xiàng)目包含氯化物、硫酸鹽、磷酸鹽、銨鹽、鐵鹽、重金屬、酸度、溶液澄清度或溶液顏色、水分及干燥失重、熾灼殘?jiān)?。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第32頁（二）特殊雜質(zhì)檢驗(yàn)許多藥品是從生物組織中提取或用微生物發(fā)酵法制得，藥品中易殘余一些雜質(zhì)或其它成份。1、原料藥純度分析2、生產(chǎn)過程中雜質(zhì)檢驗(yàn)生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第33頁三、安全性檢驗(yàn)（一）熱原檢驗(yàn)法（家兔、鱟試劑）（二）異常毒性試驗(yàn)：用一定劑量藥品按指定操作方法和給藥路徑給予要求體重某種試驗(yàn)動物，觀察其急性毒性反應(yīng)。反應(yīng)判斷以試驗(yàn)動物死亡是否為終點(diǎn)。

生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第34頁（三）過敏試驗(yàn)（檢驗(yàn)異性蛋白）藥品中若夾雜有異性蛋白，在臨床使用時易引發(fā)病人各種過敏反應(yīng)，輕者皮膚出現(xiàn)紅斑或丘疹，嚴(yán)重者可出現(xiàn)窒息、發(fā)結(jié)、血管神經(jīng)性水腫、血壓下降，甚至休克和死亡。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第35頁（四）降壓物質(zhì)檢驗(yàn)法降壓物質(zhì)是指一些藥品中含有能造成血壓降低雜質(zhì)，包含組胺、類組胺或其它造成血壓降低物質(zhì)。起源：用動物臟器或組織為原料制備生化藥品，正常組織內(nèi)存在組胺及部分氨基酸脫羧形成組胺、酪胺等膠類物質(zhì)。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第36頁（五）無菌檢驗(yàn)法（檢驗(yàn)活菌）因?yàn)樵S多藥品是在無菌條件下制備，且不能高溫滅菌。所以，無菌檢驗(yàn)就更有必要。中國藥典中幾乎全部注射用藥如注射用尿激酶等，均做無菌檢驗(yàn)。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第37頁1、無菌檢驗(yàn)基本步驟：①培養(yǎng)基制備，為細(xì)菌生長、繁殖提供所必需營養(yǎng)物質(zhì)─碳源、氮源、維生素、礦物質(zhì)等。②選擇對照用菌液，供對照試驗(yàn)用。③詳細(xì)檢驗(yàn)，如接種、培養(yǎng)等操作。④結(jié)果判斷，得出陰性或陽性結(jié)論。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第38頁2、注意事項(xiàng)：①無菌檢驗(yàn)全部過程應(yīng)嚴(yán)格恪守?zé)o菌操作法，包含對操作環(huán)境、試驗(yàn)材料及用具酶滅菌等，預(yù)防微生物污染。②應(yīng)防止在有抑菌條件下操作。③從事無菌操作人員應(yīng)具備微生物學(xué)基礎(chǔ)知識及一定工作經(jīng)驗(yàn)，不然要經(jīng)過無菌技能培訓(xùn)，方能從事此工作。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第39頁（六）基因工程藥品中可能雜質(zhì)與污染物檢驗(yàn)可能雜質(zhì)：殘留DNA、宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、內(nèi)毒素等；主要污染物：微生物、熱原、病毒等。主要檢驗(yàn)項(xiàng)目：外源性DNA、其它外源性雜質(zhì)測定生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第40頁（七）致突變試驗(yàn)包含：微生物回復(fù)突變試驗(yàn)、哺乳動物培養(yǎng)細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)、嚙齒動物微核試驗(yàn)等。（八）生殖毒性試驗(yàn)包含：普通生殖毒性試驗(yàn)、圍生期毒性試驗(yàn)。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第41頁四、含量（效價）測定含量表示方法百分含量，適合用于結(jié)構(gòu)明確小分子藥品或經(jīng)水解后變成小分子藥品。生物效價或酶活力，適合用于酶類、蛋白質(zhì)類等藥品。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第42頁（一）含量測定1、HPLC法2、SDS法（二）效價測定：采取國際或國家參考品，或經(jīng)國家檢定機(jī)構(gòu)認(rèn)可參考品，以體內(nèi)或體外法測定其生物學(xué)活性，并標(biāo)明其活性單位。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第43頁第三節(jié)慣用定量分析方法及其應(yīng)用一、理化法（一）化學(xué)分析法1、重量法：依據(jù)樣品中分離出單質(zhì)或化合物重量測定所含成份含量。（1）提取法（2）揮發(fā)法（3）沉淀法生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第44頁（二）電化學(xué)分析法

