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文檔簡介
關(guān)于生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)生化制藥的六個階段
1.原料的選擇和預(yù)處理
2.細胞的粉碎
3.提?。簭脑现薪?jīng)溶劑分離有效成分,制成粗品的工藝過程。
4.純化:粗制品經(jīng)鹽析、有機溶劑沉淀、吸附、層析、透析、超離心、膜分離、結(jié)晶等步驟進行精制的工藝過程。
5.濃縮、干燥及保存
6.制劑:原料藥(精制品)經(jīng)精細加工制成片劑、針劑、凍干劑、粉劑等供臨床應(yīng)用的各種劑型。第2頁,共80頁,2024年2月25日,星期天第一節(jié)
生物材料與生物活性物質(zhì)一、
生物材料的來源概述:1.
動、植物、微生物的組織、器官、細胞與代謝產(chǎn)物是生產(chǎn)生物藥物的生物資源;2.
動植物細胞培養(yǎng)與微生物發(fā)酵技術(shù)是獲得生物制藥原料的重要途徑;3.基因工程技術(shù)、細胞工程技術(shù)和酶工程技術(shù)是開發(fā)生物制藥資源的新途徑。
第3頁,共80頁,2024年2月25日,星期天第4頁,共80頁,2024年2月25日,星期天(一)
動物臟器主要來源是豬、牛、羊和家禽、魚類等的臟器,包括胰臟、腦、胃粘膜、肝臟、脾臟、小腸、腦垂體和心臟等。1.
胰臟位于胃的后方,橫于腹后壁,是動物體內(nèi)不可替代的實質(zhì)性腺體之一。分泌胰島素和胰高血糖素,調(diào)節(jié)糖的代謝;還分泌各種消化酶,如胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶。已用胰臟提取的生物藥物有40多種。2.
腦腦組織富含脂質(zhì),腦組織中脂類占13.5%,蛋白質(zhì)占8-10%,脂類物質(zhì)主要是磷脂、肌醇磷脂、神經(jīng)磷脂、腦苷脂、神經(jīng)節(jié)苷脂和膽固醇,還有神經(jīng)遞質(zhì)和多種神經(jīng)肽。第5頁,共80頁,2024年2月25日,星期天3.
胃其位置、形態(tài)因人而異,一般在左上腹,瘦長型的人常為垂直的長胃。為動物的消化器官,主要分泌消化液,如胃蛋白酶、組織蛋白酶、膠原蛋白酶等。4.
肝臟位于右上腹部,是機體內(nèi)最大的實質(zhì)性腺體,是機體的“生化反應(yīng)器”,含有復(fù)雜的酶系。已知的肝臟酶達數(shù)百種。用肝臟可制備肝注射液、肝水解物、肝細胞生長因子、造血因子等。5.
脾臟位于胃的左后側(cè),左側(cè)9-11肋骨內(nèi)側(cè)的一個長圓形暗紅色器官,是體內(nèi)最大的周圍淋巴器官、免疫器官,已用于生產(chǎn)的藥物有脾水解物、脾RNA和脾轉(zhuǎn)移因子。第6頁,共80頁,2024年2月25日,星期天6.
小腸消化和吸收的主要場所,小腸的長度在成人平均是5-7米,含有30多種胃腸道激素。7.
腦垂體懸垂于腦的底部,體積很小,總重量不到1克,但結(jié)構(gòu)復(fù)雜,包括腺垂體和神經(jīng)垂體兩部分,分泌的激素種類多,作用廣泛,并能調(diào)節(jié)其他內(nèi)分泌腺的活動。8.心臟位于胸腔內(nèi),膈肌的上方,二肺之間,是一個厚壁的肌性有腔器官,具有節(jié)律性的收縮能力。心臟含有豐富的糖元、激素和酶類,用心臟為原料生產(chǎn)的藥物主要有細胞色素C、輔酶Q10和心血通注射液。
第7頁,共80頁,2024年2月25日,星期天(二)
血液、分泌物和其他代謝物以血液為原料可生產(chǎn)多種藥物,如凝血酶、血紅蛋白、SOD、干擾素等。其他,如尿液、膽汁、蛇毒、蜂毒也是重要的生物材料。第8頁,共80頁,2024年2月25日,星期天(三)
海洋生物海洋生物約占全球生物的一半,估計多達5億種,是開發(fā)新藥的重要寶庫。1.
