一種用于尿酸誘導目的蛋白表達的dna片段及相關啟動子與應用的制作方法

一種用于尿酸誘導目的蛋白表達的dna片段及相關啟動子與應用的制作方法一種用于尿酸誘導目的蛋白表達的dna片段及相關啟動子與應用的制作方法本發(fā)明公開了一種用于尿酸誘導目的蛋白表達的DNA片段及相關啟動子與應用。本發(fā)明提供了一種DNA分子，其核酸序列為序列表中序列1自5’末端第143-200位核苷酸。含有上述DNA分子的DNA片段也是本發(fā)明保護的范圍。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明通過改造大腸桿菌lac啟動子-35區(qū)和-10區(qū)，得到一個新的啟動子，該啟動子可在尿酸調控蛋白HucR和尿酸轉運蛋白YgfU的配合下，利用尿酸誘導目的蛋白的表達。因此本發(fā)明的啟動子及相關表達系統可用來在尿酸的誘導下進行目的蛋白表達，也可用于生物型尿酸檢測系統。【專利說明】一種用于尿酸誘導目的蛋白表達的DNA片段及相關啟動子與應用【技術領域】[0001]本發(fā)明涉及生物【技術領域】，尤其涉及一種用于尿酸誘導目的蛋白表達的DNA片段及相關啟動子與應用?！颈尘凹夹g】[0002]重組蛋白表達系統是現代生物技術的重要研究內容，已在食品、制藥、洗滌劑生產等領域廣泛應用。其中，細菌異源表達系統具有細菌生長代時短、菌體生長密度高、底物廉價、遺傳背景清楚、適合進行工程菌株改造等顯著優(yōu)勢，尤其是大腸桿菌表達系統，已成為應用最為廣泛的表達系統之一。[0003]異源蛋白的重組表達，通常要求通過分子克隆等技術將目標蛋白編碼序列置于具有較強轉錄能力啟動子之后。目前，已有多種大腸桿菌適用的啟動子被研究報道。其中直接或間接受異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷調控的lac、tac、trc、T7啟動子，受四環(huán)素調控的tet啟動子，受阿拉伯糖調控的阿拉伯糖啟動子(P_)，受鼠李糖調控的rhaPbad等已被應用，成功表達了多種不同類型的異源重組蛋白。[0004]大腸桿菌的乳糖操縱子已被深入研究。乳糖啟動子Iac本身轉錄能力較弱，不適用于重組蛋白的大量表達。但許多啟動子的構建，都是在乳糖操縱系統的功能元件上改造而成。例如，經典的tac啟動子和trc啟動子均由色氨酸啟動子的-35區(qū)和Iac啟動子的-10區(qū)組合拼接而成，較之Iac啟動子具有更高的表達效率。而T7啟動子則利用異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷來調控T7RNA聚合酶的表達，進而開啟Τ7啟動子系統表達下游重組蛋白；這一技術已被Novagen等公司研發(fā)出系列商業(yè)化載體，成功表達了多種不同來源的異源蛋白。[0005]總結一下，一套成功的重組蛋白表達系統，首先要求啟動子的相關元件能被宿主菌識別。而要成功表達異源重組蛋白，不僅要求啟動子具有較高的轉錄效率，還要求啟動子滲漏性表達水平較低，尤其是一些對宿主細胞具有一定毒性的蛋白。最后，從降低生產成本考慮，誘導物本身價格應較為低廉，來源廣泛，且不被宿主菌本身代謝系統所降解利用。[0006]具強耐福射特性的極端微生物耐福射球菌(Deinococcusrad1durans)的基因組分析揭示了該菌抗逆特性相關的部分功能組件。其中，編碼區(qū)drll59編碼的推測尿酸酶調控蛋白(hypotheticaluricaseregulator,HucR)的研究顯不，HucR可形成蛋白二聚體結合于其自身編碼序列和反向的尿酸酶編碼序列的啟動子區(qū)域(hucO)中的DNA結合位點序列；但與尿酸結合后，HucR蛋白結構發(fā)生變化，從DNA結合位點解離；因此，HucR調控系統成為耐輻射球菌根據環(huán)境尿酸情況變化，有效調控HucR蛋白本身及尿酸降解相關的尿酸酶表達的系統。因為尿酸是一種價格較低廉的化合物，并且不為大腸桿菌所代謝利用，此研究結果預示著可對此啟動子加以改造，構建以尿酸為誘導物的大腸桿菌重組蛋白表達系統?！景l(fā)明內容】[0007]本發(fā)明的一個目的是提供一種DNA分子。[0008]本發(fā)明提供的DNA分子，其核酸序列為序列表中序列I自5’末端第143-200位核苷酸。