多底物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

關(guān)于多底物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)把酶六大類反應(yīng)對(duì)應(yīng)于底物的分類如下：

第六章多底物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

底物數(shù) 酶分類 作用類型占酶總數(shù)%1單底物 異構(gòu)酶A==B 52單向單底物裂合酶A==B+C123假單底物水解酶A-B+H2O==A-OH+BH264雙底物氧化還原酶

AH2+B

==A+BH2

27 A2++B3+==A3++B2+

基團(tuán)轉(zhuǎn)移 A+BX==AX+B245三底物連接酶A+B+ATP=AB+ADP+Pi6 A+B+ATP=AB+AMP+Ppi6.1酶促反應(yīng)按底物數(shù)的分類第2頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天單底物反應(yīng)動(dòng)力學(xué)指1,3,2的正向反應(yīng)(約40%) 其余多底物反應(yīng)多為多底物反應(yīng)(約60%)

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6.2多底物反應(yīng)基本命名法 1963年由Cleland建議建立的1)按底物和酶結(jié)合次序?yàn)锳、B、C表示2)按產(chǎn)物在酶上釋放次序?yàn)镻、Q、R表示3)穩(wěn)態(tài)物（包括酶）以E、F、G表示非中心復(fù)合物：指酶活性中心沒有全部被底物占居ENAD+ENADHEAEP第3頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天中心復(fù)合物：

指酶活性中心全部被底物占居命名：（EAB-------------------------EPQ）E:穩(wěn)態(tài)酶， EAB和EPQ:中心過(guò)渡態(tài)中間物

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第4頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天1)有序順序反應(yīng)：

xxxxxxx--------底物、產(chǎn)物規(guī)定： 反應(yīng)歷程

OOOOOOO------酶存在形式

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EAB只能來(lái)自EA，而不是EB，A是一個(gè)領(lǐng)先底物（第一底物），B是隨后底物（第二底物）有其順序性。6.3多底物酶促反應(yīng)的表示方法、命名和舉例第5頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天

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2.異形有序反應(yīng)：

酶的形式有改變，其速度方程不同于上述的速度方程。

A B P QEEA(EAB---FPQ)FQF第6頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天還有其酶促反應(yīng)，中心過(guò)渡態(tài)絡(luò)合物形成很慢，而分解速度很快。被稱為TheorellChance反應(yīng)：即形成中間物的速度極慢而分解速度極快。

A BPQEEAEQE

例子：NAD+

乙醇乙醛NADHE E-NAD+E-NADHEE：為馬肝

醇脫氫酶第六章多底物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)第7頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天

為什么有順序性？ 被認(rèn)為酶上與第二底物結(jié)合位點(diǎn)原先在酶結(jié)構(gòu)內(nèi)部(中間)，第二底物無(wú)法與之結(jié)合。 由于第一底物結(jié)合改變了酶原有結(jié)構(gòu)，暴露了酶結(jié)構(gòu)上第二底物結(jié)合位點(diǎn)，使酶上第二個(gè)結(jié)合位點(diǎn)能夠順利地與B結(jié)合。A,B的結(jié)合是在酶的不同位點(diǎn)上。

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第8頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.隨機(jī)順序反應(yīng)（RandanBiBi）：

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AABABEAB-----EPQPQQPEEE-AE-BE-QE-P例子A第9頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天

第六章多底物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)3.乒乓機(jī)制：特點(diǎn)：1．不形成三元絡(luò)合物，底物不同時(shí)與酶 結(jié)合。2．在全部底物與酶結(jié)合前，已經(jīng)有一種 放出來(lái)。由于底物、產(chǎn)物一進(jìn)一出， 所以像打乒乓一樣，叫乒乓機(jī)制。

A PB QE (EA—EP)F(EB---EQ) E第10頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天谷丙轉(zhuǎn)氨酶的作用：

谷氨酸α-酮戊二酸丙酮酸丙氨酸E(E-谷氨酸-F-α-酮戊二酸)F(F-丙酮酸-F-丙氨酸)E

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7.4多底物動(dòng)力學(xué)機(jī)制判別：因?yàn)槭请p底物反應(yīng)，所以需要加以判別多底物動(dòng)力學(xué)機(jī)制屬哪類機(jī)制，用三種方法。1)底物動(dòng)力學(xué)方法2)產(chǎn)物抑制動(dòng)力學(xué)方法3）同位素交換方法

第11頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天底物動(dòng)力學(xué)方法：有序順序機(jī)制推導(dǎo)法是用圖象法推出。在穩(wěn)態(tài)條件下推出的雙底物反應(yīng)速度公式：

V[A][B]V=KmB[A]+KmA[B]+KiaKmB+[A][B]