海藻已從藻類生物中發(fā)現(xiàn)、提取了一些抗腫瘤、防治心血管疾病、治療慢性氣管炎、驅(qū)蟲、抗放射線物質(zhì)等。2.腔腸動物屬于原始多細胞動物,已應(yīng)用的不多,已提取的有前列腺素類、萜類抗菌物質(zhì)、抗癌物質(zhì)。
第9頁,共80頁,2024年2月25日,星期天3.節(jié)肢動物其中的某些甲殼動物(包括蝦、蟹)可供藥用,從中提取的甲殼素可用于甲亢、腫瘤、肝炎、腎炎和糖尿病等的輔助治療,另外在食品工業(yè)上有重要用途,如用于廢水處理、食品添加劑、減肥。4.軟體動物包括螺、蚌類和烏賊等,已從其中提取出一些具有抗病毒、抗腫瘤、抗菌、降血脂、止血、平喘作用的多糖、多肽、毒素等。5.棘皮動物包括海星、海膽、海參,關(guān)于海膽的研究很多,已提取到不少藥物,還發(fā)現(xiàn)了在化工方面的應(yīng)用。第10頁,共80頁,2024年2月25日,星期天6.魚類可制造多種藥物,最常用的是魚肝油。7.爬行動物海生爬行動物有海蛇、海龜?shù)?,海蛇毒液含有多種酶類。8.海洋哺乳動物從鯨魚、海豚,可以提取多種藥物。第11頁,共80頁,2024年2月25日,星期天(四)
植物藥用植物品種繁多,除含有生物堿、強心苷、黃酮、皂苷、揮發(fā)油、樹脂、鞣質(zhì)等有效藥理成分外,還含有氨基酸、蛋白質(zhì)、酶、激素、糖類、脂類、維生素等生化成分。如天花粉蛋白、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝集素、多糖等。第12頁,共80頁,2024年2月25日,星期天藥用植物中的主要藥理成分:1.生物堿,是生物體中一類含氮有機化合物的總稱,它們有類似堿的性質(zhì),能和酸結(jié)合成鹽。如麻黃堿、嗎啡。2.強心苷,是一類對心肌有興奮作用,具有強心生理活性的成分,它們的分子中都有一個C17位被不飽和內(nèi)酯環(huán)所取代的甾體母核。如洋地黃毒苷。3.黃酮,系兩個芳環(huán)通過三碳鏈相互連結(jié)而成的一系列化合物,大多數(shù)具有顏色,在植物體內(nèi)大部分與糖結(jié)合成苷。銀杏中含銀杏素、異銀杏素、白果素等都是黃酮類,它們具有解痙、降壓、擴張冠狀血管等藥理作用。第13頁,共80頁,2024年2月25日,星期天4.皂苷,是一類比較復(fù)雜的化合物,它們的水溶液振搖時能產(chǎn)生大量持久的蜂窩狀泡沫,與肥皂相似,故名皂苷。它們有減低液體表面張力的作用,可以乳化油脂,用做去垢劑。人參中含皂苷總量約4%。5.揮發(fā)油,是具香味和揮發(fā)性、可隨水蒸氣蒸餾的易流動的油狀液體。它們多數(shù)具有多方面的藥理作用,如解表、發(fā)汗、驅(qū)風(fēng)、鎮(zhèn)痛、殺蟲、抗菌。薄荷、茴香、樟木、桂皮都含有揮發(fā)油。6.樹脂,常與揮發(fā)油、樹膠、有機酸等混合存在,與揮發(fā)油共存的稱油樹脂,與樹膠共存的稱膠樹脂,與芳香族酸共存的稱香樹脂。藥用的如松香、乳香、沒藥、安息香等.第14頁,共80頁,2024年2月25日,星期天7.鞣質(zhì),又稱丹寧,鞣酸,是存在于植物中的一類分子較大的復(fù)雜多元酚類化合物,可與蛋白質(zhì)結(jié)合成不溶于水的沉淀,故能與生獸皮結(jié)合而形成致密、柔順、不易腐敗又難以透水的皮革,所以稱為鞣質(zhì)。茶葉、柿子中含有豐富的鞣質(zhì)。鞣質(zhì)可用于解毒、抗菌、治療燒傷(使創(chuàng)面收斂、干燥、結(jié)痂)。第15頁,共80頁,2024年2月25日,星期天(五)
微生物微生物資源非常豐富,其代謝產(chǎn)物有1300多種,已大量生產(chǎn)的才近100種,微生物酶有幾千種,已被應(yīng)用的才幾十種,可見其應(yīng)用前景廣闊。1.
細菌常用細菌發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸(消毒防腐藥,用于空氣消毒)、醋酸、丙酮、丁酸,它們在醫(yī)藥工業(yè)應(yīng)用很廣。利用細菌生產(chǎn)氨基酸、有機酸、糖類、核苷酸類、維生素、酶,發(fā)展?jié)摿艽?。用埃希氏大腸桿菌生產(chǎn)的天冬酰胺酶是治療腫瘤的第一個酶制劑。第16頁,共80頁,2024年2月25日,星期天2.
放線菌是最重要的抗生素產(chǎn)生菌,已有的1000多種抗生素產(chǎn)自放線菌;還利用放線菌生產(chǎn)氨基酸、核苷酸類、維生素、酶。3.
真菌可以利用真菌生產(chǎn)酶、有機酸、氨基酸、核酸、維生素、促生素、多糖;還可以直接利用真菌本身作為藥物,如靈芝、銀耳、冬蟲夏草。4.
酵母菌可生產(chǎn)維生素、蛋白質(zhì)、多肽和核酸等。第17頁,共80頁,2024年2月25日,星期天(六)
開發(fā)生物新資源1.
