基因工程制藥新版

基因工程制藥新版基因工程制藥新版第1頁(yè)血紅蛋白基因血紅蛋白基因排列次序血紅蛋白結(jié)構(gòu)血紅蛋白運(yùn)輸氧氣功效血紅蛋白基因工程流程基因工程制藥新版第2頁(yè)一、工具酶分離純化（一）基因工程制藥所用到工具酶

（二）關(guān)于限制酶（三）關(guān)于連接酶

基因工程制藥新版第3頁(yè)（一）基因工程制藥所用到工具酶限制性內(nèi)切酶 甲基化酶Klenow聚合酶

T4-DNA聚合酶T4-多核苷酸激酶 堿性磷酸酶核酸酶-S1 核酸酶-Bal31綠豆核酸酶 核糖核酸酶人外切核酸酶 DNA酶-1外切RNA酶-III 外切RNA酶-VIDNA聚合酶1

T4-DNA連接酶末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 T4-RNA連接酶逆轉(zhuǎn)錄酶大腸桿菌-DNA連接酶

基因工程制藥新版第4頁(yè)（二）關(guān)于限制酶1、宿主限制現(xiàn)象2、限制酶定義3、限制酶特征4、限制酶作用5、基因工程所用到限制酶6、影響限制酶作用原因

基因工程制藥新版第5頁(yè)1、宿主限制現(xiàn)象

病毒或噬菌體在宿主A細(xì)胞中生長(zhǎng)良好,但在宿主B細(xì)胞中生長(zhǎng)很差,原因是它DNA受到宿主B限制,這種現(xiàn)象是宿主控制性限制（restriction）與修飾(modification),簡(jiǎn)稱（R/M體系）。細(xì)菌R/M體系類似于免疫系統(tǒng)，能區(qū)分本身DNA與外來(lái)DNA，并能使后者降解掉。基因工程制藥新版第6頁(yè)R/M體系：是由兩種酶活性配合完成：一個(gè)是修飾甲基轉(zhuǎn)移酶另一個(gè)是核酸內(nèi)切限制酶基因工程制藥新版第7頁(yè)E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶※當(dāng)λ(k)噬菌體侵染E.coliB時(shí)，因?yàn)槠銬NA中有EcoB核酸酶特異識(shí)別堿基序列，被降解掉。而E.coliBDNA中即使也存在這種特異序列，但可在EcoB甲基化酶作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）將甲基轉(zhuǎn)移給限制酶識(shí)別序列特定堿基，使之甲基化。

※EcoB(大腸桿菌B株)核酸酶不能識(shí)別已甲基化序列?；蚬こ讨扑幮掳娴?頁(yè)

R/M體系作用：保護(hù)本身DNA不受限制；破壞外源DNA使之快速降解TGAN8TGCTACTN8ACGATGAN8TGCTACTN8ACGAECOB核酸酶甲基化酶CH3CH3CH3CH3噬菌體起源序列宿主起源序列基因工程制藥新版第9頁(yè)※限制性內(nèi)切酶本是微生物細(xì)胞中用于專門水解外源ＤＮＡ一類酶，其功效是防止外源ＤＮＡ干擾或噬菌體感染，是細(xì)胞中一個(gè)防御機(jī)制。※因?yàn)镽/M現(xiàn)象發(fā)覺使得核酸內(nèi)切酶成為基因工程主要工具酶。基因工程制藥新版第10頁(yè)2、限制酶定義

凡是能夠識(shí)別和切割DNA分子內(nèi)特定核苷酸次序酶稱為限制酶。限制酶分為三個(gè)類型：（1）Ⅰ型限制酶-----因?yàn)槠淝悬c(diǎn)不固定，極難形成特異性切割末端。（2）Ⅱ型限制酶-----是位點(diǎn)特異性酶，是基因工程理想工具酶。（3）Ⅲ型限制酶-----對(duì)DNA識(shí)別與切割點(diǎn)不一樣，不產(chǎn)生特異性DNA片段。基因工程制藥新版第11頁(yè)3、限制酶特征

