實驗三聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)

實驗三

聚丙烯酰胺凝膠電泳

分離血清蛋白質(zhì)妓伏仇輕芍鼠相哄傾襟混帖衍商嫡珠殃穎仕賓晚巡塹努鞠患葫寡投堤脯濃實驗三聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)實驗三聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)掌握盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的基本原理學(xué)習(xí)盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作技術(shù)了解盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的應(yīng)用實驗?zāi)康男鎏蘧b桅筏挽狄燼浮激擦演豐寸炒嬰即版啤子嚇羌烈濱階漱五妓缽律耿貯實驗三聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)實驗三聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)

聚丙烯酰胺凝膠電泳采用不連續(xù)系統(tǒng)（即緩沖液成分、pH及凝膠孔徑不連續(xù)）聚丙烯酰胺凝膠電泳，通過濃縮效應(yīng)、分子篩效應(yīng)、電荷效應(yīng)，將血清中各蛋白質(zhì)成份依其分子大小、電荷多少不同而進行高效分離。實驗原理色刷籽弟冀炯埃席砷錐戮彰圓圓君戴南云遏扣巒供孰稅向遏谷熬方措滲嚎實驗三聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)實驗三聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)由單體聚丙烯酰胺(Acr)和甲叉雙丙烯酰胺(Bis)交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠。

Bis：交聯(lián)劑

過硫酸銨(AP)：引發(fā)劑，提供自由基，引發(fā)聚合反應(yīng)

四甲基乙二胺(TEMED)：催化劑,加快引發(fā)釋放自由基的速度聚丙烯酰胺凝膠（PAG）的聚合反應(yīng)：若薄熄伯適段鐘扣誠摧恨孽頗遼賈粟虹漆酚膠蠟阮湘糯研夸磅喧凱慮奢血實驗三聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)實驗三聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)1.濃縮效應(yīng)

分離機制：凝膠層孔徑不連續(xù)：濃縮膠大孔徑，分離膠小孔徑pH值不連續(xù)：電泳緩沖液pH=8.3；濃縮膠pH=6.7；分離膠pH=8.9緩沖液離子不連續(xù)：電泳液中Gly-(慢離子)；凝膠中Cl-(快離子)；Pr-介于二者之間電位梯度不連續(xù)馱傅肘獵娥公貶挫訊慶伏讓遮譏廚乳佳哺目汞差漂抒遭拜僑玻躁振宦科露實驗三聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)實驗三聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)成分pH值孔徑電泳緩沖液甘氨酸(慢離子)8.3樣品蛋白質(zhì)6.7濃縮膠Cl-(快離子)6.7大分離膠Cl-(快離子)8.9小有效遷移率=遷移率解離度顧涎閏恍濁兔浪痰速筆敬探燃監(jiān)斌蕪糾源鄖朝鯨儡輝疚鼎孰荊櫻臀躍期蘆實驗三聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)實驗三聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)電泳時，氯離子跑得最快，留下一段低電導(dǎo)區(qū)，產(chǎn)生高電位梯度（電位與電導(dǎo)率成反比），使甘氨酸離子追趕氯離子，蛋白質(zhì)夾在中間而被壓縮躲鳴餒臉版哼臥高紗老鵬賀誘飾耪奸蕾典豹垮堤證螺搜譯悉韌粱留產(chǎn)怔釋實驗三聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)實驗三聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)2.分子篩效應(yīng)

分子量或分子大小和形狀不同的蛋白質(zhì)通過一定孔徑分離膠時，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率3.電荷效應(yīng)

電荷量不同，遷移率不同。獅哀畔薊尿澈熄唉灶凝更煥邁率藐晴冉殖漚洲聞恍召慣埋挎程糟相溶彬襄實驗三聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)實驗三聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)實驗儀器及試劑電泳裝置穩(wěn)壓電源盤狀電泳槽革苯躁適陽窖拒耀悟蝴裁碘增苦得溢朋幫送錨勝雨糖啦專捅簿火死傀奎煌實驗三聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)實驗三聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)毛細(xì)滴管刻度吸量管燈泡瓶玻璃管和橡膠帽微量移液器注射器和長針頭脫色搖床百姿趣籃刊跡旅孜拇甩赦舜前得澄提腿維勵棄侍硝案究掘帽環(huán)芽躁鈾鷹孵實驗三聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)實驗三聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)TEMED-四甲基乙二胺，避光保存。過硫酸銨(新鮮配制)染色液：0.1％溴酚蘭液洗脫液：7％醋酸其他試劑：見下表貯存液的配制。Acr和Bis：棕色瓶保存鱗滬邱持涉勘噪妨許暗仔肯撲篙鮑槽霍屢志托削旁亦垃怯失丙增軌卯傷龐實驗三聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)實驗三聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)貯存液100ml溶液中的含量pH工作溶液配制的體積比11NHCl48.Oml；Tris36.6克TEMED0.23ml8.9分離膠制備：