動植物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)2.應(yīng)用基因工程技術(shù),生產(chǎn)各種生物活性物質(zhì),尤其適合于在自然界中含量低、活性高的一些微量物質(zhì)的生產(chǎn)。
第18頁,共80頁,2024年2月25日,星期天二、
生物活性物質(zhì)的存在方式(一)
生物活性物質(zhì)的存在方式與其生物功能生物活性物質(zhì)分為“胞內(nèi)”與“胞外”兩種存在部位。存在于細胞內(nèi)的生物活性物質(zhì)有些游離在胞漿中,有些結(jié)合于質(zhì)膜或器膜上,或存在于細胞器內(nèi)。對于胞內(nèi)物質(zhì)的提取要先破碎細胞;對于膜上物質(zhì)則要選擇適當?shù)娜軇┦蛊鋸哪ど先芙庀聛?。?9頁,共80頁,2024年2月25日,星期天(二)
生物分子間的作用力生物分子間主要是通過一些非共價鍵,如氫鍵、鹽鍵、金屬鍵、范德華力、疏水鍵、堿基堆積力所維系,其鍵能較弱;生物大分子的空間高級結(jié)構(gòu)也是由非共價鍵結(jié)合的,因此分離時應(yīng)十分小心,確保立體結(jié)構(gòu)不受破壞。通常在十分溫和條件下操作。第20頁,共80頁,2024年2月25日,星期天三、生物活性物質(zhì)的存在特點(一)生物材料組成的復(fù)雜性不同生物含有不同種類的活性物質(zhì)。同種生物,由于細胞的類型、年齡、分化程度的不同都會改變活性物質(zhì)的組成。如:胸腺激素只能從幼齡動物中提取;絨毛膜促性腺激素(HCG)只能從孕婦尿中提取。第21頁,共80頁,2024年2月25日,星期天(二)
生物活性物質(zhì)存在的特點1.生物活性物質(zhì)在生物體材料中含量較低、雜質(zhì)含量很高。例如:胰島素在胰臟中的含量約為萬分之二,膽汁中的膽紅素含量為萬分之五至八。2.生物材料中的生化組成數(shù)量大,種類多,目的物與雜質(zhì)的理化性質(zhì)接近,分離純化困難。第22頁,共80頁,2024年2月25日,星期天四、
生物材料的準備
(一)
生物材料的選取
選擇原則:有效成分含量高,原料新鮮、無污染;來源豐富、易得;原料產(chǎn)地較近,價格低廉;原料中雜質(zhì)含量少,便于分離純化等。
1.
有效成分的含量(1)生物品種:催乳素以哺乳動物為材料(2)合適的組織器官:免疫球蛋白以血液為原料(3)生物的生長期2.
雜質(zhì)情況3.
來源第23頁,共80頁,2024年2月25日,星期天
(二)
生物材料的采集、預(yù)處理與保存采集:必須快速、及時速凍、低溫保存。預(yù)處理:1、動物組織先要剔除結(jié)締組織、脂肪組織等非活性部分;植物種子去殼除脂;微生物要進行菌體與發(fā)酵液分離等基本操作。便于貯存和運輸。2、冷凍法預(yù)處理:有些材料要冷凍保存或低溫保存,以便抑制微生物和酶的作用。3、有機溶劑除去部分水分:用丙酮或乙醇進行脫水和脫脂,有利于貯存。保存方法:有速凍、凍干、或浸存于丙酮與甘油中。第24頁,共80頁,2024年2月25日,星期天第二節(jié)細胞破碎
在提取前先將大塊的原料粉碎或絞碎成適度的粒度,或?qū)⒓毎扑?,使胞?nèi)活性物質(zhì)充分釋放到溶液中,有利于提取或吸附。
動物臟器組織:常用絞肉機機械法粉碎;
植物肉質(zhì)組織:常用磨碎法;
微生物:常用自溶、冷熱交替、加砂研磨、超聲、加壓等處理方法。
第25頁,共80頁,2024年2月25日,星期天1.機械法:組織搗碎機、勻漿器、研缽、球磨機、萬能粉碎機、絞肉機、擊碎機、刨片機。動物組織多在冰凍狀態(tài)絞碎、溶漿。2.物理法
A、反復(fù)凍融法:把待破碎的樣品冷至-20℃-15℃
,使之凝固,然后緩慢的溶解,如此反復(fù)操作,大部分動物細胞及細胞內(nèi)的顆??梢云扑?。
B、冷熱交替法:將材料投入沸水中,在90℃左右維持數(shù)分鐘,立即置于冰浴中,使之迅速冷卻,絕大部分細胞被破壞。此法多用于細菌或病毒中提取蛋白和核酸。
第26頁,共80頁,2024年2月25日,星期天
C、超聲波處理法:多用于微生物材料,處理的效果與樣品濃度、使用頻率有關(guān)。用大腸桿菌制備各種酶時,常用50~100mg/L菌體濃度,在1~10KC頻率下處理10~15min。操作時注意避免溶液中氣泡的存在。
D、加壓破碎法:加氣壓或水壓,達0.59~34.32MPa(210~350kgf/cm2)的壓力時,可使90%以上細胞被壓碎。多用于微生物酶制劑的工業(yè)制備。第27頁,共80頁,2024年2月25日,星期天3.化學(xué)法:
用稀酸、稀堿、濃鹽、有機溶劑、表面活性劑處理細胞。4.生化法:
A.自溶法:將新鮮的生物材料存放在一定的pH和適當溫度下,利用組織細胞中自身的酶系將細胞破壞,使細胞內(nèi)含物釋放出來的方法。自溶的溫度,動物材料在0-4℃,微生物在室溫下。自溶時,需加少量的防腐劑,甲苯、氯仿,以防止外界細菌的污染。*由于自溶時間較長,不易控制,故制造具有活性的核酸和蛋白質(zhì)時比較少用。第28頁,共80頁,2024年2月25日,星期天4.生化法:
A.自溶法:將新鮮的生物材料存放在一定的pH和適當溫度下,利用組織細胞中自身的酶系將細胞破壞,使細胞內(nèi)含物釋放出來的方法。自溶的溫度,動物材料在0-4℃,微生物在室溫下。自溶時,需加少量的防腐劑,甲苯、氯仿,以防止外界細菌的污染。*由于自溶時間較長,不易控制,故制造具有活性的核酸和蛋白質(zhì)時比較少用。第29頁,共80頁,2024年2月25日,星期天
B.溶菌酶處理法:溶菌酶是專一地破壞細菌細胞壁的酶。多用于微生物。如用噬菌體感染大腸桿菌細胞制造DNA時,采用pH8.0的0.1mol/LTris-0.01mol/LEDTA制成2億個/mL的細胞懸液,然后加入100μg~1mg的溶菌酶,在37oC保溫10min,細菌胞壁即被破壞。第30頁,共80頁,2024年2月25日,星期天一、提取方法1.