含有專一性識(shí)別位點(diǎn)。能夠形成固定核苷酸單鏈末端。比較適合于進(jìn)行DNA結(jié)構(gòu)分析和進(jìn)行基因重組。基因工程制藥新版第12頁(yè)4、限制酶作用（1）進(jìn)行DNA重組。（2）構(gòu)建新載體。（3）構(gòu)建基因文庫(kù)。（4）進(jìn)行DNA序列分析。（5）制備DNA放射性探針?；蚬こ讨扑幮掳娴?3頁(yè)5、基因工程所用到限制酶通常是Ⅱ型限制酶，詳細(xì)有以下幾個(gè)。EcoR-I

Hind-III

BamH-IPst-I Sst-I Sal-IAva-I Bcl-I Hind-IIHpa-I Bgl-II Cla-IHae-III Hha-I Hinf-IHpa-II Mbo-I Sma-IXba-I

Xho-I基因工程制藥新版第14頁(yè)6、影響限制酶作用原因（1）DNA純度（2）DNA甲基化程度（3）DNA結(jié)構(gòu)（4）反應(yīng)溫度----最適溫度為37度（5）反應(yīng)緩沖體系----反應(yīng)體系中通常含有MgCl2、NaCl、KCl、β-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、牛血清白蛋白。它們含有激活酶、穩(wěn)定酶作用?；蚬こ讨扑幮掳娴?5頁(yè)（三）關(guān)于連接酶1、定義----凡是能夠催化DNA片段5’-末端磷酰基與3’-末端羥基結(jié)合成磷酸二酯鍵酶，稱為連接酶。2、作用----主要用于

（1）正常DNA合成。

（2）損傷DNA修復(fù)。3、種類

（1）DNA-連接酶----廣泛存在于生物細(xì)胞之中，主要取自于大腸桿菌E.coli。

（2）T4-DNA連接酶----來(lái)自于經(jīng)過T4-噬菌體感染大腸桿菌E.coli。（3T4-RNA連接酶----催化單鏈DNA或RNA5‘磷酸與另一單鏈DNA或RNA3’羥基之間形成共價(jià)連接。基因工程制藥新版第16頁(yè)二、基因工程載體分離純化（一）定義（二）基因工程載體必備條件（三）基因工程載體種類

基因工程制藥新版第17頁(yè)（一）定義

能夠?qū)⒛繕?biāo)基因攜帶進(jìn)宿主細(xì)胞、并可使得目標(biāo)基因能夠在宿主體內(nèi)進(jìn)行自主性復(fù)制遺傳因子，稱為基因工程載體。

基因工程制藥新版第18頁(yè)（二）基因工程載體必備條件

（1）含有有效運(yùn)載能力。

（2）載體本身能夠獨(dú)立復(fù)制，而且在宿主體內(nèi)進(jìn)行自主性復(fù)制。

（3）載體在攜帶目標(biāo)基因之后，還能夠在宿主體內(nèi)進(jìn)行自主性復(fù)制。

（4）在宿主體內(nèi)，能夠控制外源基因表示活動(dòng)。

（5）能夠攜帶大小不一樣外源性目標(biāo)基因。

（6）判定方便、裝卸技術(shù)簡(jiǎn)單。

（7）輕易控制、安全可靠。

基因工程制藥新版第19頁(yè)

（8）應(yīng)含有靈活克隆位點(diǎn)、而且有方便篩選標(biāo)識(shí)。

（9）應(yīng)含有很強(qiáng)開啟子。

（10）應(yīng)含有阻遏子，使開啟子受到控制，因?yàn)橥庠椿蚋咝П硎緯?huì)抑制宿主細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖，而阻遏子可使宿主細(xì)胞免受這種影響。

