探討不同來源的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞體外抗腫瘤作用的比較研究

探討不同來源的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞體外抗腫瘤作用的比較研究胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokineinducedkillercells，CIK)是一群異質(zhì)性的具有抗腫瘤作用的細(xì)胞。CIK細(xì)胞主要表達(dá)CD3和CD56，抗腫瘤活性強(qiáng)，增殖迅速。用患者自身PBMC誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞已經(jīng)顯示良好的臨床療效，尤其對慢性髓系白血病、肝癌、結(jié)直腸癌、腎癌、肺癌、乳腺癌等。但是腫瘤患者在經(jīng)歷了放化療后，經(jīng)常出現(xiàn)白細(xì)胞減少、貧血等癥狀。尤其晚期惡性腫瘤患者每毫升外周血中單核細(xì)胞的數(shù)量也較正常人少。因此為了減輕患者負(fù)擔(dān)，提高臨床療效，本研究比較了來自健康捐助者的臍血CIK細(xì)胞和來自肺癌患者外周血的CIK細(xì)胞在體外的抗腫瘤作用，并初步探討了其機(jī)制上的差異，以尋找更有效可行的CIK治療方法。

1材料與方法

1.1材料來源

白血病細(xì)胞系K562和肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549由吉林省腫瘤防治研究所常規(guī)傳代培養(yǎng)。Recombinanthumaninterleukin(IL)-2、IFN-γ、CD3-mAb(OKT-3)、IL-1α購自Biolegend。PI、anti-CD3-ECD、anti-CD56-PC5、anti-CD8-PC5、antiCD3-FITC、anti-CD8-FITC及相應(yīng)的同型對照抗體均購自貝克曼庫爾特公司。5，6-carboxyfluoresceindiacetatesuccinimidyester(CFSE)購自MolecularProbes。AnnexinVapoptosiskit購自BD公司。MonensinSolution(BioLegend，Cat.420701)。PEanti-humanCD107a(Lysosome-AssociatedMembraneProtein1，LAMP-1，BioLegend，Cat.328608，Clone:H4A3)。CCK-8購自碧云天生物技術(shù)公司。

1.2方法

1.2.1誘導(dǎo)培養(yǎng)CIK細(xì)胞肺癌患者外周血(4份，

10mL/份)來自吉林省腫瘤醫(yī)院住院患者(2014年8月～2015年8月);4份臍血(10mL/份)來自吉林省婦幼保健院(2014年8月～2015年8月)。血液樣本分別經(jīng)紅細(xì)胞裂解液處理后，獲得的細(xì)胞被培養(yǎng)在IMDM培養(yǎng)基中(10%FCS，37℃，5%CO2飽和濕度)，細(xì)胞濃度(1～2)×106/mL。培養(yǎng)24h后，加入1000U/mLIFN-γ，CD3-mAb(50ng/mL)，IL-2(300U/mL)，IL-1α(100U/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)并每3天半量換液或擴(kuò)瓶1次，同時補(bǔ)加IL-2(300U/mL)。在培養(yǎng)的第14天和第21天收獲細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測分析(BeckmanCoulterEpicsXL-MCL)細(xì)胞表型，即CD3+CD56+、CD3+CD8+細(xì)胞百分率。

1.2.2CIK細(xì)胞增殖實驗采用CCK-8染色法檢測誘導(dǎo)培養(yǎng)21d的臍血CIK細(xì)胞和來自肺癌患者外周血的CIK細(xì)胞的增殖率。調(diào)整CIK細(xì)胞的初始密度為5×104/mL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天擴(kuò)瓶1次，CCK-8染色，酶標(biāo)儀檢測(490nm)，直到第21天，計算增殖率并分析比較實驗結(jié)果。

1.2.3CIK細(xì)胞體外抗腫瘤活性實驗(流式細(xì)胞儀法)

標(biāo)記靶細(xì)胞：A549和K562細(xì)胞用PBS洗1遍，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×106/mL，CFSE(2.5μmol/L)標(biāo)記細(xì)胞，37℃孵育8min，PBS洗細(xì)胞1次，加入1mLIMDM(含10%FCS)，室溫避光孵育10min，再加入PBS洗細(xì)胞1次備用。標(biāo)記效應(yīng)細(xì)胞：調(diào)整CIK細(xì)胞濃度為1×106/100μL，標(biāo)記用CD3、CD8和CD56抗體，室溫避光孵育30min，細(xì)胞用PBS洗1次備用。調(diào)整靶細(xì)胞密度為5×104/mL，設(shè)置不同的效靶比，分別為1∶1、5∶1、10∶1，相應(yīng)的CIK效應(yīng)細(xì)胞濃度分別為5×104/mL、25×104/mL、50×104/mL，分別設(shè)單獨的靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞對照，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，PI染色，流式細(xì)胞儀檢測分析。

