豬偽狂犬病免疫酶試驗方法

1本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬偽狂犬病E糖蛋白(gE,即gpI)酶聯(lián)免疫吸附試驗和免疫酶組織化學(xué)試驗方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于檢測豬血清中的豬偽狂犬病病毒gE特異性抗體和組織中的豬偽狂犬病病毒抗原。2E糖蛋白酶聯(lián)免疫吸附試驗(gE-ELISA)2.1材料準(zhǔn)備a)ELISA抗原包被板；b)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清：偽狂犬病病毒gE單克隆抗體；c)標(biāo)準(zhǔn)陰性血清：無偽狂犬病病毒gE抗體的豬血清；d)酶結(jié)合物：辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗偽狂犬病病毒gE單克隆抗體；e)磷酸鹽緩沖液(PBS):配制見第A.1章；f)洗滌液：配制見第A.2章；g)樣品稀釋液：配制見第A.3章；h)底物溶液：配制見第A.5章；i)終止液：配制見第A.6章。2.1.2器材a)酶聯(lián)檢測儀；c)37℃恒溫培養(yǎng)箱。采集被檢豬血液，分離血清，血清應(yīng)新鮮、透明、不溶血、無污染，密裝于滅菌小瓶內(nèi)，4℃或-30℃保存或立即送檢。試驗前將被檢血清統(tǒng)一編號，并用樣品稀釋液作2倍稀釋。2.2操作方法2.2.1取出包被板，并將樣品位置準(zhǔn)確記錄在記錄單上。2.2.2向A?、A?、A?孔中分別加入100μL未經(jīng)稀釋的陰性對照血清，A、、As、A?孔中分別加入100μL未經(jīng)稀釋的陽性對照血清，其他各孔加入100μL稀釋好的待檢樣品。2.2.4棄去孔內(nèi)液體，再在紗布或吸水紙上拍干。2.2.5用洗滌液將反應(yīng)板洗滌(3～5)次，每次洗滌后均棄去孔內(nèi)液體。最后一次洗滌后，除凈孔內(nèi)液2.2.6每孔加入100μL酶結(jié)合物溶液，室溫下作用20min。2.2.7重復(fù)2.2.4和2.2.5。2.2.8各孔加入100μL底物液。2.2.9室溫放置15min。2.2.10各孔加入50μL終止液，立即用酶標(biāo)儀于650nm測定各孔吸光度(OD)值。2.3結(jié)果判定2.3.1只有在陰性對照OD值的均值減去陽性對照OD值的均值大于等于0.3時，試驗成立。22.3.2待檢樣品是否含有針對gE抗原的抗體取決于每個樣品的S/N值，S/N等于樣品OD值除以陰性對照OD均值。2.3.2.1如果樣品的S/N值小于等于0.6,表明血清中含偽狂犬病病毒gE抗體。2.3.2.2如果S/N值大于0.6、小于等于0.7,應(yīng)重新檢測樣品。如仍得到相同的結(jié)果，三周后應(yīng)重新采樣檢測。2.3.2.3如果S/N值大于0.7,表明血清中無gE抗體。3免疫酶組織化學(xué)法3.1材料準(zhǔn)備a)磷酸鹽緩沖液(PBS):配制見第A.1章；b)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清：偽狂犬病病毒實驗感染豬制備的血清；c)標(biāo)準(zhǔn)陰性血清：無偽狂犬病病毒感染、未經(jīng)免疫的豬血清；d)酶結(jié)合物：HRP標(biāo)記的SPA;e)底物溶液：配制見第A.7章；f)過氧化氫甲醇溶液：配制見第A.8章；g)鹽酸酒精溶液：配制見第A.9章；h)胰蛋白酶溶液：配制見第A.10章。a)普通光學(xué)顯微鏡；c)石蠟切片機或冷凍切片機；d)載玻片及蓋玻片；e)37℃恒溫培養(yǎng)箱或水浴箱。對疑似偽狂犬病的病死豬或撲殺豬，立即采集肺、扁桃體和腦等組織數(shù)小塊，置冰瓶內(nèi)立即送檢。不能立即送檢者，將組織塊切成1cm×1cm左右大小，置體積分數(shù)為10%的福爾馬林溶液中固定，保3.2操作方法3.2.1新鮮組織按常規(guī)方法制備冰凍切片。冰凍切片風(fēng)于后用丙酮固定10min～15min;新鮮組織或固定組織按常規(guī)方法制備石蠟切片，常規(guī)脫蠟至PBS(切片應(yīng)用白膠或鉻礬明膠做粘合劑，以防脫片)。3.2.2去內(nèi)源酶：用過氧化氫甲醇溶液或鹽酸酒精溶液37℃作用20min。3.2.3胰蛋白酶消化：室溫下，用胰蛋白酶溶液消化處理2min,以便充分暴露抗原。3.2.4漂洗：PBS漂洗三次，每次5min。3.2.5封閉：滴加體積分數(shù)為5%的新生牛血清或1:10稀釋的正常馬血清，37℃濕盒中作用30min。3.2.6加適當(dāng)稀釋的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清或標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，37℃濕盒中作用1h或37℃濕盒中作用30min后4℃過夜。3.2.7漂洗同3.2.4.3.2.8加適當(dāng)稀釋的酶結(jié)合物，37℃濕盒作用1h。3.2.9漂洗同3.2.4.3.2.10底物顯色：新鮮配制的底物溶液顯色5min～10min后漂洗。3.2.11襯染：蘇木素或甲基綠襯染細胞核或細胞質(zhì)。3.2.12從90%乙醇開始脫水、透明、封片，普通光學(xué)顯微鏡觀察。33.2.13試驗同時設(shè)陽性對照和陰性對照。3.3結(jié)果判定陽性和陰性對照片本底清晰，背景無非特異著染，陽性對照組織細胞胞核呈黃色至棕褐色著染，試驗成立；被檢組織細胞胞核、偶見胞漿呈黃色至棕褐色著染，即可判為偽在犬病病毒抗原陽性。4(規(guī)范性附錄)A.1磷酸鹽緩沖液(PBS,0.01mol/LpH7.4)氯化鈉8g磷酸二氫鉀0.2g十二水磷酸氫二鈉2.83g蒸餾水加至1000mLA.2洗滌液吐溫-200.5mLA.3樣品稀釋液含體積分數(shù)為10%新生牛血清的洗滌液。A.4磷酸鹽-檸檬酸緩沖液(pH5.0)檸檬酸3.26g十二水磷酸氫二鈉12.9gA.5gE-ELISA底物溶液用二甲基亞砜將3'3'5'5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)配成1%質(zhì)量濃度，4℃保存。使用時按下列配方配制底物溶液。磷酸鹽-檸檬酸緩沖液1%3'3'5'5'-四甲基聯(lián)苯胺30%雙氧水A.6終止液氫氟酸蒸餾水A.7免疫酶組織化學(xué)底物溶液3,3-二