（11）應(yīng)含有很強(qiáng)終止子，方便重點(diǎn)克隆外源基因區(qū)段，而不轉(zhuǎn)錄其它無(wú)關(guān)基因。

（12）所產(chǎn)生mRNA必須含有翻譯起始信號(hào)，即含有起始密碼AUG和SD序列，方便轉(zhuǎn)錄之后能夠順利于進(jìn)行翻譯?；蚬こ讨扑幮掳娴?0頁(yè)（三）基因工程載體種類1、細(xì)菌質(zhì)粒2、真核基因病毒DNA3、λ噬菌體DNA4、單鏈DNA噬菌體M13載體5、人工質(zhì)粒載體----科斯質(zhì)粒6、酵母人工染色體7、其它載體

基因工程制藥新版第21頁(yè)1、細(xì)菌質(zhì)粒（1）質(zhì)粒定義（2）質(zhì)粒特征（3）質(zhì)粒分類（4）質(zhì)粒載體具備條件（5）常見細(xì)菌質(zhì)粒

基因工程制藥新版第22頁(yè)（1）質(zhì)粒定義

存在于天然細(xì)菌體內(nèi)一個(gè)獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外雙鏈環(huán)狀DNA，含有獨(dú)立復(fù)制能力，常帶有細(xì)菌抗藥基因。也存在于一些真核細(xì)胞（酵母2μ環(huán)狀質(zhì)粒）質(zhì)粒載體(plasmid)基因工程制藥新版第23頁(yè)（2）質(zhì)粒特征

獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外環(huán)狀DNA或RNA。其遺傳特征屬于非染色體控制。能夠進(jìn)行自我復(fù)制。輕易在宿主體內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)移和遷移?？删幋a宿主染色體所不含有基因。能夠賦予宿主額外遺傳特征：

A、編碼產(chǎn)生抗生素酶抗性基因，

B、編碼產(chǎn)生糖酵解酶系基因，

C、編碼產(chǎn)生抗重金屬酶抗性基因?；蚬こ讨扑幮掳娴?4頁(yè)質(zhì)粒復(fù)制類型

◆嚴(yán)謹(jǐn)型（strigentplasmid)：復(fù)制與宿主染色體同時(shí)受宿主染色體復(fù)制限制，在宿主細(xì)胞中拷貝數(shù)低約１～３份拷貝?！羲沙谛停╮elaxedplasmid):

復(fù)制不受宿主染色體復(fù)制限制可獨(dú)立復(fù)制，在宿主細(xì)胞中拷貝數(shù)高，宿主細(xì)胞中質(zhì)粒有10-200拷貝?；蚬こ坛Ｒ娸d體?；蚬こ讨扑幮掳娴?5頁(yè)質(zhì)粒DNA構(gòu)型

三種不一樣構(gòu)型：當(dāng)其兩條核苷酸鏈均保持著完整環(huán)形結(jié)構(gòu)時(shí)，稱為共價(jià)閉合環(huán)形DNA(cccDNA)，這么DNA通常展現(xiàn)超螺旋SC構(gòu)型；假如兩條多核苷酸鏈中只有一條保持著完整環(huán)形結(jié)構(gòu)，另一條鏈出現(xiàn)有一至數(shù)個(gè)缺口時(shí)，稱之為開環(huán)DNA(ocDNA)；若質(zhì)粒DNA雙鏈均發(fā)生斷裂而形成線形分子，則通稱為L(zhǎng)構(gòu)型?；蚬こ讨扑幮掳娴?6頁(yè)單鏈切割連接單鏈切割連接共價(jià)閉合環(huán)形DNA（SC型）開環(huán)DNA（oc型）線性DNA（L型）環(huán)形雙鏈質(zhì)粒DNA分子含有三種不一樣構(gòu)型基因工程制藥新版第27頁(yè)（3）質(zhì)粒分類F質(zhì)粒----可使宿主A個(gè)別基因伴隨F質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)移到不存在該質(zhì)粒另一宿主B體內(nèi)。