[0009]上述DNA分子作為啟動子中的應用也是本發(fā)明保護的范圍。[0010]含有上述DNA分子的DNA片段也是本發(fā)明保護的范圍。[0011]上述DNA片段由DNA片段1、目的蛋白基因和含有上述DNA分子的DNA片段2組成；[0012]所述DNA片段I為含有驅動HucR編碼基因和YgfU編碼基因表達的啟動子CP6、HucR編碼基因、YgfU編碼基因的片段；[0013]上述DNA分子用于驅動所述目的蛋白基因表達。[0014]上述HucR編碼基因和YgfU編碼基因的轉錄方向與目的蛋白基因的轉錄方向相反。[0015]在上述DNA片段中，所述驅動HucR編碼基因和YgfU編碼基因表達的啟動子CP6的編碼序列為序列I自5’末端第3244-3303核苷酸的反向互補序列；[0016]所述HucR編碼基因的編碼序列為序列I自5’末端第2662-3224核苷酸的反向互補序列；[0017]所述YgfU編碼基因的編碼序列為序列I自5’末端第1197-2645位核苷酸的反向互補序列；[0018]所述DNA片段I具體為序列表中序列I自5’末端958-3303位核苷酸的所示的雙鏈DNA分子；[0019]所述DNA片段2具體為序列表中序列I自5’末端143-279位核苷酸所示的雙鏈DNA分子。[0020]上述DNA片段中，所述目的蛋白基因為紅色熒光蛋白基因，所述紅色熒光蛋白基因的編碼序列為序列表中序列I自5’末端280-957位核苷酸；[0021]所述DNA片段為序列I自5’末端第143-3303核苷酸所示的雙鏈DNA分子。[0022]含有上述的DNA分子或含有上述DNA片段的重組載體、轉基因細胞系或重組菌也是本發(fā)明保護的范圍。[0023]上述重組載體的核苷酸序列為序列表中的序列I;[0024]上述重組菌為將所述重組載體轉入宿主菌中得到的重組菌。在本發(fā)明的實施例中，上述宿主菌具體為大腸桿菌DH10B。[0025]上述的DNA分子或上述DNA片段或上述重組載體、轉基因細胞系或重組菌在尿酸誘導目的蛋白的表達中的應用。[0026]本發(fā)明的另一個目的是提供一種尿酸誘導目的蛋白的表達的方法。[0027]本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟:將目的蛋白的編碼基因通過上述重組載體導入宿主菌中，得到重組菌；再在含有尿酸的培養(yǎng)基中發(fā)酵上述的重組菌，實現尿酸誘導目的蛋白。[0028]上述的DNA分子或上述DNA片段或上述的重組載體、轉基因細胞系或重組菌在利用目的蛋白表達水平監(jiān)測尿酸濃度中的應用也是本發(fā)明保護的范圍。[0029]本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明通過改造大腸桿菌Iac啟動子-35區(qū)和-10區(qū)，得到一個新的啟動子，該啟動子可在尿酸調控蛋白HucR和尿酸轉運蛋白YgfU的配合下,利用尿酸誘導目的蛋白的表達。因此本發(fā)明的啟動子及相關表達系統可用來在尿酸的誘導下進行目的蛋白表達。本發(fā)明也可用于尿酸生物型檢測系統。【專利附圖】【附圖說明】[0030]圖1為SHY質粒的結構示意圖[0031]圖2為尿酸誘導系統誘導曲線【具體實施方式】[0032]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。[0033]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。[0034]實施例1、啟動子A及用于尿酸誘導的DNA片段的獲得[0035]下述實施例中的序列I所示的DNA為質粒SHY,序列2所示的DNA為對照質粒HY,SHY質粒的核苷酸序列序列I與對照質粒HY核苷酸序列序列2的唯一區(qū)別僅在于將序列2的自5’末端第143-200位核苷酸的Iac啟動子替換為序列表中序列I的自5’末端第143-200位核苷酸所示的啟動子A。[0036]上述質粒具體構建方法如下:[0037]1、尿酸調控蛋白HucR及其編碼基因的獲得[0038]提取耐福射球菌(Deinococcusrad1durans)(ATCC13939)的基因組DNA并以其為模板，以5，-gcacatatgatgagcgcgcgcatggataac-3>(forward)和5，-agagagctcttaaacaccctgttcgaggc-3’(reverse)為引物進行PCR擴增。