是底物A與酶E結(jié)合的解離常數(shù)。

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第12頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天解釋公式中幾個(gè)常數(shù)： 多底物反應(yīng)中，一底物的米氏常數(shù) 可隨著另一底物濃度變化而變化。KmA[B]：指底物[B]濃度達(dá)飽和，底物 A的米氏常數(shù)。在底物B低于飽 和 濃度時(shí)，測(cè)得隨底物[B]而變化的A 的各個(gè)Km，稱為表觀米氏常數(shù)KmKmB[A]:指底物[A]濃度達(dá)飽和，底物 B的米氏常數(shù)。在底物A低于飽和 濃度時(shí)，測(cè)得隨底物[A]而變化的B 的各個(gè)Km，稱為表觀米氏常數(shù)Km

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第13頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天1KmB[A]KmA[B]KiaKmB[A][B]=+++vVm[A][B]Vm[A][B]Vm[A][B]Vm[A][B]

1 KmB

KmAKiaKmB1=+++vVm[B]Vm[A]Vm[A][B]Vm

1KmA11當(dāng)B=∞,= + VVm[A]Vm

1KmB11當(dāng)A=∞,= + VVm[B]Vm

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第14頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天具體實(shí)驗(yàn)方法：

以A、B雙底物反應(yīng)作為例子，可將底物B固定在幾個(gè)不同濃度下。固定在某一B濃度時(shí)，測(cè)不同A濃度對(duì)反應(yīng)速度影響；也可固定A在某一濃度，測(cè)定不同B濃度對(duì)反應(yīng)速度影響，再分別作雙倒數(shù)圖。

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第15頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖：當(dāng)固定幾個(gè)不同的B濃度或者幾個(gè)不同的A濃度時(shí)，作1/[A]---1/v和1/[B]---1/v的關(guān)系圖，得到如下圖。

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第16頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天直線的交點(diǎn)在坐標(biāo)的左側(cè)，這是順序機(jī)制的特點(diǎn)。

且交點(diǎn)可在橫坐標(biāo)的的上方、下方或者線上。

1.

在橫坐標(biāo)上面，表明固定底物B或A與酶結(jié)合 不影響 可變底物A或B的Km，即B或A濃度 大小互不影響各自的Km,說(shuō)明表觀Kmapp= Km,KmA=Kia,KmB=Kib

2.在橫坐標(biāo)下方，表明可變底物A的表觀Km隨 B的增加 而增加，KmA＜Kia，KmB＜Kib3.在橫坐標(biāo)上方，表明可變底物A的表觀Km隨 著B的增加而減少，KmA表明可變底物A的 表觀Km隨著B增加而增加，KmA＞Kia, KmB＞Kib

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第17頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天且交點(diǎn)在1/[A]上截距可計(jì)算出來(lái)。設(shè)有兩個(gè)固定濃度[B]1,[B]2,有兩個(gè)相應(yīng)的1/v1,1/v2,而且在交點(diǎn)處的截距相等

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第18頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天

1KmBKmAKiaKmB1=+++vVm[B]Vm[A]Vm[A][B]Vm

11KmAKiaKmBKmB

=(++1+)v1Vm[A][A][B]1[B]1

11KmAKiaKmBKmB

=(++1+)v2Vm[A][A][B]2[B]2

1/v1=1/v2

Kia/[A][B]1+1/[B]1)=(Kia/[A][B]2+1/[B]2)Kia/A(1/[B]1-1/[B]2)=－(1/[B]1-1/[B]2)1/[A]=-1/Kia

第六章多底物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)第19頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天1/[A]==1/Kia

斜率,截距都可用此法取得。

問(wèn)題：從作圖看出，從直線方程取得的 是復(fù)合未知數(shù)，要用二次作圖法 求出KmA，KmB，Vm。 斜率

斜率=KsAKmB/Vm 截距=KmA/Vm截距=KmA/KmBKsA

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第20頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天

1/V的截距 斜率=KmB/Vm截距=－1/KmB

截距=1/Vm

上面的方法只能判別順序機(jī)制中的有序和快速平衡的隨機(jī)機(jī)制，但是無(wú)法區(qū)分有序和隨機(jī)機(jī)制，只能通過(guò)其他方法來(lái)判別。

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第21頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天乒乓機(jī)制速度方程和動(dòng)力學(xué)常數(shù)：

求解動(dòng)力學(xué)方程用King—Altman圖象法推出。通過(guò)平衡學(xué)說(shuō)推出的方程：

經(jīng)過(guò)雙倒數(shù)后，1 KmA[B]KmB[A][A][B]=++vVm[A][B]Vm[A][B]Vm[A][B]