用酸、堿、鹽水溶液提取用于提取各種水溶性、鹽溶性的生化物質(zhì),這類溶劑提供了一定的離子強度、pH值及相當?shù)木彌_能力。某些與細胞結(jié)構(gòu)結(jié)合牢固的生物大分子,在提取時采用高濃度鹽溶液(如4mol/L鹽酸胍,8mol/L脲或其他變性劑,這種方法稱“鹽解”)。
第三節(jié)生物活性物質(zhì)的提取第31頁,共80頁,2024年2月25日,星期天2.
用表面活性劑提取表面活性劑分子兼有親水與疏水基團,在分布于水-油界面時有分散、乳化和增溶作用。表面活性劑可分為陰離子型、陽離子型、中性與非離子型。離子型表面活性劑作用強,但易引起蛋白質(zhì)等生物大分子的變性;非離子型表面活性劑變性作用小,適合于用水、鹽系統(tǒng)無法提取的蛋白質(zhì)或酶的提取。陰離子表面活性劑SDS可以破壞核酸與蛋白質(zhì)的離子鍵合,對核酸酶又有一定抑制作用,因此常用于核酸的提取。第32頁,共80頁,2024年2月25日,星期天表面活性劑的親油、親水性能的強弱,通常以親水親油平衡值(H.L.B)表示:
H.L.B=親水基的親水性/親油基的親油性生物提取常用的表面活性劑,其H.L.B多在10-20之間。經(jīng)表面活性劑處理后,它的存在對酶蛋白等的進一步純化帶來一定困難,如鹽析時很難使蛋白質(zhì)沉淀,因此需先除去。離子型表面活性劑可用離子交換層析法除去;非離子型表面活性劑可用親脂性葡聚糖凝膠層析法除去;其他表面活性劑可用分子篩層析法除去。第33頁,共80頁,2024年2月25日,星期天3.
有機溶劑提?。?)固-液提取,常用于水不溶性的脂類、脂蛋白、膜蛋白結(jié)合酶等的提取。包括單一溶劑分離法、多種溶劑組合分離法。常用的有機溶劑:極性溶劑,甲醇、乙醇、丙酮、丁醇。非極性溶劑,乙醚、氯仿、苯。選用有機溶劑,一般采用“相似相溶”原則。
采用有機溶劑,既能抑制微生物的生長和某些酶的作用,防止目的物降解失活,也能阻止大量無關(guān)蛋白質(zhì)的溶出,有利于進一步純化。第34頁,共80頁,2024年2月25日,星期天(2)液-液萃取概念:利用溶質(zhì)在兩個互不混溶的溶劑中溶解度的差異,將溶質(zhì)從一個溶劑相向另一個溶劑相轉(zhuǎn)移的操作。影響因素:
目的物在兩相的分配比(分配系數(shù)K);
有機溶劑的用量。
K增大,提取效率增大。
K值較小時,可以適當增加有機溶劑的用量,采用多次提取。第35頁,共80頁,2024年2月25日,星期天溶劑萃取的注意事項:
1.pH值,酸性物質(zhì)在酸性條件下萃取;堿性物質(zhì)在堿性條件下萃?。话被岬葍尚噪娊赓|(zhì),則采用在等電點進行提取。2.鹽析,在提取液中加入適量中性鹽,促使生化物質(zhì)轉(zhuǎn)入有機相,從而提高萃取率。并且,鹽析作用能減少有機溶劑在水中的溶解度,使提取液中的水分含量減少。3.溫度,室溫或低溫下操作。因為溫度升高,既使生物材料不穩(wěn)定,又易使有機溶劑揮發(fā)。
4.乳化,乳化層出現(xiàn)使有機相與水相分層困難。消除乳化的方法包括過濾、離心、輕輕攪動、改變兩相的比例、加熱、加電解質(zhì)(NaCl,NaOH,HCl)、加吸附劑(CaCO3)。第36頁,共80頁,2024年2月25日,星期天
液-液萃取時,溶劑的選擇:l
具有較高選擇性,即K值較大。l
在萃取后,溶質(zhì)與溶劑容易分離與回收。l
兩種溶劑的密度相差較大,以減少乳化作用。l
無毒,不易燃燒,價廉。
第37頁,共80頁,2024年2月25日,星期天超臨界萃取優(yōu)點:節(jié)能,可使用生理惰性溶劑在低溫下分離組分,有利于生物材料活性的保持,原理:在某一溫度和壓力時,氣體和液體的物理特性趨于相同,兩相變?yōu)橐幌?,此時就稱為臨界點。物質(zhì)的臨界點常數(shù)包括:臨界溫度、臨界壓力和臨界密度。對于CO2而言,分別為31.1℃、7.3Mpa和0.47g/mL。當溫度和壓力高于上述值時,物質(zhì)處于液體和氣體的中間狀態(tài),在這種狀態(tài)下的流體稱為超臨界流體。超臨界流體最常用的萃取劑是CO2。第38頁,共80頁,2024年2月25日,星期天超臨界流體的特性:它們的物理特性和傳質(zhì)特性介于液體和氣體之間,適于作為萃取溶劑。超臨界流體具有與液體同樣的凝集力,溶解力。超臨界流體的密度比氣體大得多,與液體較為接近,因此超臨界流體萃取具有很高的萃取速度。隨著溫度和壓力的連續(xù)變化,超臨界流體對物質(zhì)的萃取具有選擇性。萃取后易分離,其擴散系數(shù)接近于氣體,是通常液體的近百倍。超臨界流體的粘度大大低于液體的粘度,有利于物質(zhì)的擴散,節(jié)能效果明顯。超臨界流體的萃取過程:分為萃取階段和分離階段。第39頁,共80頁,2024年2月25日,星期天二、提取效率
任何提取的提取效率都不可能達到100%,無論采用什么提取方法,在生物材料中總要殘留部分目的物,殘留量的多少取決于所選擇的溶劑系統(tǒng)的種類、用量、提取次數(shù)及操作條件,它們的數(shù)量關(guān)系可以“殘留量公式”表示如下:
式中,X0為目的物總量,g;
K為目的物在固相/液相的分配系數(shù);
L為溶劑體積,ml;
W為生物材料重量,g;
n為提取次數(shù)。第40頁,共80頁,2024年2月25日,星期天由上式可見:1.