PCR擴增條件如下:先95°C預變性4min，然后95°C45s,55°C30s,72°C30s，共30個循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。[0039]回收上述PCR反應產物，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得543bp的條帶(經過測序，其編碼序列為序列表中序列I或2自5’末端第2662-3224核苷酸的反向互補序列)。[0040]將上述獲得543bp的PCR產物用NdeI和SacI雙酶切，酶切產物與經相同酶切的331Ibp的DsRed載體(Clontech公司，產品編號632412)載體骨架用T4連接酶(購自寶生物公司)16°C連接過夜，連接產物轉化入大腸桿菌MC1061感受態(tài)細胞，獲得重組菌。[0041]提取重組菌的質粒，該質粒為將序列表中序列I或2自5’末端第2662-3224核苷酸的反向互補序列所示的調控蛋白HucR基因插入DsRed載體(已有組成型啟動子CP6,在該啟動子后插入調控蛋白HucR基因)的NdeI和SacI酶切位點間得到的載體，測序驗證無誤，命名為SH質粒，該質粒包括驅動HucR編碼基因表達的啟動子CP6(其編碼序列為序列I或2自5’末端第3244-3303核苷酸的反向互補序列)、HucR編碼基因(其編碼序列為序列I或2自5’末端第2662-3224核苷酸的反向互補序列)。[0042]序列表中序列I自5’末端第2662-3224核苷酸的反向互補序列所示片段為尿酸調控蛋白HucR的編碼基因，編碼的尿酸調控蛋白HucR的氣基酸序列為序列表中序列3。[0043]2、尿酸轉運蛋白YgfU及其編碼基因和對照質粒HY的獲得[0044]提取大腸桿菌MC1061(Casadaban,MJ&Cohen,SN(1980)AnalysisofgenecontrolsignalsbyDNAfus1nandcloninginEscherichiacol1.J.Mol.B1l.138179-207;公眾可從中國科學院微生物研究所獲得)的基因組DNA并以其為模板，以5’_ttcgagctcaacaccctgttcgaggcccgc_3，(forward)#口5，_gctgaagaaaaatgagcatggagaataagctagccca-3’(reverse)為引物進行PCR擴增。PCR擴增條件如下:先95°C預變性4min，然后95°C45s,55°C30s,72°Clmin30s，共30個循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。[0045]回收上述PCR反應產物，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得1449bp的條帶(為序列表中序列I自5’末端第1197-2645位核苷酸的反向互補序列所示的轉運蛋白YgfU編碼基因)。[0046]將上述獲得的1449bp大小的PCR產物用NheI和SacI雙酶切，酶切產物與經相同酶切的3941bp的SH載體骨架用T4連接酶(購自寶生物公司)16°C連接過夜，連接產物轉化入大腸桿菌MC1061感受態(tài)細胞，獲得重組菌。[0047]提取重組菌的質粒，該質粒為將序列表中序列I自5’末端第1197-2645位核苷酸的反向互補序列所示的轉運蛋白YgfU編碼基因插入SH載體的SacI酶和NheI切位點間得到的載體，測序驗證無誤，命名為HY質粒(ygfU基因緊跟hucR基因，也利用CP6啟動子進行表達。[0048]HY質粒包括對照DNA片段，對照DNA片段包括驅動HucR編碼基因和YgfU編碼基因表達的啟動子CP6(其編碼序列為序列I或2自5’末端第3244-3303核苷酸的反向互補序列)、HucR編碼基因(其編碼序列為序列I或2自5’末端第2662-3224核苷酸的反向互補序列)、YgfU編碼基因(其編碼序列為序列I或2自5’末端第1197-2645位核苷酸的反向互補序列)、紅色熒光蛋白RFP基因(其編碼序列為序列表中序列I或2自5’末端第280-957)、驅動紅色熒光蛋白RFP基因表達的乳糖啟動子Iac(其編碼序列為序列2自5’末端第143-200位核苷酸)。