R質(zhì)粒----可編碼宿主A一個(gè)或者數(shù)種抗生素抗性基因，并能夠?qū)⑺鼈儙У讲淮嬖谠撡|(zhì)粒另一宿主B體內(nèi)，使得宿主B也取得一樣抗性。

Col質(zhì)粒----能編碼大腸桿菌毒素基因，經(jīng)過表示之后產(chǎn)生大腸桿菌毒素能夠使得不帶Col質(zhì)粒其它菌株死亡?；蚬こ讨扑幮掳娴?8頁(yè)（4）質(zhì)粒載體具備條件

質(zhì)粒載體，也稱質(zhì)?？寺≥d體，是指用于實(shí)現(xiàn)基因工程操作質(zhì)粒。必須具備以下條件：（1）其分子結(jié)構(gòu)中必須含有多個(gè)單一限制酶切割位點(diǎn)。（2）構(gòu)建重組質(zhì)粒之后必須含有轉(zhuǎn)化功效。（3）分子量較小，易于操作。（4）宿主范圍較為單一、無(wú)感染性?；蚬こ讨扑幮掳娴?9頁(yè)（5）常見細(xì)菌質(zhì)粒pBR322 pBH10 pBH20pTR262 pAT153 pXf3Pmk16 pGEM-3Z pUC19[A]、pBR322質(zhì)粒[B]、pUC19質(zhì)粒[C]、pGEM-3Z質(zhì)粒基因工程制藥新版第30頁(yè)[A]、

pBR322質(zhì)粒①4363bp②含一個(gè)復(fù)制點(diǎn)含一個(gè)抗氨卞青霉素基因(ampR)④

一個(gè)抗四環(huán)素基因(tetR)⑤ampR和tetR抗性基因內(nèi)各有一些限制酶酶切位點(diǎn)，供外源基因插入當(dāng)外源基因插入抗藥基因內(nèi)，抗藥基因失活。AmpR→Amp敏感(AmpS)、TetR→Tet敏感(TetS).基因工程制藥新版第31頁(yè)pBR322:人工構(gòu)建主要質(zhì)粒優(yōu)點(diǎn)：含有較小分子量．含有兩種抗生素抗性基因，作為篩選標(biāo)識(shí)．含有高拷貝數(shù)．是松弛型質(zhì)粒．基因工程制藥新版第32頁(yè)[B]、pUC系列質(zhì)粒

由pBR322和M13噬菌體構(gòu)建而成雙鏈質(zhì)粒載體；（1）2674bp；（2）有ampR和位于lacZ+基因中靠近5’端多克隆位點(diǎn)(MCS)和起源于pBR322質(zhì)粒復(fù)制起始點(diǎn)（3）大腸桿菌β-半乳糖苷酶(lacZ)開啟子及其編碼該基因氨基端α-肽鏈DNA序列,此結(jié)構(gòu)特稱為lacZ+基因，便于藍(lán)白篩選基因工程制藥新版第33頁(yè)pUC質(zhì)粒優(yōu)點(diǎn)：１．含有更小分子，更高拷數(shù)２．適于組織化學(xué)檢測(cè)重組體．

基因工程制藥新版第34頁(yè)[C]、pGEM-3Z質(zhì)粒

含一個(gè)ampR基因和一個(gè)lacZ’編碼基因;

有多克隆位點(diǎn)（MCS）;

正選擇顏色標(biāo)識(shí)lacZ’;

有兩個(gè)來(lái)自噬菌體強(qiáng)開啟子PT7和PSP6,用于外源基因高效表示

注意：T7和SP6開啟子特異性地由噬菌體DNA編碼RNA聚合酶所識(shí)別，所以對(duì)應(yīng)受體菌必須表示噬菌體RNA聚合酶，如：E.coliBL21（DE3）等2743bpMCSlacZ’PT7oriAprpGEM-3ZPSP6基因工程制藥新版第35頁(yè)2、真核基因病毒DNA（1）病毒載體優(yōu)點(diǎn)（2）已經(jīng)研究真核基因病毒DNA基因工程制藥新版第36頁(yè)（1）病毒載體優(yōu)點(diǎn)[A]、含有很高拷貝數(shù)量。[B]、有強(qiáng)大開啟子。[C]、可確保目標(biāo)基因高效表示。