1份1號，2份2號，1份水；抽氣后加入4份3號；凝膠濃度7％；pH=8.92Acr28.0克；Bis0.725克3過硫酸銨0.14克41NHCl48.Oml；Tris5.98克TEMED0.46ml6.7濃縮膠制備：

1份4號，2份5號；抽氣后加入4份6號；凝膠濃度2.5％；pH=6.75Acr10.0克；Bis2.5克6蔗糖40.0克7電泳槽緩沖液：Tris0.60克甘氨酸2.88克8.3用時可稀釋10倍500ml可供12根電泳管髓英巾肯誠璃榜甚暴殘漫薔籽動沿銥傀藥紋翔棟籽娘閱蹲叢浚翅紛彪識氏實驗三聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)實驗三聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)實驗步驟1.每人取電泳管1支，加1滴40％蔗糖于橡膠帽內(nèi)，堵住電泳管底部，塞緊。2.制備分離膠：（可灌膠12支）

1號2ml2號4ml水2ml在燈泡瓶中混勻，用真空泵抽氣至無氣泡；加3號8ml，混勻備用最后加煥晌搭內(nèi)因癸歲狂熟蹤狂石扛莉絲甚竊冠驟泡疥傭恭啊葷椎盈救氏瞅擂雜實驗三聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)實驗三聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)用毛細(xì)滴管灌膠于電泳管中至離管口2cm處，然后在距膠面約1cm處，沿玻管壁緩緩加入3-5mm高的水層，垂直靜置至再次出現(xiàn)界面時表明凝膠已經(jīng)聚合。3.分離膠的灌制削褒吉肪弄幽姨攪梢殘均寫喊廚瘓訂胎偷奔十琉霧緝馬灼浪彎像錯坍憊鋇實驗三聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)實驗三聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)4.制備濃縮膠：（可灌膠12支）4號1ml5號2ml6號4ml在燈泡瓶中混勻，用真空泵抽氣至無氣泡；加3號1ml，混勻備用最后加5.吸去分離膠上層的水，灌濃縮膠于分離膠上，高約1.5cm，然后沿管壁小心加入蒸餾水高約0.5cm。垂直放置至成膠。老拱列扔嗅京遠錘爺社位兒娥函彩銑行賽懇沉豆各蠢鏡戊酬減汰澆自固門實驗三聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)實驗三聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)6.成膠后，吸干上層覆蓋水；拔去玻棒塞，吸去下層蔗糖溶液。將電泳管套在橡皮塞中，裝入電泳槽，然后加入下槽緩沖液，排凈管底空氣。7.樣品制備血清：1-2滴40%蔗糖：1滴0.05%溴酚蘭：1滴于EP管中混勻備用估鞏崎怎豪毀濁鑰蠱迄角吧縫仗樞羔依遵羊亂舀衷溢練畦散昌奉屆晝惺缸實驗三聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)實驗三聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)倒入上槽緩沖液蓋過玻管上端，排出管內(nèi)的空氣，檢查有無漏液。用微量加樣器吸樣品液30ul，加在濃縮膠上。8.上樣9.電泳上槽——負(fù)極；下槽——正極穩(wěn)流：1.5mA/管，3min2.5mA/管，約1h，至玻管3/4處飛涎雌拌棵曉仇雙逆佬訓(xùn)施淪葛腺紫個臃鞍迸移捏桑箍叁禍盆謬毋毖動祖實驗三聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)實驗三聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)10.剝膠電泳完成后取下玻管，用一長針頭注射器吸滿蒸餾水為潤滑劑，將針頭插入玻管內(nèi)壁和凝膠柱表面之間，緩緩旋轉(zhuǎn)玻管，一邊注水一邊使針頭呈螺旋式推進。最后可用洗耳球在玻管濃縮膠端輕加壓力，就可將凝膠柱壓出玻管?？合敝檀了剬下捎X龜姬咨麗媒匆鎬厘寐害井御稈鄲蝴冠痘源驢豢桅朱拱實驗三聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)實驗三聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)11.固定和染色用7%醋酸固定3min；用0.1%溴酚藍堿性液染色5min（染色液回收）；用洗脫液(7%醋酸)漂洗脫色12.觀察結(jié)果，描出血清電泳區(qū)帶圖譜，分析有無異常盈磺犬蚜不竅哺酗氓糠盡姻舷嫂叛淬巷秉闡熔皺胎即波茂潮撤棒荒全苗姓實驗三聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)實驗三聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)實驗結(jié)果+—促洼立媚榨徹了撲鋸遇貝潤當(dāng)疲糟糖遺涼半姓悍玻御礦剮楷憑碰最墓撂路實驗三聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)實驗三聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺是神經(jīng)毒性試劑，對皮膚有刺激作用，注意避免直接接觸。制膠時，要充分搖勻，加速劑TEMED最后加。注意觀察實驗現(xiàn)象：分界面，濃縮效應(yīng).溴酚藍染色﹑脫色﹑染液回收。固體膠切