[0049]對照DNA片段由含有驅動HucR編碼基因和YgfU編碼基因表達的啟動子CP6、HucR編碼基因、YgfU編碼基因的DNA片段1、紅色熒光蛋白RFP基因和含有驅動紅色熒光蛋白RFP基因表達的乳糖啟動子Iac的DNA片段2組成；其中，DNA片段I為序列表中序列2自5’末端958-3303位核苷酸的所示的雙鏈DNA分子，紅色熒光蛋白RFP基因編碼序列為序列表中序列I或2自5’末端第280-957，DNA片段2為序列表中序列2自5’末端143-279位核苷酸所示的雙鏈DNA分子。[0050]HY質粒的核苷酸序列為序列表中的序列2，其中對照DNA片段為序列表中序列2自5’末端第143-3303核苷酸所示的雙鏈DNA分子。[0051]序列表中序列I或2自5’末端第1197-2645位核苷酸的反向互補序列所示的片段為尿酸轉運蛋白YgfU的編碼基因，編碼的尿酸轉運蛋白YgfU的氨基酸序列為序列表中序列4。[0052]3、驅動目的基因(紅色熒光蛋白基因)表達的啟動子A、用于尿酸誘導的DNA片段及重組載體SHY的獲得[0053]耐輻射球菌基因組中，尿酸調控蛋白HucR在hucO中的DNA結合序列已被實驗證實。為了改造HY質粒中的啟動子Iac的-35區(qū)和_10區(qū)，在設計如下引物時加入新的片段，得到新的啟動子。[0054]I^l5，-atctaagtatat￡ttgtgtggaaccgatttaataaaacaa-3>(forward)#口5，—gtctacctatgtaaagcctggggtgcctaatg-3’(reverse)為引物、上述2得到的HY質粒為模板進行PCR擴增，將HY質粒線性化。PCR擴增條件如下:先95°C預變性4min，然后95°C45s,55°C30s,72°C6min，共30個循環(huán)；最后72°C延伸1min00[0055]回收上述PCR反應產物，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得5404bp的條帶。[0056]將上述5404bp線性化質粒片段用T4連接酶(購自寶生物公司)16°C連接過夜，連接產物轉化入大腸桿菌MC1061感受態(tài)細胞，獲得重組菌。[0057]提取重組菌的質粒，該質粒的核苷酸序列為序列表中的序列1，命名為SHY質粒，為重組載體(其結構示意圖如圖1所示，其中受尿酸調控的啟動子為驅動目的蛋白基因表達的啟動子A)。[0058]SHY質粒中的含有用于尿酸誘導的DNA片段，用于尿酸誘導的DNA片段包括驅動HucR編碼基因和YgfU編碼基因表達的啟動子CP6(其編碼序列為序列I或2自5’末端第3244-3303核苷酸的反向互補序列)、HucR編碼基因(其編碼序列為序列I或2自5’末端第2662-3224核苷酸的反向互補序列)、YgfU編碼基因(其編碼序列為序列I或2自5’末端第1197-2645位核苷酸的反向互補序列)、紅色熒光RFP蛋白基因(其編碼序列為序列表中序列I或2自5’末端第280-957)、驅動紅色熒光蛋白RFP基因表達的啟動子A(其編碼序列為序列I自5’末端第143-200位核苷酸)。[0059]用于尿酸誘導的DNA片段由含有驅動HucR編碼基因和YgfU編碼基因表達的啟動子CP6、HucR編碼基因、YgfU編碼基因的DNA片段1、紅色熒光蛋白RFP基因和含有驅動紅色熒光蛋白RFP基因表達的啟動子A的DNA片段2組成；其中，DNA片段I為序列表中序列I自5’末端958-3303位核苷酸的所示的雙鏈DNA分子，紅色熒光蛋白RFP基因編碼序列為序列表中序列I或2自5’末端第280-957，DNA片段2為序列表中序列I自5’末端143-279位核苷酸所示的雙鏈DNA分子。[0060]用于尿酸誘導的DNA片段的核苷酸序列為序列表中的序列I自5’末端第143-3303核苷酸所示的雙鏈DNA分子(即包括改造后受尿酸調控啟動子、報告基因、受組成型啟動子調控表達的調控蛋白HucR和轉運蛋白YgfU)。[0061]SHY質粒的核苷酸序列序列I與對照質粒HY核苷酸序列序列2的唯一區(qū)別僅在于將序列2的自5’末端第143-200位核苷酸所示的啟動子Iac替換為序列表中序列I的自5’末端第143-200位核苷酸所示的啟動子A。