1.2.4CIK細(xì)胞體外抗腫瘤活性實驗(MTT法)按上述同樣的效靶比將細(xì)胞接種于96孔板中，靶細(xì)胞濃度為2×104/孔，37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，加入CIK細(xì)胞，MTT法檢測CIK對靶細(xì)胞的殺傷效率。酶標(biāo)儀檢測490nm處吸光度(A)值。抑制率(%)=[1-(實驗組A值-CIK細(xì)胞A值)/腫瘤細(xì)胞A值]×100%。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1檢測CIK細(xì)胞CD107a表達(dá)調(diào)整CIK細(xì)胞濃

度為1×106/100μL，加入CD107a-PE(10μL)，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h后，加入Monensin，將效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞按10∶1的效靶比混合，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4h，PBS洗細(xì)胞1次，標(biāo)記細(xì)胞用相應(yīng)的CD3、CD8和CD56抗體，2%多聚甲醛固定細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測分析。實驗設(shè)陰性對照(單獨CIK組)以控制自發(fā)產(chǎn)生的CD107a。

1.3.2細(xì)胞因子的檢測按前述方法將10∶1混合的效靶細(xì)胞(A549)培養(yǎng)24h后，ELISA法檢測培養(yǎng)上清中IFN-γ和TNF-α表達(dá)。

1.3.3細(xì)胞凋亡實驗按前述方法將10∶1混合的效靶細(xì)胞(K562)培養(yǎng)24h后，收集細(xì)胞，AnnexinV/PI染色，流式細(xì)胞儀檢測分析，每個樣本收集10000個細(xì)胞。數(shù)據(jù)分析采用CoulterEXPO32v1.2軟件。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件，計量資料以(x±s)表示，組間比較采用方差分析、t檢驗及配對t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1流式細(xì)胞術(shù)檢測誘導(dǎo)培養(yǎng)的CIK細(xì)胞表型來自肺癌患者外周血和臍血的CIK細(xì)胞在誘導(dǎo)培養(yǎng)的第14天和第21天的細(xì)胞表型檢測結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)的延長，CD3+細(xì)胞、CD3+CD56+和CD3+CD8+細(xì)胞百分比升高。培養(yǎng)第14天時，來自肺癌患者外周血CIK細(xì)胞的CD3+細(xì)胞、CD3+CD8+和CD3+CD56+細(xì)胞百分比分別為(86.00±5.25)%、(66.88±2.56)%、(14.90±5.79)%;臍血CIK細(xì)胞的CD3+細(xì)胞、CD3+CD8+和CD3+CD56+細(xì)胞百分比分別為(90.68±1.77)%、(69.00±7.60)%、(20.13±3.09)%。培養(yǎng)第21天時，來自肺癌患者外周血CIK細(xì)胞的CD3+細(xì)胞、CD3+CD8+和CD3+CD56+細(xì)胞百分比分別為(91.13±5.48)%、(70.58±2.49)%、(14.98±5.53)%;臍血CIK細(xì)胞的CD3+細(xì)胞、CD3+CD8+和CD3+CD56+細(xì)胞百分比分別為(96.83±1.18)%、(76.15±5.78)%、(21.35±2.70)%。雖然臍血CIK細(xì)胞的CD3+、CD3+CD8+和CD3+CD56+細(xì)胞百分比高于肺癌患者外周血來源的CIK細(xì)胞，但二者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(CD3+細(xì)胞百分比：P=0.1348;CD3+CD8+細(xì)胞百分比：P=0.0836);CD3+CD56+細(xì)胞百分比：P=0.1269。

2.2CIK細(xì)胞增殖實驗結(jié)果

本研究使用CCK-8染色實驗檢測CIK細(xì)胞的增殖能力，培養(yǎng)21d的肺癌患者外周血和臍血來源的CIK細(xì)胞增殖率分別為(185.76±39.68)%、(254.32±74.60)%，二者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0012)。

2.3CIK細(xì)胞體外抗腫瘤活性實驗(流式細(xì)胞儀法)結(jié)果

CIK細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共孵育后，CIK細(xì)胞表面CD3、CD8、CD56的表達(dá)率與單獨CIK對照組相比沒有發(fā)生明顯變化。以死亡的靶細(xì)胞標(biāo)記為CFSE+PI+為依據(jù)，進(jìn)一步比較來自肺癌患者和臍血的CIK細(xì)胞的抗腫瘤活性，結(jié)果表明，二者對A549和K562細(xì)胞均有抑制作用，來自臍血的CIK細(xì)胞有更強(qiáng)的抗腫瘤作用。

2.4CIK細(xì)胞體外抗腫瘤活性實驗(MTT法)結(jié)果根據(jù)公式計算來自肺癌患者外周血和臍血的CIK細(xì)胞對A549和K562細(xì)胞的體外生長抑制率，結(jié)果顯示腫瘤患者自體CIK細(xì)胞和臍血CIK細(xì)胞均有不同程度的抗腫瘤效應(yīng)且隨效靶比的升高而增加;效靶比相同時，臍血CIK細(xì)胞的體外抑瘤活性高于來自肺癌患者的CIK細(xì)胞。2.5檢測CIK細(xì)胞CD107a表達(dá)實驗結(jié)果本研究通過檢測CD107a的表達(dá)來間接說明CIK細(xì)胞的細(xì)胞毒性功能，實驗結(jié)果表明，臍血CIK細(xì)胞CD107a表達(dá)高于來自肺癌患者外周血的CIK細(xì)胞(圖4)。2.6檢測CIK細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子ELISA法檢測CIK細(xì)胞分泌的IFN-γ和TNF-α，臍血CIK和肺癌患者CIK分泌IFN-γ分別為(185.25±30.45)pg/mL和(148.72±35.83)pg/mL，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0352);TNF-α分別為(20.85±4.58)pg/mL和(14.88±3.32)pg/mL，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0389)。