基因工程制藥新版第37頁(yè)（2）已經(jīng)研究真核基因病毒DNA[A]、SV40病毒DNA[B]、牛乳頭瘤病毒[C]、RNA病毒[D]、昆蟲桿狀病毒[E]、人痘病毒DNA[F]、猴空泡病毒DNA[G]、人腺病毒DNA

[H]、人牛痘病毒DNA[I]、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體基因工程制藥新版第38頁(yè)[A]、SV40病毒DNA（A1）、SV40病毒DNA特征（A2）、SV40病毒DNA基因組（A3）、SV40病毒DNA載體構(gòu)建（A4）、SV40病毒DNA載體使用方法基因工程制藥新版第39頁(yè)（A1）、SV40病毒DNA特征為環(huán)狀雙螺旋結(jié)構(gòu)。其宿主為動(dòng)物細(xì)胞。

SV40病毒有二種表示方式：

（1）游離表示方式，SV40DNA+外源性DNA，形成重組DNA，進(jìn)入宿主體內(nèi)，以重組DNA方式表示。

（2）結(jié)合表示方式，重組DNA整合到宿主染色體DNA之中，與染色體基因一起表示?；蚬こ讨扑幮掳娴?0頁(yè)（A2）、SV40病毒DNA基因組基因工程制藥新版第41頁(yè)（A3）、SV40病毒DNA載體構(gòu)建基因工程制藥新版第42頁(yè)（A4）、SV40病毒DNA載體使用方法基因工程制藥新版第43頁(yè)[G]、腺病毒（G1）、腺病毒DNA載體（G2）、腺病毒DNA載體特點(diǎn)基因工程制藥新版第44頁(yè)3、λ噬菌體DNA（1）λ噬菌體DNA特征（2）λ噬菌體DNA改造（3）λ噬菌體DNA體外包裝（4）λ噬菌體載體構(gòu)建（5）λ噬菌體載體使用（6）λ噬菌體載體優(yōu)點(diǎn)基因工程制藥新版第45頁(yè)（1）λ噬菌體DNA特征λ噬菌體DNA為雙鏈DNA病毒，宿主是大腸桿菌。已發(fā)覺λ噬菌體DNA可編碼61個(gè)基因。[A]、λ噬菌體DNA在宿主體內(nèi)生活方式[B]、λ噬菌體DNA結(jié)構(gòu)基因工程制藥新版第46頁(yè)[A]、λ噬菌體DNA在宿主體內(nèi)生活方式

（1）溶源方式：λ噬菌體DNA整合到大腸桿菌DNA中，伴隨大腸桿菌DNA復(fù)制而復(fù)制，這種方式是λ噬菌體DNA作為基因工程載體理論依據(jù)。

（2）溶菌方式：λ噬菌體感染大腸桿菌后，終止了大腸桿菌染色體DNA所控制遺傳信息表示，并深入分解大腸桿菌DNA，最終造成大腸桿菌完全溶解。基因工程制藥新版第47頁(yè)[B]、λ噬菌體DNA結(jié)構(gòu)λ噬菌體基因組基因工程制藥新版第48頁(yè)基因組長(zhǎng)度：約為50kb雙鏈DNA分子，實(shí)際大小為48502bp。DNA是線狀雙鏈分子帶有單鏈互補(bǔ)末端，末端長(zhǎng)12個(gè)核苷酸，稱為粘性末端（cos序列）。當(dāng)噬菌體感染宿主細(xì)胞后，雙鏈DNA分子經(jīng)過cos而成環(huán)狀。61個(gè)基因，每個(gè)基因平均為1000bp，其中32個(gè)較為主要，它們分布和排列與其功效有一定關(guān)系。基因組分為二個(gè)別：