1KmAKmB1=++ vVm[A]Vm[B]Vm

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第22頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天1KmA11KmB=+(1+ ) y=ax+bvVm[A]Vm[B] 當(dāng)A無(wú)窮大時(shí)變成單底物反應(yīng)的米氏方程。上式一項(xiàng)可去除，與A無(wú)關(guān)，為單底物米氏方程。為y=ax+b的直線方法,其雙倒數(shù)方程：

1KmB11當(dāng)A=∞,=+ VVm[B]Vm當(dāng)B無(wú)窮大時(shí)變成單底物反應(yīng)的米氏方程。上式一項(xiàng)可去除，與B無(wú)關(guān)，為單底物米氏方程。

1KmA11當(dāng)B=∞, =+ VVm[A]Vm

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第23頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天乒乓機(jī)制動(dòng)力學(xué)雙倒數(shù)作圖：用上述雙倒數(shù)作圖法，如能獲得下圖的兩組平行線，即乒乓機(jī)制的特征。

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第24頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天

但有時(shí)當(dāng)直線延長(zhǎng)相當(dāng)距離會(huì)出現(xiàn)相交而不能確定是否乒乓機(jī)制，也可能是順序機(jī)制。 如測(cè)定逆向反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)也同樣獲得兩組平行線，或證實(shí)其半反應(yīng)中有同位素交換即可獲得進(jìn)一步確定。

雙倒數(shù)作圖法產(chǎn)生的復(fù)合函數(shù)，為兩個(gè)未知數(shù)，只能通過(guò)二次作圖，求KmA,KmB,Vm

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第25頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天

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第26頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天

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第27頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天上述方法適用： 順序機(jī)制中有序機(jī)制及快速平衡的隨機(jī)機(jī)制， 但不能區(qū)別順序機(jī)制還是隨機(jī)機(jī)制。 需要進(jìn)一步使用其他方法才能把它們區(qū)別開來(lái)。

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第28頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天產(chǎn)物抑制動(dòng)力學(xué)方法是其中之一。

產(chǎn)物抑制：是鑒別多底物反應(yīng)屬有序、隨機(jī)還是乒乓機(jī)制起重要作用。特點(diǎn)：方法簡(jiǎn)便。 A+B==P+Q，采用幾個(gè)P濃度或不加P，測(cè)每個(gè)P濃度或不加P時(shí)不同[A]（固定B）及不同[B]（固定A）對(duì)反應(yīng)速度的影響，再以Q代替P，重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)。 最后以實(shí)驗(yàn)結(jié)果作雙倒數(shù)圖，不同P時(shí)，1/[A]對(duì)1/v或1/[B]對(duì)1/v，及不同[Q]時(shí)，1/[A]對(duì)1/v或1/[B]]對(duì)1/v作圖?？碢、Q的抑制方式是競(jìng)爭(zhēng)性還是非競(jìng)爭(zhēng)性和反競(jìng)爭(zhēng)性，然后綜合分析來(lái)判別。

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第29頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天Cleland分析大量動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，總結(jié)兩條重要規(guī)則：濃度變化的底物和一種形式的酶結(jié)合，抑制性產(chǎn)物和另一種形式的酶結(jié)合。

雙倒數(shù)作圖,只有縱坐標(biāo)截距變化。2.a)

濃度變化的底物和抑制性產(chǎn)物都結(jié)合在同一個(gè)酶上。雙倒數(shù)作圖則產(chǎn)生斜率變化。

b)濃度變化的底物所結(jié)合的酶形式和抑制性產(chǎn)物結(jié)合的酶形式間可在酶的反應(yīng)歷程中通過(guò)可逆變化而互相聯(lián)接。雙倒數(shù)作圖產(chǎn)生斜率變化。

第六章多底物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

第30頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天Cleland分析大量動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，總結(jié)兩條重要規(guī)則： 應(yīng)用Cleland方法方法的關(guān)鍵：

看產(chǎn)物是否抑制和抑制方式，取決于抑制性產(chǎn)物是P或Q中的哪一個(gè)？如濃度變化的底物是那一個(gè)，A或B？同樣，與另一個(gè)固定濃度的底物是否飽和有關(guān)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果與判斷結(jié)果一致。全部結(jié)果列表于下。

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第31頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天判別乒乓機(jī)制問(wèn)題：A PBQE (EA—EP) F (EB---EQ)EGlu

α-酮戊二酸丙酮酸AlaE(E-Glu-F-α-酮戊二酸)

F(F-丙酮酸-F-Ala)

E

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第32頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天

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第33頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天Cleland判斷有序和隨機(jī)機(jī)制，其反應(yīng)歷程如下：