對于所選的溶劑系統(tǒng)而言,目的物在材料中的分配系數(shù)愈大,提取后的殘留物質(zhì)就愈多。2.
所用的溶劑愈多,殘留量愈少。3.
提取次數(shù)愈多,殘留量愈少。實際工作中,溶劑的用量與提取次數(shù)有一定的限制,一般生產(chǎn)上多用2-3次提取,溶劑用量為生物材料的2-5倍。第41頁,共80頁,2024年2月25日,星期天三、影響提取效率的因素1.
溫度大多數(shù)不耐熱的生物活性物質(zhì)一般在0-10℃進行提取。某些較耐熱的生化成分,如多糖類,可于50~90℃加熱提取。2.
酸堿度多數(shù)生化物質(zhì)在中性條件下較穩(wěn)定,所以提取用的溶劑系統(tǒng)一般pH值控制在4-9范圍內(nèi),并且注意避免在目的物的等電點附近進行提取。第42頁,共80頁,2024年2月25日,星期天3.
鹽濃度鹽離子的存在能減弱生物分子間離子鍵及氫鍵的作用力,稀鹽溶液對蛋白質(zhì)等生物大分子有助溶作用。鹽溶:一些不溶于純水的球蛋白在稀鹽中能增加溶解度,這是由于鹽離子作用于生物大分子表面,增加了表面電荷,使之極性增加,水合作用增強,促使形成穩(wěn)定的雙電層,此現(xiàn)象稱為“鹽溶”作用。常用的稀鹽提取液:
NaCl溶液(0.1-0.15mol/L);
磷酸鹽緩沖液(0.02-0.05mol/L);
焦磷酸鈉緩沖液(0.02-0.05mol/L);
醋酸鹽緩沖液(0.10-0.15mol/L);
檸檬酸緩沖液(0.02-0.05mol/L)。第43頁,共80頁,2024年2月25日,星期天
四、提取方法的選擇關(guān)鍵:針對生物材料和目的物的性質(zhì)選擇合適的溶劑系統(tǒng)與提取條件。重點了解目的物與主要雜質(zhì)在溶解度方面的差異以及它們的穩(wěn)定性。在提取過程中,盡量增加目的物的溶出度,盡可能減少雜質(zhì)的溶出度,同時重視生物材料及目的物在提取過程中的活性變化。第44頁,共80頁,2024年2月25日,星期天
活性物質(zhì)的保護措施1.
采用緩沖系統(tǒng)2.
添加保護劑——防止活性基團受破壞3.
抑制水解酶的作用4.
其他保護措施避免紫外光、強烈攪拌、過酸、過堿或高溫第45頁,共80頁,2024年2月25日,星期天第四節(jié)
生化物質(zhì)的分離純化方法一、
生物制藥中分離、制備方法的特點1.
生物材料組成復(fù)雜——無固定操作方法可循;2.
含量極微——分離操作步驟多,不易獲得高收率;3.
活性成分離開生物體后,易變性,破壞——分離進程必須十分小心;4.
分離幾乎都在溶液中進行——按經(jīng)驗進行,嚴格控制;5.
分離多采用溫和的“多階式”方式進行,即“逐級分離”。操作時間長,手續(xù)繁瑣。6.生物產(chǎn)品最后均一性的評估,要采用多種方法。
第46頁,共80頁,2024年2月25日,星期天二、
生物制藥中分離制備方法的基本原理1.
根據(jù)分子形狀和大小不同進行分離,如差速離心、超離心、膜分離、超濾、凝膠過濾;2.
根據(jù)分子電離性質(zhì)(帶電性)的差異,如離子交換、電泳、等電聚焦;3.
根據(jù)分子極性大小及溶解度不同,如溶劑提取法、逆流分配、分配層析、鹽析、等電點沉淀、有機溶劑分級沉淀;4.
根據(jù)物質(zhì)吸附性質(zhì)的不同,如選擇性吸附與吸附層析;5.