（1）其中二分之一基因，控制著生命活動(dòng)周期。

（2）另二分之一基因，可被外源性目標(biāo)基因所取代，而不影響噬菌體生命活動(dòng)?；蚬こ讨扑幮掳娴?9頁(yè)基因組分為幾個(gè)不連續(xù)區(qū)域，三個(gè)片段組成：（1）左臂，19.6kb，含噬菌體頭、尾蛋白質(zhì)編碼基因，A～J12基因都是組成外殼蛋白基因。（2）中央片段，12kb～24kb，含PL控制red和gam基因。（3）右臂，9kb～11kb，含λDNA復(fù)制和溶菌相關(guān)蛋白編碼基因。與裂解相關(guān)S和R基因、與DNA復(fù)制相關(guān)O基因和P基因等分別聚集在一起。噬菌體左右兩臂包含了λ復(fù)制和成熟所必須全部機(jī)能蛋白編碼，而中央片段為非必需區(qū)，即位于J基因和N基因之間片段可被其它大腸桿菌DNA片段所替換?；蚬こ讨扑幮掳娴?0頁(yè)λ噬菌體基因組非必需區(qū)基因工程制藥新版第51頁(yè)基因工程制藥新版第52頁(yè)（2）λ噬菌體DNA改造野生型λ噬菌體DNA分子較大，其結(jié)構(gòu)基因也很復(fù)雜，而且經(jīng)常容納不下分子量更大外源性目標(biāo)基因DNA片段。需要對(duì)其進(jìn)行改造。改造方法：（1）遺傳學(xué)方法-------將λ噬菌體DNA交替地在不含質(zhì)粒大腸桿菌、和含質(zhì)粒大腸桿菌宿主內(nèi)生長(zhǎng)，來(lái)刪去其過多限制酶位點(diǎn)。（2）體外刪除法-------將λ噬菌體DNA在體外進(jìn)行限制酶消化，再將未被切割個(gè)別經(jīng)過蛋白質(zhì)包裝后，去感染大腸桿菌。經(jīng)過幾代連續(xù)培養(yǎng)之后，λ噬菌體DNA就會(huì)失去不需要限制酶位點(diǎn)。基因工程制藥新版第53頁(yè)（3）λ噬菌體DNA體外包裝[A]、體外包裝作用[B]、λ噬菌體DNA包裝原理[C]、λ噬菌體DNA包裝過程

基因工程制藥新版第54頁(yè)[A]、體外包裝作用

λ噬菌體DNA連接上外源性目標(biāo)基因，就成為重組DNA分子，不過，重組之后DNA分子必須經(jīng)過包裝，加上蛋白質(zhì)外殼形成完整病毒顆粒，才含有感染宿主能力。基因工程制藥新版第55頁(yè)[B]、λ噬菌體DNA包裝原理λ噬菌體DNA頭部蛋白+重組DNA分子+λ噬菌體DNA尾部蛋白，在適當(dāng)條件下混合，就能夠自動(dòng)地包裝成完整λ噬菌體病毒顆粒。基因工程制藥新版第56頁(yè)（4）λ噬菌體載體構(gòu)建（A）

縮短長(zhǎng)度（B）改造酶切位點(diǎn)（C）增加選擇標(biāo)識(shí)基因工程制藥新版第57頁(yè)（A）

縮短長(zhǎng)度基因工程制藥新版第58頁(yè)插入型載體：①失去了非必需區(qū)②僅保留了EcoRⅠ單一切點(diǎn)③切點(diǎn)又位于匯報(bào)基因上，故在切開DNA并插入外源基因后，匯報(bào)基因失活，即可依此進(jìn)行重組體篩選④可插入長(zhǎng)度為10kb外源DNA只含一個(gè)限制性位點(diǎn)可供插入外源DNA載體，這類λ噬菌體載體稱插入型載體。基因工程制藥新版第59頁(yè)注意：λ噬菌載體作為載體，其重組噬菌體DNA大小只能：