離子選擇性電極：測量離子活度指示電極。

2、滴定分析法：依據(jù)樣品中一些成份與標(biāo)準(zhǔn)溶液能定量地發(fā)生酸堿中和、氧化還原或絡(luò)合反應(yīng)等進(jìn)行測定。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第45頁（三）光譜分析法1、比色法：樣品與顯色劑可發(fā)生顏色反應(yīng)，依顏色反應(yīng)強(qiáng)度測定含量。如蛋白質(zhì)含量測定，可利用蛋白質(zhì)與雙縮脲試劑發(fā)生顏色反應(yīng)，而進(jìn)行定量測定。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第46頁2、UV法：樣品或轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物在某一波優(yōu)點(diǎn)有最大吸收，在一定濃度范圍內(nèi)，其濃度與吸收度成正比，則可進(jìn)行定量測定。如蛋白質(zhì)在280nm左右有最大吸收

。3、熒光分光光度法：依據(jù)物質(zhì)被UV光照射后產(chǎn)生熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量測定。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第47頁（四）色譜分析法1、HPLC法（1）RP-HPLC法：適合用于肽類、氨基酸、蛋白質(zhì)和多糖測定，如生白能。固定相：C8、C18烷基硅烷鍵合相流動相：甲醇-水、乙腈-水（甲醇）、乙腈-緩沖液生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第48頁（2）高效離子交換色譜法（HPIEC）HPIEC特點(diǎn)以下：①蛋白質(zhì)、多肽分離是依據(jù)其對應(yīng)離子化程度而進(jìn)行。②分離過程是以鹽濃度增大梯度洗脫法進(jìn)行③柱效中等并具較高質(zhì)量活性回收。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第49頁（3）高效凝膠過濾色譜法（HPGFC）HPGFC特點(diǎn)以下：①活性蛋白質(zhì)可得以回收。②分離是在固定百分比水溶液中進(jìn)行。③分離是依據(jù)蛋白質(zhì)或多肽在溶液中對應(yīng)有效粒徑而進(jìn)行。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第50頁2、高效毛細(xì)管電泳法（HPCE）HPCE是依據(jù)帶電組分在管中因?yàn)槠渌鶐щ姾珊头肿恿看笮?，即荷質(zhì)比不一樣產(chǎn)生不一樣遷移速度而分離。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第51頁類型酶活力測定法：以酶為分析對象，測定樣品中某種酶活力或活性，并用活力單位和比活性表示

。酶分析法：以酶為分析工具或分析試劑，測定樣品中酶以外其它物質(zhì)含量。二、酶法生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第52頁（一）酶活力測定法1、定義：酶活力是指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)能力。酶活力測定實(shí)際上是測定一個被酶所催化化學(xué)反應(yīng)速度─能夠用單位時間反應(yīng)底物降低或產(chǎn)物增加來表示。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第53頁2、方法（1）終點(diǎn)法：在適當(dāng)條件下，把酶和底物混合，測定生成一定量產(chǎn)物所需時間。（2）將酶和底物混合后隔一定時間，間斷地或連續(xù)地測定反應(yīng)連續(xù)改變。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第54頁（3）將酶與底物混合后，讓其反應(yīng)一定時間，然后停頓反應(yīng)，定量測定底物降低或產(chǎn)物生成量。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第55頁（二）酶分析法1、動力學(xué)分析法：

經(jīng)過條件控制，分別使底物、輔酶活化劑或抑制劑濃度在酶反應(yīng)中起決定反應(yīng)速度主導(dǎo)作用。則酶反應(yīng)速度和上述對應(yīng)原因濃度間將含有確定百分比關(guān)系，經(jīng)過測定酶反應(yīng)速度即可求出它們濃度。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第56頁2、總變量分析法（平衡法或終點(diǎn)法）：

依據(jù)被測物質(zhì)（底物）性質(zhì)，選擇適宜分析工具酶對該物質(zhì)進(jìn)行作用，在反應(yīng)完成后，借助理化方法測出其總改變量，并參考反應(yīng)平衡點(diǎn)，計(jì)算出被測物實(shí)際含量或濃度。生化藥物和基因工程藥物分析概念專家講座第57頁三、電泳法（一）基本原理電泳法是指帶電微粒如蛋白質(zhì)、核苷酸、其它微粒分子或離子在電場作用下，向其對應(yīng)電極方向按各自速度泳動而使