第六章多底物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

第34頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天

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第35頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天規(guī)律總結(jié)如下：1[A]固定底物，[B]變化底物，[p]=0,[Q]=常數(shù)2[A]固定底物，[B]變化底物，[p]=常數(shù),[Q]=01[B]固定底物，[A]變化底物，[p]=0,[Q]=常數(shù)2[B]固定底物,[A]變化底物，[p]=常數(shù),[Q]=0

第六章多底物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

第36頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.同位素交換法下面簡(jiǎn)單闡述同位素交換法在研究多底物動(dòng)力學(xué)上的應(yīng)用。先舉一個(gè)例子：

蔗糖磷酸化酶葡萄糖-1-P+果糖=======蔗糖+H3PO4這個(gè)反應(yīng)是可逆反應(yīng)。在沒有果糖時(shí)，G-1-P可以與32P標(biāo)記的KH232PO4發(fā)生交換，表明有下面的反應(yīng)：

Suc磷酸化酶G-1-P+32Pi========G-1-32P+Pi研究認(rèn)為，這種現(xiàn)象是蔗糖磷酸化酶的乒乓機(jī)制造成,轉(zhuǎn)移葡萄糖基。

第六章多底物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

第37頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天

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第38頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天反應(yīng)1沒有果糖，加入G-1-32P，產(chǎn)生32P反應(yīng)2如果有EG存在，沒有G-1-P，可以通過(guò)2方式的Fru發(fā)生交換。下面是一個(gè)通式：

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第39頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天當(dāng)一個(gè)底物不存在，另一個(gè)底物可與其相應(yīng)產(chǎn)物發(fā)生同位素交換，這是乒乓機(jī)制的特點(diǎn)。

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標(biāo)記的被轉(zhuǎn)移的基團(tuán)G外，Y或者Gy不存在，標(biāo)記的X和GX一樣可以發(fā)生同位素交換；當(dāng)沒有X或者GX時(shí)，標(biāo)記的Y和GY也可以發(fā)生同位素交換。

也可區(qū)分有序和隨機(jī)機(jī)制

同位素交換對(duì)于順序

機(jī)制來(lái)說(shuō)，必須兩個(gè)底物都結(jié)合到酶的中心復(fù)合物上。所以一個(gè)底物不存在，另一個(gè)底物就不可能和產(chǎn)物發(fā)生同位素交換。這就是與乒乓機(jī)制不同的地方。且可區(qū)分有序和隨機(jī)機(jī)制第40頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天方法：在酶促反應(yīng)達(dá)到化學(xué)平衡情況下，加入不足以改變平衡的極少量放射性底物，由于化學(xué)平衡是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，雖然底物的濃度、產(chǎn)物的濃度保持恒定，但是加入的標(biāo)記底物必定有變?yōu)楫a(chǎn)物的可能性。加入標(biāo)記物

測(cè)混合物中標(biāo)記產(chǎn)物放射性強(qiáng)度,算出同位素交換速度keq=kf/kr=[P][Q]/[A][B]

再測(cè)定不同非標(biāo)記底物濃度對(duì)交換速度的影響

看高濃度的非標(biāo)記底物能否抑制標(biāo)記底物的同位素交換。

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第41頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天可以看出是否是有序還是隨機(jī)機(jī)制#為保持兩者比值恒定，改變?nèi)魏我粋€(gè)非標(biāo)記底物的同時(shí)，也要改變另一個(gè)非標(biāo)記底物的濃度。

Kf[P][Q]Keq==Kr[A][B]

正方向v=Kf[A][B]，反方向v=Kr[P][Q]在有序機(jī)制中，一個(gè)基團(tuán)轉(zhuǎn)移的有序雙雙反應(yīng)，其底物與酶的結(jié)合和產(chǎn)物放出有四種可能性。

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第42頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天

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有序機(jī)制：四種可能可以寫成如下第43頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天 如標(biāo)記在X上，形成X*或者GX*，可引起X*和GX或GX*和X的同位素交換，用GX*==X*來(lái)表示。

如標(biāo)記在Y上，可有Y*==GY*的交換，標(biāo)在G上，可有G*X和GY*的交換。所以有內(nèi)內(nèi)、外外、內(nèi)外三種途徑

GXYE====EGX====(EGXY===EXGY)===E

GYX如標(biāo)記在X*--GX*，Y*--GY*，*G-- GX(*GY)

第六章多底物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

第44頁(yè),共50頁(yè)，2024年2月25日，星期天舉一個(gè)有序機(jī)制例子。

如以乳酸、丙酮酸為濃度變化而比值恒定的非標(biāo)記底物對(duì)（內(nèi)-內(nèi)）， 測(cè)定這一對(duì)不同濃度的內(nèi)底物對(duì)外底物對(duì)（NAD+--------NADH）間發(fā)生的同