37kb~51kb。λ噬菌體載體是主要用于cDNA文庫(kù)構(gòu)建，也經(jīng)常見于外源目標(biāo)基因克隆?；蚬こ讨扑幮掳娴?0頁(yè)置換型載體置換型載體：可被外源DNA置換λ噬菌體非必需區(qū)兩側(cè)有一對(duì)限制性酶切位點(diǎn)載體，稱為置換型載體。適用基因組克隆基因工程制藥新版第61頁(yè)特殊性質(zhì)：中間區(qū)域約長(zhǎng)18kb，這一段DNA能夠被外源置換而不會(huì)影響λphage裂解生長(zhǎng)能力。包裝限制：λphage頭部外殼蛋白容納DNA能力上限≤105%，下限≥75%。包裝范圍[51kb,36kb].只有λDNA長(zhǎng)度大于野生型λphageDNA長(zhǎng)度75％而不超出其105％時(shí)，才能被包裝成phage顆粒，當(dāng)DNA長(zhǎng)度短于野生型75%或超出105%時(shí)，phage活性就急劇下降，故要求λ載體DNA和外源DNA長(zhǎng)度之和在36～51kb之間。λ載體必要區(qū)是28kb,理論上克隆能力為23kb.基因工程制藥新版第62頁(yè)（B）改造酶切位點(diǎn)野生型λ-DNA鏈上有5個(gè)EcoRI位點(diǎn)和7個(gè)HindIII位點(diǎn)，不利于重組操作，必須刪除至1-2個(gè)。為了便于各種起源DNA片段克隆，還需要增加一些單一酶切位點(diǎn)。基因工程制藥新版第63頁(yè)（C）增加選擇標(biāo)識(shí)基因工程制藥新版第64頁(yè)加裝選擇標(biāo)識(shí)lacZ基因工程制藥新版第65頁(yè)（5）λ噬菌體載體使用重組λDNA構(gòu)建

(酶切，連接）λ噬菌體體外包裝λ噬菌體侵染大腸桿菌重組λDNA分離基因工程制藥新版第66頁(yè)（6）λ噬菌體載體優(yōu)點(diǎn)容量大，裝載能力可達(dá)23kb，便于構(gòu)建基因文庫(kù)重組子篩選較為方便DNA提取操作較為簡(jiǎn)便基因工程制藥新版第67頁(yè)4：?jiǎn)捂淒NA噬菌體M13載體M13噬菌體（M13phage）是一個(gè)大腸桿菌雄性特異絲狀噬菌體，遺傳物質(zhì)是環(huán)狀單鏈DNA,全長(zhǎng)約6.5kb。宿主是絲狀大腸桿菌。它是單鏈DNA噬菌體中一個(gè)經(jīng)典代表。M13感染細(xì)菌后，經(jīng)過復(fù)制轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈復(fù)制型（RF）。復(fù)制型M13可用作克隆載體。噬菌體M13感染宿主之后，在含有異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）X-gal培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，會(huì)形成藍(lán)色噬斑。經(jīng)過藍(lán)色噬斑出現(xiàn)能夠顯示噬菌體M13存在。感染宿主之后，噬菌體M13所釋放單鏈DNA可用于制作放射性標(biāo)識(shí)探針，用來(lái)檢測(cè)RNA結(jié)構(gòu)?；蚬こ讨扑幮掳娴?8頁(yè)M13噬菌體組成和結(jié)構(gòu)M13噬菌體顆粒是絲狀，只感染雄性大腸桿菌。感染宿主后不裂解宿主細(xì)胞，而是從感染細(xì)胞中分泌出噬菌體顆粒，宿主細(xì)胞仍能繼續(xù)生長(zhǎng)和分裂?；蚬こ讨扑幮掳娴?9頁(yè)M13噬菌體外型呈絲狀M13噬菌體由外殼包裝蛋白和正鏈DNA組成M13DNA全長(zhǎng)6407個(gè)核苷酸M13DNA上最少有11個(gè)基因2700個(gè)外殼蛋白分子M13噬菌體不裂解宿主細(xì)胞，但抑制其生長(zhǎng)M13噬菌體組成和結(jié)構(gòu)基因工程制藥新版第70頁(yè)單鏈DNA，由6407堿基組成。90%以上序列可編碼蛋白質(zhì)，共有11個(gè)編碼基因基因間間隔區(qū)多為幾個(gè)堿基。較大間隔位于基因Ⅷ/Ⅲ以及基因Ⅱ/Ⅳ之間，其間有調(diào)整基因表示和DNA合成元件。M13噬菌體基因組基因工程制藥新版第71頁(yè)M13噬菌體基因組編碼3類蛋白質(zhì)：①?gòu)?fù)制蛋白（基因Ⅱ，Ⅴ和Ⅹ）②形態(tài)發(fā)生蛋白（基因Ⅰ，Ⅳ和Ⅺ）③結(jié)構(gòu)蛋白（基因Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ）基因工程制藥新版第72頁(yè)M13噬菌體載體構(gòu)建