[0062]實施例2、啟動子A及用于尿酸誘導的DNA片段的在尿酸誘導目的基因表達中的應用[0063]將由實施例1得到的重組載體SHY和對照質粒HY分別轉入大腸桿菌DHlOB中，得到含有SHY的重組菌DH10B/SHY和含有HY的重組菌DH10B/HY(分別提取質粒測序驗證正確)。[0064]挑取重組菌DH10B/SHY和重組菌DH10B/HY的單菌落，在加入氨芐抗生素抗性的LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L，NaCl10g/L,酵母提取物5g/L，添加抗生素氨芐霉素至100μg/mL)37°C搖床培養(yǎng)過夜(12h)至菌濃度達到飽和(0D600為3.5)，得到種子液；[0065]將種子液按照接種量1%接入不同濃度的尿酸培養(yǎng)基中誘導12h，培養(yǎng)條件為37°C搖床(250rpm)。至誘導時間結束,取出培養(yǎng)物,離心收集菌體棄上清液(3000g,lOmin);再以磷酸緩沖液(lOOmM，pH6.0)重懸菌體，吸取200μL菌體以酶標儀測試菌濃度0D_及紅色熒光蛋白讀數。[0066]上述不同濃度的尿酸培養(yǎng)基按照如下方法制備:將胰蛋白胨、NaCl、酵母提取物、氨芐霉素、尿酸與PH7.0、濃度為500mM的3-嗎啉丙磺酸(MOPS)緩沖液母液和水混合，其中胰蛋白胨的終濃度為10g/L、NaCl的終濃度為10g/L、酵母提取物的終濃度為5g/L、氨芐霉素的終濃度為100μg/mL、3-嗎啉丙磺酸(MOPS)緩沖液的終濃度為17mM，不同濃度的尿酸培養(yǎng)基中的尿酸終濃度分別為0mM、0.002mM、0.005mM、0.006mM、0.008mM、0.01mM、0.015mM、0.02mM,0.03mM,0.04mM和(λ05mM。[0067]重組菌DH10B/SHY的誘導結果如圖2所示，縱坐標為報告基因紅色熒光蛋白誘導倍數(為尿酸誘導報告基因紅色熒光蛋白讀數/不經尿酸誘導報告基因紅色熒光蛋白讀數的比值)；可以看出，在尿酸終濃度為0mM、0.002mM、0.005mM、0.006mM、0.008mM、0.01mM,0.015mM、0.02mM、0.03mM、0.04mM和0.05mM中的培養(yǎng)基中，重組菌DH10B/SHY生長并誘導表達蛋白后，報告基因紅色熒光蛋白讀數分別為168、1539、7506、15726、20247、27946、40416、52698、62883、70139、72818;尿酸誘導報告基因紅色熒光蛋白讀數/不經尿酸誘導報告基因紅色熒光蛋白讀數的比值分別為1、9.16,44.67,93.61,120.51,166.34,240.57,313.67、374.30,417.49,433.44倍。測試結果顯示，隨著尿酸濃度增加，報告基因紅色熒光蛋白讀數增加。說明啟動子A、含有啟動子A的用于尿酸誘導的DNA片段、SHY載體可以在尿酸的誘導下使目的蛋白紅色熒光蛋白表達。[0068]重組菌DH10B/HY的誘導結果如下:在尿酸終濃度為0mM、0.002mM、0.005mM、0.006mM、0.008mM、0.01mM、0.015mM、0.02mM、0.03mM、0.04mM和0.05mM中的培養(yǎng)基中，重組菌DH10B/HY生長并誘導表達蛋白后，報告基因紅色熒光蛋白讀數基本均為80-160;不經尿酸誘導(OmM)報告基因紅色熒光蛋白讀數為153;因此可以看出，尿酸誘導報告基因紅色熒光蛋白讀數/不經尿酸誘導報告基因紅色熒光蛋白讀數的比值基本在I以內，即不被尿酸誘導。[0069]重組菌DH10B/SHY的誘導結果顯示，當尿酸濃度低于0.01mM時，尿酸誘導報告基因紅色熒光蛋白誘導倍數與尿酸濃度呈線性關系，公式為y=11946x-ll.77(其中y為紅色熒光蛋白誘導倍數，X為尿酸濃度，此標準曲線標準誤差平方可達0.97，線性化良好)。因此，可以采用本發(fā)明的載體、啟動子或片段用于外界尿酸濃度監(jiān)測。[0070]上述結果可以看出，與對照質粒HY相比，SHY質?？梢愿玫卦谀蛩嵴T導下表達目的蛋白，且SHY質粒和對照質粒HY唯一的區(qū)別僅在于啟動子的不同，說明SHY質粒的啟動子A具有更好地在尿酸誘導下表達目的蛋白的功能?！緳嗬蟆?.一種DNA分子，其核酸序列為序列表中序列I自