根據(jù)配體特異性,如親和層析。第47頁,共80頁,2024年2月25日,星期天三、
生物制藥中常用的分離純化方法1.
鹽析法;2.
有機溶劑沉淀法;3.
等電點沉淀法;4.
膜分離法;5.
離子交換層析;6.凝膠層析;7.親和層析。第48頁,共80頁,2024年2月25日,星期天1、鹽析法利用不同的蛋白質(zhì)在高濃度鹽溶液中,溶解度不同程度的降低來進行分離純化。在低鹽濃度下,溶解度隨著鹽濃度升高而增加,稱鹽溶作用;當鹽濃度不斷升高時,不同蛋白質(zhì)的溶解度又以不同程度下降并先后析出沉淀,稱鹽析作用。
優(yōu)點:設(shè)備和條件要求低,安全應(yīng)用范圍廣泛。在高鹽情況下,蛋白質(zhì)不易發(fā)生變化,一般在室溫下操作。
缺點:分級分離能力不高。
常用的中性鹽:硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉。
第49頁,共80頁,2024年2月25日,星期天鹽析時應(yīng)注意的幾個問題:(1)鹽飽和度:由于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)不同,鹽析要求的飽和度也不同。要按工藝要求,正確計算飽和度。(2)pH值的選擇:蛋白質(zhì)在pI時的溶解度最小。因此,進行鹽析時的pH,要選擇在被分離蛋白質(zhì)的pI附近。(3)蛋白質(zhì)濃度:在相同條件下,蛋白質(zhì)濃度越大越易沉淀,使用鹽的飽和度極限也愈低。蛋白質(zhì)濃度愈高,其他蛋白質(zhì)共沉作用也愈強,這是不希望的。選擇適當?shù)牡鞍踪|(zhì)濃度,可避免共沉的干擾。第50頁,共80頁,2024年2月25日,星期天
(4)溫度:一般在室溫下進行,濃鹽對蛋白質(zhì)有保護作用。但對溫度敏感的,要在低溫下進行。
常在0-4℃范圍內(nèi)迅速操作。如尿激酶。(5)鹽析沉淀物的脫鹽:鹽析的沉淀分離后,經(jīng)脫鹽才能獲得純品。最常用的脫鹽方法是透析,時間一般較長,應(yīng)常換透析液,注意防止污染。第51頁,共80頁,2024年2月25日,星期天
2、有機溶劑沉淀法利用不同蛋白質(zhì)在不同濃度的有機溶劑中的溶解度差異而分離目的蛋白質(zhì)的方法。蛋白質(zhì)的沉淀與溶解,與溶劑的介電常數(shù)有關(guān)。降低溶液的介電常數(shù),使其溶解度變小,同時,還破壞蛋白質(zhì)的水化膜而使蛋白質(zhì)沉淀析出。
第52頁,共80頁,2024年2月25日,星期天幾種溶劑的介電常數(shù)溶劑名稱20℃時的介電常數(shù)溶劑名稱20℃時的介電常數(shù)乙醚4.33甲醇33
丙酮21.4水80
乙醇242.5mol/L甘氨酸水溶液137介電常數(shù)與靜電力的關(guān)系:F=Q1Q2/Kr2
式中:K—介電常數(shù)。指帶相反電荷的微粒之間的靜電引力。
F—相距為r的2個帶電量分別為Q1、Q2點電荷相互作用的靜電引力。經(jīng)驗:如30-40%乙醇沉淀的物質(zhì),改用丙酮時,其體積分數(shù)可減少10%左右。即可用20—30%的丙酮;而70-80%乙醇沉淀的物質(zhì),可用50—60%的丙酮即可。注:水有較高的介電常數(shù),具有很好的溶劑性能,是一種廣譜溶劑。有機溶劑法比鹽析法分辨力強,沉淀也好過濾,易干燥,但對有些生物活性物質(zhì)能引起失活和變性。應(yīng)用時還要注意揮發(fā)和火災(zāi)等。第53頁,共80頁,2024年2月25日,星期天有機沉淀法應(yīng)注意的問題:
(1)控制工藝過程的溫度:整個操作過程應(yīng)在低溫下進行,而且最好是同一溫度。(2)防止溶劑局部濃度過高:加入有機溶劑時攪拌要均勻,速度要適當,避免局部濃度過高,引起沉淀物的破壞、變性或失活。(3)及時處理沉淀物:沉淀物經(jīng)過濾或離心后,要立即用水或緩沖液溶解,降低有機溶劑的濃度。(4)pH的選擇:在待沉淀蛋白質(zhì)的pI附近。(5)有機溶劑是酶和蛋白質(zhì)的變性因素,尤其是對敏感酶類。第54頁,共80頁,2024年2月25日,星期天3、等電點沉淀法利用蛋白質(zhì)在等電點時的溶解度最低,而各種蛋白質(zhì)又具有不同的等電點的特性進行分離的工藝過程。由于各種蛋白質(zhì)在等電點時,仍有一定的溶解度而沉淀不完全,多數(shù)蛋白質(zhì)的等電點又都十分接近,所以單獨使用效果不理想,分辨力差,多用于提取后除雜蛋白。實際生產(chǎn)中常與有機溶劑沉淀法、鹽析法聯(lián)合使用。第55頁,共80頁,2024年2月25日,星期天4、膜分離法膜分離技術(shù)包括超濾、反滲透析、電滲析、微孔過濾、氣體滲析和超精密過濾。
(1)超濾:根據(jù)溶質(zhì)分子和懸浮粒子是否通過多孔膜來進行篩分。在液壓的驅(qū)動下,能通過超濾膜的分離粒子的范圍,一般在0.001—0.01μm。即利用一種特制的膜對溶液中的各種溶質(zhì)分子進行選擇性過濾。優(yōu)點:成本低、操作方便、條件溫和、能較好地保持藥物活性、回收率高。適用于酶和蛋白質(zhì)藥物的分離、濃縮、脫鹽、提純、除菌、除病毒和熱原。