M13噬菌體作為載體主要特點(diǎn)：①M(fèi)13噬菌體感染與釋放不會(huì)殺死宿主菌，僅造成宿主菌生長(zhǎng)遲緩；②M13噬菌體DNA在宿主菌內(nèi)既能夠是單鏈也能夠是雙鏈，經(jīng)過感染或轉(zhuǎn)化方法能將M13噬菌體DNA導(dǎo)人宿主菌中；③M13噬菌體包裝不受DNA大小限制，其噬菌體顆粒大小可隨DNA大小而改變，即使DNA大小比本身DNA大小超出6倍，仍能進(jìn)行包裝?；蚬こ讨扑幮掳娴?3頁(yè)⑤M13噬菌體在用作載體時(shí)是利用其雙鏈狀態(tài)RFDNA：?jiǎn)捂淒NA酶切和連接是比較困難。⑥外源片段插入位點(diǎn)在基因Ⅱ和基因Ⅳ之間508bp間隔區(qū)----M13不像λ噬菌體基因組那樣含有較大可替換區(qū)。它基因組中絕大多數(shù)為必需基因，只有兩個(gè)間隔區(qū)可用來(lái)插入外源DNA（基因Ⅱ/Ⅳ和基因Ⅷ/Ⅲ之間）?；蚬こ讨扑幮掳娴?4頁(yè)5：人工質(zhì)粒載體--科斯質(zhì)粒1978年Collins和Hohn構(gòu)建一個(gè)新型大腸桿菌克隆載體，命名為cosmid(柯斯質(zhì)粒)，又叫粘粒。

柯斯質(zhì)粒（cosmid）=cos序列+質(zhì)粒。實(shí)際是質(zhì)粒衍生物，它是用正常質(zhì)粒同λ噬菌體cos位點(diǎn)組成。[A]、科斯質(zhì)粒基礎(chǔ)組成[B]、科斯質(zhì)粒特征[C]、科斯質(zhì)粒用途基因工程制藥新版第75頁(yè)Cos質(zhì)粒（考斯質(zhì)粒Cosmid）基因工程制藥新版第76頁(yè)[A]、科斯質(zhì)粒基礎(chǔ)組成（1）含有λ噬菌體DNA粘性末端序列（COS序列）。（2）含有質(zhì)粒一個(gè)復(fù)制起始區(qū)。（3）含有質(zhì)粒一個(gè)抗藥性標(biāo)識(shí)。（4）含有各種限制性內(nèi)切酶單一性切點(diǎn)。基因工程制藥新版第77頁(yè)柯斯質(zhì)粒pHC79系由質(zhì)粒pBR322和λ噬菌體cos位點(diǎn)一段DNA組成。包裝時(shí)，cos位點(diǎn)打開而產(chǎn)生λ噬菌體粘性末端。因?yàn)閜HC79有pBR