2.7流式檢測腫瘤細(xì)胞凋亡實驗結(jié)果

本研究用AnnexinV/PI雙染色檢測來自肺癌患者外周血來源的CIK細(xì)胞和臍血CIK細(xì)胞對K562細(xì)胞凋亡的影響。臍血CIK細(xì)胞誘導(dǎo)的K562細(xì)胞凋亡的百分率[AnnexinV+PI-細(xì)胞：(25.30±4.87)%]高于肺癌患者的CIK細(xì)胞[AnnexinV+PI-細(xì)胞：(19.87±5.41)%]，但是統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示二者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.2658)。

3討論

細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)臨床治療惡性腫瘤的安全性和可行性已被很多基礎(chǔ)和臨床試驗確認(rèn)。CIK細(xì)胞是異質(zhì)性的細(xì)胞群體，包括CD3+CD56+、CD3+CD56-、CD3-CD56+細(xì)胞群，其中CD3+CD56+細(xì)胞來自CD3+CD56-T細(xì)胞，主要負(fù)責(zé)非主要組織相容性復(fù)合體(MHC)限制性的抗腫瘤活性。體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的CIK細(xì)胞是單個核細(xì)胞在CD3單抗和多種細(xì)胞因子(包括IFN-γ、IL-2等)作用下產(chǎn)生的一群以CD3+CD56+細(xì)胞為主要效應(yīng)細(xì)胞的異質(zhì)細(xì)胞群，既具有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗腫瘤活性，又具有NK細(xì)胞的非MHC限制性腫瘤殺傷能力，殺瘤活性高、殺瘤譜廣。目前，對于CIK細(xì)胞大規(guī)模制備應(yīng)用和總體療效的評估已經(jīng)達(dá)成一定的共識。本研究在前人經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，比較了來自臍血和肺癌患者外周血來源的CIK細(xì)胞體外抗腫瘤作用及機(jī)制的差異，以期為CIK細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供更多的實驗依據(jù)。本研究實驗結(jié)果表明，與肺癌患者CIK細(xì)胞相比，臍血來源的CIK細(xì)胞表達(dá)CD3+CD56+、CD3+CD8+的比例更高，具有明顯增強(qiáng)的抗腫瘤作用和增殖能力，同時伴隨增加分泌IFN-γ、TNF-α。IFN-γ能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫力，抑制病毒復(fù)制，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖;TNF-α除能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡之外，還能夠促進(jìn)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的分化以及其他效應(yīng)因子，如IL-2、IFN-γ等的產(chǎn)生。CIK細(xì)胞的抗腫瘤機(jī)制主要通過效靶細(xì)胞的接觸，CIK細(xì)胞表面的黏附分子，白細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1(leukocytefunction-associatedantigen-1，LFA-1)與腫瘤細(xì)胞表達(dá)的LFA-1配體結(jié)合，導(dǎo)致對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用;CIK細(xì)胞活化的信號通路主要涉及NK細(xì)胞受體與腫瘤細(xì)胞表達(dá)的配體的結(jié)合和被活化，最終導(dǎo)致對腫瘤細(xì)胞的脫顆粒和細(xì)胞毒性;此外，CIK細(xì)胞由Fas配體通過Fas信號通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。效-靶細(xì)胞接觸后，微管的極化運動會將溶解性顆粒運輸?shù)郊?xì)胞之間的免疫突觸中。顆粒一旦到達(dá)效應(yīng)細(xì)胞的質(zhì)膜，質(zhì)膜就會溶解，顆粒即被釋放到免疫突觸中，最終導(dǎo)致靶細(xì)胞死亡。CD107a(LAMP-1)、CD107b(LAMP-2)是溶酶體相關(guān)膜糖蛋白(LAMPs)。效應(yīng)細(xì)胞的脫顆粒作用導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞毒性顆粒膜上存在的CD107a和b暴露在細(xì)胞表面，這一過程與細(xì)胞內(nèi)穿孔素的流失相關(guān)，也與細(xì)胞內(nèi)IFN-γ的產(chǎn)生相關(guān)。因此檢測CD107a和CD107b的表達(dá)可以更全面的分析CIK細(xì)胞的功能。本研究的結(jié)果證實了臍血CIK細(xì)胞CD107a的表達(dá)高于來自肺癌患者外周血的CIK細(xì)胞。

目前流式檢測技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)實驗和臨床研究，使用流式細(xì)胞儀可以檢測單個細(xì)胞水平的