第56頁,共80頁,2024年2月25日,星期天(2)反滲透:以高分子透過性薄膜為分離介質(zhì),在超過溶液滲透壓力的情況下,使溶液中的溶劑透過薄膜,同時使溶質(zhì)和不溶物阻截在膜前。這一過程類似于滲透,但方向相反,即溶劑從高濃度一側(cè)傳遞到濃度低的一側(cè),故稱反滲透。特點:能耗少,體積小,適應(yīng)大規(guī)模生產(chǎn)。(3)微孔濾膜:由高分子材料制成的薄膜過濾介質(zhì),可以過濾一般介質(zhì)不能截留的細菌和微粒。膜的孔徑在0.2-10μm。(4)超精密過濾:以聚乙烯醇為主體的中空多孔濾膜,分級性能在超濾膜與微孔濾膜之間。為0.01-0.2μm。用于水的精制、循環(huán)水的凈化、除懸浮固體粒子以及糖液、酶液的精制。第57頁,共80頁,2024年2月25日,星期天5、離子交換層析采用不溶性高分子化合物作為離子交換劑,分離純化各種生化物質(zhì)?;驹恚弘x子交換樹脂在水中能溶脹,溶脹后,其分子中的極性基團(活性基團),具有可擴散的離子,能與溶液中的離子起交換作用;非極性基團作為樹脂的骨架,使樹脂不溶于水并具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),為離子交換的進行及溶液和樹脂的分離創(chuàng)造了條件。離子交換層析包括吸附、吸收、穿透、擴散、離子交換、離子親和力等物理化學(xué)過程。
第58頁,共80頁,2024年2月25日,星期天樹脂種類和理化性能:
(1)強酸性陽離子交換樹脂:功能團為磺酸基,pH一般沒有限制。(2)弱酸性陽離子交換樹脂:功能團為羧基、酚基。在酸性溶液中不發(fā)生交換,pH愈大交換能力愈強。(3)強堿性陰離子交換樹脂:功能團為三甲基季胺基團。pH沒有限制。(4)弱堿性陰離子交換樹脂:功能團為伯胺基、仲胺基、叔胺基。pH愈低交換能力愈大。第59頁,共80頁,2024年2月25日,星期天
影響交換速度的因素:(1)樹脂顆粒的大小:顆粒小,表面積大,能促進內(nèi)部和外部擴散。(2)攪拌和流速:加快攪拌速度或加大液體流速,都能減少樹脂外液膜的厚度,從而使液相擴散速度增加。(3)離子濃度:交換速度隨離子濃度的上升而增加,達到一定濃度后交換速度不再升高。(4)離子的水化半徑:水化半徑小的易被吸附。(5)樹脂酸堿性的強弱和溶液的pH:(6)交聯(lián)度大?。航宦?lián)度愈小,樹脂愈易膨脹,交換速度愈快。但交聯(lián)度小的樹脂選擇性較差。(7)有機溶劑的影響:當有有機溶劑存在時,會降低樹脂對有機離子的選擇性,而容易吸附無機離子。
第60頁,共80頁,2024年2月25日,星期天6、凝膠層析指化合物隨流動相流經(jīng)裝有凝膠的固定相的層析柱時,因其各種物質(zhì)分子大小不同而被分離的技術(shù)。又稱凝膠過濾、凝膠滲透過濾、分子篩過濾、阻滯擴散層析、排阻層析。
優(yōu)點:設(shè)備簡單,操作方便,分離效果好,回收率高,分離條件緩和,不使活性物質(zhì)失活變性,凝膠可重復(fù)使用,無需再生處理。
缺點:分離速度慢。廣泛用于分離氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、酶及多糖等藥物。第61頁,共80頁,2024年2月25日,星期天幾種常用的凝膠:
(1)葡聚糖凝膠:基本骨架是1-6糖苷鍵。由葡聚糖和甘油以醚橋形式交聯(lián)而成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。最著名的商品為Sephadex葡聚糖凝膠,珠狀顆粒物,化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,不溶于水、弱酸、堿和鹽溶液。低溫時,在0.1mol/L鹽酸中保持1-2h不改變性質(zhì);室溫時,在0.01mol/L鹽酸中放置半年也不改變;在0.25mol/L的氫氧化鈉中,60℃
兩個月沒有發(fā)改變??稍?20℃
加熱30min滅菌而不破壞,但高于120℃
即變黃。濕狀貯存易發(fā)霉,若長期不用,需加防腐劑。
第62頁,共80頁,2024年2月25日,星期天(2)聚丙烯酰胺凝膠:由碳-碳骨架構(gòu)成。完全為惰性。穩(wěn)定性比葡聚糖凝膠好,洗脫時不會有凝膠物質(zhì)下來。缺點:不耐酸。遇酸時酰胺鍵會水解為羧基,使凝膠帶有一定的離子交換基團。(3)瓊脂糖凝膠:天然凝膠,不是共價交聯(lián),是以氫鍵交聯(lián)??障抖纫云跫?zhí)堑臐舛葋砀淖?,化學(xué)穩(wěn)定性不如葡聚糖凝膠。沒有干凝膠,必須在溶脹狀態(tài)保存,遇脫水劑、冷凍和一些有機溶劑即破壞,丙酮和乙醇對它無影響。在pH4.5-9,溫度0-40℃穩(wěn)定。對硼酸有吸附,不能用硼酸緩沖液。能分離幾萬到幾千萬相對分子質(zhì)量的物質(zhì),彌補了葡聚糖和聚丙烯酰胺凝膠的不足。瑞典商品名Sepharose,美國稱Bio-GelA,英國稱Sagavac.
(4)疏水性凝膠:常用的為聚甲基丙烯酸酯(Polymethacrylate)凝膠、聚苯乙烯凝膠(如Styrogel,Bio-Beads-S)第63頁,共80頁,2024年2月25日,星期天7、親和層析生物活性物質(zhì)都有親和作用,如酶與底物、激素與受體、核酸的互補鏈間,多糖與蛋白質(zhì)復(fù)合體。親和層析是利用生物大分子的特異親和力而設(shè)計的層析技術(shù)??赡娼Y(jié)合的特異性物質(zhì)稱為配基,與配基結(jié)合的層析介質(zhì)稱為載體。親和層析能從粗提液中,通過一次簡便處理,便可得到高純度的活性物質(zhì),既可分離一些生物材料中含量極微的物質(zhì),又能分離一些性質(zhì)十分相似的物質(zhì)。優(yōu)點:設(shè)備要求不高,操作簡便,適用范圍廣,特異性強,分離速度快,效果好,條件溫和。缺點:通用性較差,洗脫條件要求苛刻。
第64頁,共80頁,2024年2月25日,星期天幾種常用的載體:
(1)纖維素:自然界中數(shù)量最大的大分子生物材料,取材十分方便。但由于其結(jié)構(gòu)緊密、均一性差,不利于大分子的滲入?;罨蟪в须姾桑翘禺愋晕捷^強,加上空間位阻等原因,其應(yīng)用不如凝膠載體廣泛。目前主要用于分離與核酸有關(guān)的物質(zhì)。如用寡聚脫氧胸腺核苷酸纖維素作固定相分離細胞提取液中的mRNA.市售商品有:無定型微纖維、微晶纖維素、珠狀纖維素。第65頁,共80頁,2024年2月25日,星期天(2)瓊脂糖凝膠:用于親和層析的主要為交聯(lián)珠狀凝膠。其瓊脂糖的質(zhì)量濃度為20g/L(2%)、40g/L(4%)、60g/L(6%)幾種,相應(yīng)的商品稱為Sepharose2B、4B、6B(Pharmacia)和UltrogelsA-2,A-4,A-6)。這類載體能使吸附物質(zhì)保持活性,能迅速活化并接上各種功能基團,結(jié)構(gòu)疏松孔徑大,流速快。(3)葡聚糖凝膠:與瓊脂糖凝膠相比孔徑太小,特別是經(jīng)配基偶聯(lián)后,凝膠膨脹度會進一步變小,所以應(yīng)用受到限制。(4)聚丙烯酰胺凝膠:碳-碳骨架,有丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成,具有網(wǎng)狀三維空間結(jié)構(gòu)。商品名為BiogelP。注意避免接觸強氧化劑,配基偶聯(lián)后會使它的網(wǎng)格縮小,在一定程度上限制了它的應(yīng)用。
第66頁,共80頁,2024年2月25日,星期天(5)多孔玻璃珠:化學(xué)和物理穩(wěn)定性好,機械強度高,不但能抵御酶及微生物的作用,還能耐受高溫滅菌和較劇烈的反應(yīng)條件。缺點:親水性不強,對蛋白質(zhì)尤其是堿性蛋白質(zhì)有非特異性吸附,而且可供連接的化學(xué)活性基團也少。改良方法:為了克服其缺點,市售Bio-Glass的商品都已事先連接了氨烷基(烷基胺)。用葡聚糖包被玻璃珠,則可改善其親水性,并增加化學(xué)活性基團。用抗原涂布的玻璃珠已成功地分離了免疫淋巴細胞,在DNA連接的玻璃珠上純化了大腸桿菌的DNA和RNA聚合酶。
第67頁,共80頁,2024年2月25日,星期天(6)其他載體:由聚丙烯酰胺和瓊脂糖混合組成的載體,商品名為UltrogelsACA。它的特點是載體上既有羥基又有酰胺基,并且都能與配基單獨作用。但不能接觸強堿,以免酰胺水解,使用溫度不超過40oC。在丙烯酰胺和瓊脂糖的混合膠中加入7%的四氧化三鐵,則可制得一種稱為磁性膠(MagnogelsACA44)的載體。當懸浮液中含有不均勻粒子時,依靠磁性能將載體與其他粒子分離。磁性膠載體常用于酶的免疫測定、熒光免疫測定、放射免疫測定、免疫吸收劑和細胞分離等的微量測定和制備。
第68頁,共80頁,2024年2月25日,星期天影響吸附親和力的幾個因素(吳梧桐P284):
(1)配基濃度;(2)空間障礙;(3)配基與載體的結(jié)合位點;(4)載體的孔徑;(5)微環(huán)境(化學(xué)因素),包括載體及“手臂”的電性、極性、次級鍵對配基親和力的影響。第69頁,共80頁,2024年2
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